ИНДОЛИЛМАЛЕИМИДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ НАРУШЕНИЙ ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОПОСРЕДОВАННЫХ Т-ЛИМФОЦИТАМИ И/ИЛИ ПКС Российский патент 2008 года по МПК C07D403/04 C07D403/14 C07D401/14 A61K31/404 A61K31/4709 A61K31/4725 A61P29/00 A61P7/00 

Настоящее изобретение относится к индолилмалеимидным производным, способу их получения и содержащим их фармацевтическим композициям.

В частности, в настоящем изобретении представлено соединение формулы I

в которой

R_a обозначает Н, СН₃, СН₂-СН₃ или изопропил,

R_b обозначает Н, галоген, С_1-6алкокосигруппу или С_1-6алкил и либо

I. R представляет собой радикал формулы (а)

в которой

R₁ обозначает пиперазин-1-ил, необязательно замещенный СН₃ в положении 3 или 4, или 4,7-диаза-спиро[2,5]окт-7-ил,

R₂ обозначает Cl, Br, CF₃ или СН₃, и

R₃ обозначает Н, СН₃ или CF₃; R₂ отлично от СН₃ или Cl, когда R₃ обозначает Н,

R_a обозначает Н или СН₃, R_b обозначает Н, и R₁ обозначает 4-метил-1-пиперазинил; либо

II. R_a обозначает радикал формулы (б)

в которой

R₄ обозначает 1-пиперазинил, замещенный СН₃ в положениях 3 и/или 4, или

4,7-диаза-спиро[2,5]окт-7-ил, R_a отлично от Н или СН₃, когда R₄ обозначает 4-метил-1-пиперазинил; либо

III. R обозначает остаток формулы (в)

в которой

R₁₄ обозначает 1-пиперазинил, необязательно замещенный СН₃ в положении 3 и/или 4 или в положении 3 этилом, фенил-С_1-4-алкилом, С_1-4алкокси-С_1-4алкилом или галоген-С_1-4алкилом; или 4,7-диаза-спиро[2,5]окт-7-ил,

R₁₅ обозначает галоген, CF₃ или СН₃, R₁₅ отлично от СН₃, когда R₁₆ обозначает СН₃, R_a обозначает Н или СН₃, R_b обозначает Н, и R₁₄ обозначает 4-метил-1-пиперазинил, и

R₁₆ обозначает Н, СН₃, СН₂-СН₃ или CF₃, R₁₆ отлично от Н, когда R₁₅

обозначает Cl, R_a обозначает Н или СН₃, R_b обозначает Н, и R₁₄ обозначает 4-метил-1-пиперазинил, либо

IV. R представляет собой радикал формулы (г)

в которой R₈ обозначает 1-пиперазинил, 3-метил-пиперазин-1-ил или 4-бензил-пиперазин-1-ил, либо

V. R представляет собой радикал формулы (д)

в которой R₉ обозначает 4,7-диаза-спиро[2,5]окт-7-ил или пиперазин-1-ил, замещенный в положении 3 метилом или этилом и необязательно метилом в положении 4.

Соединения формулы I могут существовать в свободной форме или в форме солей, например аддитивных солей, образованных, например, с органическими или неорганическими кислотами, например хлористо-водородной кислотой, уксусной кислотой, трифторуксусной кислотой.

Следует принять во внимание, что соединения формулы I могут существовать в форме оптических изомеров, рацематов или диастереомеров. Например, атом углерода цикла, несущий заместитель в положении 3 остатка пиперазинила, является асимметричным и может иметь R- или S-конфигурации. Следует иметь в виду, что настоящее изобретение охватывает все энантиомеры и их смеси. Энантиомеры являются более предпочтительными, чем рацематы. Как отмечено выше, аналогичные соображения относятся к исходным материалам, имеющим асимметричные атомы углерода. Алкил или алкоксигруппа могут быть неразветвленными или разветвленными. Фенил-С_1-4алкил предпочтительно представляет собой бензил или фенетил. В С_1-4алкокси-С_1-4алкиле часть алкоксигруппы предпочтительно представляет собой метокси- или этоксигруппу, и алкильная часть предпочтительно представляет собой метил или этил, подходящим примером является, например, 2-метоксиэтил. Галоген может представлять собой F, Cl, Br или I, предпочтительно F, Cl или Br. Галоген-С_1-4алкил представляет собой алкил, в котором один или более атомов Н замещены галогеном, например Cl или F, например CH₂Cl, CH₂F или CF₃.

R предпочтительно обозначает радикал формулы (а), (в) или (г), предпочтительно (д).

В радикале формулы (а) или (в), R₂ или R₁₅ предпочтительно находятся в пара-положении относительно R₁ или R₁₄ соответственно. R₃ находится предпочтительно в мета-положении относительно R₁. В радикале или формуле (г) R₉ предпочтительно обозначает 4,7-диаза-спиро[2,5]окт-7-ил; когда R₉ представляет собой пиперазинил, замещенный в положении 3, он имеет R- или S-конфигурацию.

Настоящее изобретение включает также способ получения соединения формулы I, который включает реакцию соединения формулы II

в котором R_a и R_b такие, как определено выше, с соединением формулы III

в котором R такое, как определено выше,

и, если требуется, превращение конечного соединения формулы I, полученного в свободной форме, в солевую форму или наоборот, по необходимости.

Способ можно подходящим образом осуществить в присутствии сильного основания, например трет-BuOK, например, как описано в Международной заявке WO 02/38561, содержание которой включено в данном контексте в виде ссылки, и как показано в Примерах.

Соединения формул II и III могут быть получены в соответствии с известными способами, например, как описано в Международной заявке WO 02/38561, содержание которой включено в данном контексте в виде ссылки, и как показано в Примерах.

В том случае, если получение исходных продуктов подробно не описано, соединения являются известными или могут быть получены аналогично методам, известным в области техники или как описано далее.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение без каких-либо ограничений.

КТ = комнатная температура

ТГФ = тетрагидрофуран

УКХ = ускоренная колоночная хроматография

ФТБ = фторид тетрабутиламмония

BINAP = 2,2'-бис(дифенилфосфин)-1,1'-бинафтил

Pd₂(dba)₃ = Pd(0)-бис(дибензилиденацетон)

Пример 1: 3-[2-Хлор-3-метил-5-(4-метил-пиперазин-1-ил)-фенил]-4-(1Н-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион

2-[2-Хлор-3-метил-5-(4-метил-пиперазин-1-ил)-фенил]-ацетамид (211 мг, 0,75 ммоль) и 3-индолглиоксилат (270 мг, 1,35 ммоль) растворяют в ТГФ (5 мл). Добавляют раствор 1,0 М трет-BuOK в ТГФ (2,98 мл, 4 экв.) и перемешивают смесь при температуре 35°С в течение ночи. Реакцию разводят AcOEt (20 мл) и промывают Н₂О (20 мл) и соляным раствором (10 мл). Органическую фазу сушат над Na₂SO₄ и выпаривают растворитель. Остаток очищают с помощью УКХ (AcOEt/AcOH/H₂O 7:1:1), что дает титульное соединение в форме соли уксусной кислоты. Данные ¹H ЯМР-спектроскопии (ДМСО, 400 МГц) δ 2,16 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 2,32-2,38 (m, 4Н), 2,97-3,10 (m, 4H), 6,61 (d, J=8,0 Гц, 1Н), 6,71-6,77 (m, 2Н), 7,04 (d, J=2,8 Гц, 1Н), 7,08 (dd, J=7,4, 7,2 Гц, 1H), 7,41 (d, J=8,2 Гц, 1Н), 7,98 (d, J=1,5 Гц, 1H), 11,05 (br s, 1H), 11,90 (br s, 1H); ES-MS: 435 [M+H]⁺.

2-[2-Хлор-3-метил-5-(4-метил-пиперазин-1-ил)-фенил]-ацетамид,

используемый как исходный материал, может быть получен следующим образом:

метиловый эфир (5-бром-2-хлор-3-метил-фенил)-уксусной кислоты (2,0 г, 7,2 ммоль), N-метилпиперазин (960 мкл, 8,6 ммоль) и Cs₂СО₃ (3,3 г, 10,1 ммоль) суспендируют в толуоле (80 мл). Добавляют Pd(OAc)₂ (81 мг, 0,36 ммоль) и BINAP (224 мг, 0,36 ммоль) и перемешивают реакцию при температуре 100°С в течение ночи. Смесь фильтруют через целит и выпаривают растворитель. Остаток очищают с помощью УКХ (AcOEt/AcOH/H₂O 60:15:15), что дает метиловый эфир 2-[2-хлор-3-метил-5-(4-метил-пиперазин-1-ил)-фенил]-уксусной кислоты. Данный эфир суспендируют в 25% NH₄OH (60 мл). Смесь перемешивают в течение ночи при КТ, и отфильтровывают осадок, получая амид. Данные ¹H ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 2,20 (s, 3Н), 2,27 (s, 3Н), 2,40-2,45 (m, 4Н), 3,07-3,13 (m, 4H), 3,48 (s, 2Н), 6,78 (s, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,91 (brs, 1H), 7,34 (br s, 1H).

CuCl₂ (8,0 г, 0,06 моль) и трет-бутилнитрил (8,9 мл, 0,074 моль) суспендируют в ацетонитриле (60 мл). 1,1-дихлорэтилен добавляют по каплям при температуре 20°С. Добавляют 5-бром-2-хлор-3-метил-фениламин (11,0 г, 0,05 моль), растворенный в ацетонитриле (60 мл), и перемешивают реакцию при КТ в течение 3 ч. Смесь выливают в водную 20% HCl (150 мл) и экстрагируют водную фазу с использованием CH₂Cl₂ (2×150 мл). Органическую фазу сушат над Na₂SO₄ и выпаривают растворитель. Остаток очищают с помощью УКХ (гексан/СН₂Cl₂ 9:1), что дает 5-бром-2-хлор-1-метил-3-(2,2,2-трихлор-этил)-бензол. Промежуточный продукт перерастворяют в МеОН (80 мл) и нагревают до температуры 70°С. Раствор 5,4 M NaOMe в МеОН (28,4 мл) добавляют по каплям и перемешивают реакцию при температуре 70°С в течение 3 ч. Реакцию охлаждают до КТ и добавляют концентрированную H₂SO₄ (10 мл). Реакцию перемешивают при нагревании с обратным холодильником в течение 1 ч. Смесь разводят H₂O (200 мл) и экстрагируют СН₂Cl₂ (2×200 мл). Объединенные органические фазы сушат над Na₂SO₄ и выпаривают растворитель. Остаток очищают помощью УКХ (гексан/СН₂Cl₂ 9:1-1:1), что приводит к получению метилового эфира (5-бром-2-хлор-3-метил-фенил)-уксусной кислоты. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (CDCl₃, 400 МГц) δ 2,26 (s, 3Н), 3,61 (s, 3Н), 3,63 (s, 2Н), 7,15 (s, 1H), 7,21 (s, 1H).

Согласно процедуре, представленной в Примере 1, но при использовании соответствующих исходных материалов можно получить соединения формулы I, в которых R представляет собой остаток формулы (а), как указано в Таблице 1 ниже.

Таблица 1ПримерR₁R₂R₃R_aR_bДанные масс-спектрометрии2-(4-метил-пиперазин-1-ил)2-СНз3-СН₃СН₃НМН⁺ 4293-(4-метил-пиперазин-1-ил)2-СН₃3-СН₃ННMH⁺ 4154-(4-метил-пиперазин-1-ил)2-Cl3-СН₃СН₃НМН⁺ 42151-пиперазинил2-Cl3-СН₃ННMH⁺ 43561-пиперазинил2-Cl3-СН₃СН₃НMH⁺ 43573-R-метил-пиперазин-1-ил2-Cl3-СН₃СН₃НMH⁺ 44983-R-метил-пиперазин-1-ил2-Cl3-СН₃ННМН⁺ 43591-пиперазинил2-Cl3-CH₃СН₃НМН⁺ 503101-пиперазинил2-Cl3-CH₂ННMH⁺ 48911-(4-метил-пиперазин-1-ил)2-Cl3-СН₃НСН(СН₃)₂MH⁺ 47712-(4-метил-пиперазин-1-ил)2-Cl3-СН₃НСН₃MH⁺ 44913-(4-метил-пиперазин-1-ил)2-Cl3-СН₃НСН₂-СН₃МН⁺ 46314-(4-метил-пиперазин-1-ил)2-Cl3-СН₃НClMH⁺ 46915-(4-метил-пиперазин-1-ил)2-Cl3-СН₃НFMH⁺ 453

ПримерR₁R₂R₃R_aR_bДанные масс-спектрометрии16-(4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)2-ClННСН₂-СН₃MH⁺ 46217-(4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)2-ClННClMH⁺46818-(4,7-диаза-спиро [2.5]окт-7-ил)2-ClННСН₃MH⁺ 44719-(4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)2-ClНННMR⁺ 434

Пример 20: 3-[3-(4,7-Диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-нафталин-1-ил]-4-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион

Из 2-[3-(4,7-Диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-нафталин-1-ил]-ацетамида (100 мг, 0,30 ммоль) и метилового эфира (1-метил-1Н-индол-3-ил)-оксо-уксусной кислоты (97 мг, 0,44 ммоль) трижды получают азеотропную смесь с сухим ТГФ, а затем растворяют в сухом ТГФ (3 мл). Раствор 1,0 М KOtBu в ТГФ (1,2 мл) добавляют по каплям в течение 20 мин при КТ. Через 5 минут анализ с помощью ТСХ (тонкослойной хроматографии) показывает полное превращение исходных материалов. Реакцию гасят добавлением воды (5 мл). Смесь разводят EtOAc и дважды промывают насыщенным водным раствором NH₄Cl Водные слои дважды подвергают обратной экстракции EtOAc. Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄ и выпаривают растворитель. Остаток очищают с помощью УКХ (EtOAc/АсОН/Н₂О 800:55:45), что приводит к получению титульного соединения в виде его соли ацетата. Соединение растворяют в МеОН/ТФК (трифторуксусная кислота) и удаляют растворитель, получая титульное соединение в виде его соли трифторацетата. Данные ¹H ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 0,95 (М, 4Н), 3,39 (br, 4H), 3,49 (br, 2H), 3,86 (s, 3Н), 6,16 (d, J=7,9 Гц, 1Н), 6,46 (dd, J=6,6/7,9 Гц, 1Н), 7,00 (dd, J=6,6/7,9 Гц, 1Н), 7,13 (dd, J=7,6/7,6 Гц, 1H), 7,40 (m, 4Н), 7,55 (d, J=8,5 Гц, 1H), 7,78 (d, J=7,6 Гц, 1H), 8,14 (s, 1H), 9,10 (br, 2H), 11,17 (s, 1H); ES-MS: 463 [M+H]⁺.

2-[3-(4,7-Диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-нафталин-1-ил]-ацетамид, используемый как исходный материал, может быть получен следующим образом:

а) Из 2-[3-(4-бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-нафталин-1-ил]-ацетамида (280 мг, 0.73 ммоль) дважды получают азеотропную смесь с 1,25 М раствором HCl в МеОН. Остаток растворяют в EtOH (10 мл). Добавляют палладий на угле (10%, 77 мг) и перемешивают смесь в атмосфере водорода (1 атм) при КТ в течение 14 ч и при температуре 50°С в течение 2 ч. Смесь фильтруют и концентрируют фильтрат. Остаток очищают с помощью УКХ (EtOAc/АсОН/Н₂О 750:83:68-600:150:150), получая титульное соединение, содержащее 0,7 экв. АсОН. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 0,53 (m, 4H), 1,78 (s, АсОН), 2,93 (ddd, 2H), 3,04 (s, 2H), 3,16 (ddd, 2H), 3,76 (s, 2H), 6,94 (br, 1H), 6,99 (s, 1H), 7,25 (dd, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,35 (dd, J=6,7/7,8, 1H), 7,49 (br, 1H), 7,69 (d, J=7,8, 1H), 7,88 (d, J=10,0, 1H); ES-MS: 296 [M+H]⁺.

б) 2-[3-(4-бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-нафталин-1-ил]-ацетамид

Этиловый эфир [3-(4-бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-нафталин-1-ил]-уксусной кислоты (347 мг, 0,84 ммоль) и формамид (126 мг, 2,80 ммоль) растворяют в атмосфере аргона в ДМФ (диметилформамиде) (1 мл). Раствор нагревают до температуры 105°С и по каплям добавляют NaOMe (155 мкл 5,4 M раствора в МеОН, 45 мг, 0,84 ммоль) в течение 15 мин. Через 30 мин выдерживания при температуре 105°С, анализ с помощью ТСХ показывает, что исходный материал полностью использован. Реакционную смесь охлаждают до КТ, разводят водой и экстрагируют EtOAc. Слои EtOAc дважды промывают водой. При удалении растворителя и очистке с помощью УКХ (EtOAc/MeOH 98:2 до 96:4 до 90:10) получают титульное соединение. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (CDCl₃, 400 МГц) δ 0,71 (ddd, 2H), 0,89 (ddd, 2H), 3,10 (ddd, 2H), 3,16 (s, 2H), 3,31 (ddd, 2H), 3,93 (s, 2H), 3,99 (s, 2H), 5,33 (br, 1H), 5,42 (br, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,23 (d, J=2,0, 1H), 7,32 (m, 5H), 7,37 (dd, J=6,7 Гц, 1H), 7,45 (dd, J=6,7 Гц, 1H), 7,73 (d, J=8,9 Гц, 1H), 7,85 (d, J=8,9 Гц, 1H); ES-MS: 386 [М+Н]⁺.

в) Этиловый эфир [3-(4-Бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-нафталин-1-ил]-уксусной кислоты

Этиловый эфир (3-трифторметансульфонилокси-нафталин-1-ил)-уксусной кислоты (500 мг, 1,38 ммоль) растворяют в атмосфере аргона в сухом ТГФ (10 мл). Добавляют 4-бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]октан (325 мг, 1,61 ммоль) с последующим добавлением К₃PO₄ (410 мг, 1,93 ммоль), Pd₂(dba)₃ (62 мг, 0,069 ммоль) и бифенил-2-ил-ди-трет-бутил-фосфана (21 мг, 0,069 ммоль). Реакционную смесь нагревают до температуры 80°С. Через 4 ч анализ с помощью ТСХ показывает, что исходный материал полностью использован. Реакционную смесь охлаждают до КТ, фильтруют и концентрируют. Остаток очищают УКХ (гексаны/EtOAc 100:0 до 90:10, до 80:20, до 70:30, до 0:100), что дает титульное соединение. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (CDCl₃, 400 МГц) δ 0,69 (ddd, 2Н), 0,86 (ddd, 2H), 1,24 (t, J=7,0 Гц, 3Н), 3,09 (ddd, 2Н), 3,19 (s, 2H), 3,31 (ddd, 2H), 3,93 (s, 2H), 4,02 (s, 2H), 4,17 (q, J=7,0 Гц, 2H), 7,08 (s, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,33 (m, 6H), 7,42 (dd, J=8,8 Гц, 1H), 7,71 (d, J=8,8 Гц, 1H), 7,88 (d, J=8,8 Гц, 1H); ES-MS: 415 [M+H]⁺.

г) Этиловый эфир (3-трифторметансульфонилокси-нафталин-1-ил)-уксусной кислоты

Этиловый эфир (3-гидрокси-нафталин-1-ил)-уксусной кислоты (1,67 г, 7,25 ммоль) растворяют в CH₂Cl₂ (20 мл) в атмосфере аргона. Добавляют пиридин (1,17 мл, 1,15 г, 14,50 ммоль) и охлаждают реакционную смесь до 0°С, после чего по каплям добавляют трифторметансульфоновый ангидрид (1,79 мл, 3,07 г, 10,88 ммоль). Реакционную смесь нагревают до КТ, и через 1 ч выдерживания при КТ анализ с помощью ТСХ показывает, что исходный материал полностью использован. Реакционную смесь разводят EtOAc и дважды промывают Н₂О. Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄, растворитель удаляют и остаток очищают с помощью УКХ (гексаны/EtOAc 100:0 до 97:3, до 95:5, до 93:7, до 90:10), что приводит к получению титульного соединения. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 1,19 (t, J=7,2 Гц, 3Н), 4,11 (q, J=7,2 Гц, 2Н), 4,38 (s, 2Н), 7,60 (d, J=3,0 Гц, 1H), 7,70 (m, 2H), 8,03 (m, 1H), 8,12 (m, 2H); ES-MS: 362 [M+H]⁺.

д) Этиловый эфир (3-гидрокси-нафталин-1-ил)-уксусной кислоты

Этиловый эфир (3-бензилокси-нафталин-1-ил)-уксусной кислоты (2,43 г, 7,58 ммоль) растворяют в МеОН (50 мл). Добавляют палладий на угле (807 мг) и перемешивают реакционную смесь при КТ в атмосфере водорода (1 атм) в течение 14 ч. Реакционную смесь фильтруют. При концентрировании получают чистое титульное соединение. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (CDCl₃, 400 МГц) δ 1,18 (t, J=7,2 Гц, 3Н), 4,05 (s, 2H), 4,10 (q, J=7,2 Гц, 2H), 7,04 (d, J=1,8 Гц, 1H), 7,06 (d, J=1,8, 1H), 7,30 (t, J=7,8, 1H), 7,40 (t, J=7,8, 1H), 7,70 (d, J=7,8, 1H), 7,80 (d, J=7,8 Гц, 1H); ES-MS: 230 [М+Н]⁺.

е) Этиловый эфир (3-бензилокси-нафталин-1-ил)-уксусной кислоты

3-бензилокси-1-бром-нафталин (5,64 г, 18,01 ммоль) растворяют в атмосфере аргона в сухом ДМФ (диметилформамиде) (100 мл). Добавляют этиловый эфир трибутилстаннанил-уксусной кислоты (7,47 г, 19,81 ммоль), а также дихлорид [бис(три-орто-толил-фосфин)]палладия (II) (2,83 г, 3,60 ммоль) и бромид цинка (II) (5,27 г, 23,41 ммоль). Реакционную смесь нагревают до температуры 80°С в течение 3 ч. Реакционную смесь разводят EtOAc и дважды промывают разбавленным соляным раствором (обратная экстракция). Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄, растворитель удаляют и остаток очищают с помощью УКХ (гексан/EtOAc 100:0 до 97,5:2,5, до 95:5, до 90:10). Полученное в результате масло, еще содержащее примеси олова, перемешивают в смеси 1:1 EtOAc/1 н. NaOH (200 мл) в течение 1 час. Смесь дважды экстрагируют EtOAc. Объединенные органические слои дважды промывают Н₂О (обратная экстракция), сушат над Na₂SO₄ и концентрируют. Остаток очищают с помощью УКХ (гексан/EtOAc 100:0 до 97:3, до 95:5, до 93:7, до 92:8, до 90:10), получая титульное соединение. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 1,18 (t, J=7,2 Гц, 3Н), 4,10 (q, J=7,2 Гц, 2H), 4,11 (s, 2H), 5,25 (s, 2H), 7,21 (d, J=3,0 Гц, 1H), 7,41 (m, 8H), 7,53 (d, J=6,6 Гц, 1H), 7,84 (dd, J=7,2 Гц, 1H); ES-MS: 320 [М+Н]⁺.

ж) 3-Бензилокси-1-бром-нафталин

4-бром-нафталин-2-ол (5,0 г, 22,41 ммоль) растворяют в сухом ДМФ (50 мл) в атмосфере аргона. Добавляют гидрид натрия (986 мг 60% суспензии с минеральном масле, 592 мг, 24,65 ммоль) и смесь перемешивают при температуре 50°С в течение 1 ч. После вторичного охлаждения до КТ добавляют бензилбромид (3,46 мл, 4,98 г, 29,14 ммоль) и йодид тетрабутиламмония (828 мг, 2,24 ммоль). После выдерживания в течение 16 ч при КТ реакционную смесь разводят EtOAc. Раствор дважды промывают полуконцентрированным соляным раствором (обратная экстракция).

Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄, удаляют растворитель и очищают остаток с помощью УКХ (гексан/EtOAc 100:0 до 95:5, до 90:10), получая титульное соединение. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (CDCl₃, 400 МГц) δ 5,22 (s, 2H), 7,25 (d, J=1,5 Гц, 1Н), 7,45 (m, 7Н), 7,64 (d, J=2,4, 1H), 7,75 (d, J=7,8, 1H), 8,17 (d, J=7,8, 1H); ES-MS: 312 [M+H]⁺.

Согласно процедуре, соответствующей Примеру 20, могут быть получены соединения формулы I, в которой R представляет собой остаток формулы (б), как показано в Таблице 2.

Таблица 2ПримерR₄R_aДанные M.S.*213-R-метил-пиперазин-1-илСН₃MH⁺ 45222-(4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)СН₃МН⁺ 46423-(4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)НМН⁺ 450243-R-метил-пиперазин-1-илНМН⁺ 438253-S-метил-пиперазин-1-илСН₃MH⁺ 452263-S-метил-пиперазин-1-илНМП⁺ 438274-метил-3-S-метил-пиперазин-1-илСН₃МН⁺ 466284-метил-3-S-метил-пиперазин-1-илНMH⁺ 452* M.S. - масс-спектрометрия

Согласно процедуре, как описано выше или в Примере 56 Международной заявки WO 02/38561, но при использовании соответствующих исходных материалов могут быть получены соединения формулы I, в которой R представляет собой остаток формулы (с), как показано ниже в Таблице 3.

Таблица 3Прим.R₁₄R₁₅ в 4R₁₆ в 5R_aR_bДанные M.S.29-(4-метил-пиперазин-1-ил)ClСН₃ННМН⁺ 43730-(4-метил-пиперазин-1-ил)BrНННМН⁺ 46931-(4-метил-пиперазин-1-ил)BrСН₃ННМН⁺ 48332-(4-метил-пиперазин-1-ил)BrНСН₃НMH⁺ 48333-(4-метил-пиперазин-1-ил)CF₃НННMH⁺ 45734-(4-метил-пиперазин-1-ил)CF₃НСН₃НMH⁺ 471353-R-метил-пиперазин-1-илClСН₃ННМН⁺ 43736-(4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)ClСН₃ННМН⁺ 449371-пиперазинилClСН₃ННMH⁺ 423384-метил-3-R-метил-пиперазин-илClСН₃ННMH⁺ 451393-R-метоксиэтил-пиперазин-1-илClСН₃ННMH⁺ 481403-R-этил-пиперазин-1-илClСН₃ННMH⁺ 451413-R-бензил-пиперазин-1-илClСН₃ННMH⁺ 514423-S-метил-пиперазин-1-илClСН₃ННМН⁺ 437434-метил-пиперазин-1-илClСН₃НСН₂-СН₂-СН₃МН⁺ 479443-СН₂F-пиперазин-1-илClСН₃ННМН⁺ 453454-метил-пиперазин-1-илClСН₃НFМН⁺ 455464-метил-пиперазин-1-илClСН₃НСН(СН₃)₂МН⁺ 479474-метил-пиперазин-1-илClСН₃НClMH⁺ 471484-метил-пиперазин-1-илClСН₃НОСН₃МН⁺ 467494-метил-пиперазин-1-илClСН₃НСН₃MH⁺ 451504-метил-пиперазин-1-илClСН₃НСН₂-СН₃МН⁺ 465514-метил-пиперазин-1-илCF₃ННСН₂-СН₃МН⁺ 485524-метил-пиперазин-1-илCF₃ННСН₃МН⁺ 471534-метил-пиперазин-1-илFНННМН⁺ 407544-метил-пиперазин-1-илFННСН₃MH⁺ 421554-метил-пиперазин-1-илFННСН₂-СН₃МН⁺ 435564-метил-пиперазин-1-илFСН₂-СН₃НСН₃МН⁺ 449574-метил-пиперазин-1-илFСН₂-СН₃ННМН⁺ 435584-метил-пиперазин-1-илFСН₂-СН₃НСН₂-СН₃МН⁺ 463594-метил-пиперазин-1-илFСН₃ННMH⁺ 421604-метил-пиперазин-1-илFСН₃НСН₃МН⁺ 435

Прим.R₁₄R₁₅ в 4R₁₆ в 5R_aR_bДанные M.S.614-метил-пиперазин-1-илFСН₃HСН₂СН₃MH⁺ 449

Согласно процедуре, как описано выше или в примере 163 Международной заявки WO 02/38561, но при использовании соответствующих исходных материалов могут быть получены соединения формулы I, в которой R представляет собой остаток формулы (г), как показано в таблице 4.

Таблица 4ПримерR₈R_aДанные M.S.623-S-метил-пиперазин-1-илСН₃МН⁺ 452633-R-метил-пиперазин-1-илНMH⁺ 438643-R-метил-пиперазин-1-илСН₃МН⁺ 452654-бензил-1-пиперазинилНМН⁺ 514664-бензил-1-пиперазинилСН₃МН⁺ 528671-пиперазинилСН₃MH⁺ 438681-пиперазинилНМН⁺ 424

Пример 69: 3-[3-(4,7-Диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-изохинолин-1-ил]-4-(7-метил-1Н-индол-3-ил)-пиррол-2,5-дион

Из 2-[3-(4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-изохинолин-1-ил]-ацетамида (4,95 г, 16,70 ммоль) и метилового эфира (7-метил-1Н-индол-3-ил)-оксо-уксусной кислоты (5,44 г, 25,05 ммоль) дважды получают азеотропную смесь с сухим ТГФ. Затем добавляют сухой ТГФ (100 мл) и в атмосфере аргона по каплям вводят KOtBu (1,0 М в ТГФ, 50 мл, 50 ммоль) в течение 20 мин. Через дополнительные 90 мин анализ с помощью ТСХ показывает полное превращение исходных материалов. Реакционную смесь разводят водой и дважды экстрагируют EtOAc. Объединенные органические слои дважды промывают насыщенным водным раствором NH₄Cl (обратная экстракция), сушат над Na₂SO₄ и концентрируют. Очистка с помощью УКХ (CH₂Cl₂/MeOH 100:0 до 98:2, до 96:4, до 94:6, до 92:8, до 90:10) дает титульное соединение, которое превращают в его соль уксусной кислоты путем концентрирования раствора EtOH/АсОН. Данные ¹H ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 0,26-0,53 (br, 4Н), 1,89 (s, 3H, СН₃СООН), 2,36 (s, 3H), 2,80 (br m, 2Н), 3,15 - 3,48 (br m, 2H), 6,14 (d, J=8,2 Гц, 1Н), 6,44 (dd, J=8,2/7,4 Гц, 1Н), 6,75 (d, J=7,4 Гц, 1Н), 7,00 (s, 1H), 7,02 (dd, J=8,2/8,2 Гц, 1Н), 7,40 (dd, J=8,2/8,2 Гц, 1Н), 7,59 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,63 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,63 (d, J=8,2 Гц, 1H), 7,97 (d, J=2,9 Гц, 1H), 11,04-11,21 (br, 1H), 11,86 (d, J=2,9 Гц, 1H); ES-MS: 464 [M+H]⁺.

2-[3-(4,7-Диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-изохинолин-1-ил]-ацетамид, используемый в качестве исходного материала, может быть приготовлен следующим образом:

а) 2-[3-(4-Бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-изохинолин-1-ил]-ацетамид (490 мг, 1,27 ммоль) растворяют в абсолютном МеОН (5 мл). Добавляют Pd на угле (140 мг), а также формиат аммония (200 мг, 3,17 ммоль). После нагревания с обратным холодильником в течение 1 ч (Т=75°С) добавляют дополнительную порцию формиата аммония (200 мг, 3,17 ммоль). Через 1 ч анализ с помощью ТСХ показывает полное превращение исходных материалов. После фильтрации и концентрирования остаток помещают в CH₂Cl₂ и промывают водой (рН 10 получают при добавлении 2 н. NaOH). Органический слой сушат над Na₂SO₄ и удаляют растворитель. Очистка с помощью УКХ (EtOAc/АсОН/Н₂О 750:83:68 до 700:110:90, до 650:130:120, до 600:150:150) приводит к получению титульного соединения в виде его бисацетатной соли. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 0,46-0,52 (m, 4H), 2,88 (t, J=5,5, 2H), 3,35 (s, 2H), 3,49 (t, J=5,5, 2H), 3,94 (s, 2H), 6,77 (s, 1H), 7,00 (br s, 1H), 7,18-7,25 (m, 1H), 7,45-7,56 (m, 2H), 7,60-7,65 (m, 1H), 7,95 (d, J=9,9, 1H), ES-MS: 297 [М+Н]⁺.

б) 2-[3-(4-Бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-изохинолин-1-ил]-ацетамид

Этиловый эфир [3-(4-бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-изохинолин-1-ил]-уксусной кислоты (700 мг, 1,68 ммоль) растворяют в сухом ДМФ в атмосфере аргона. Добавляют формамид (224 мкл, 254 мг, 5,64 ммоль) и нагревают реакционную смесь до температуры 105°С. При данной температуре по каплям добавляют NaOMe (312 мкг 5,4 М раствора в МеОН, 91 мг, 1,68 ммоль) в течение 20 мин. После выдерживания в течение 30 мин при температуре 105°С анализ с помощью ТСХ показывает полное превращение исходного материала. После охлаждения реакционной смеси до КТ добавляют воду и проводят экстракцию с использованием EtOAc. Органические слои промывают Н₂О (два раза), сушат над Na₂SO₄ и концентрируют. Остаток очищают с помощью УКХ (гексан/EtOAc 1:1 до 1:3, до 0:100 до EtOAc/МеОН 98:2) для получения титульного соединения. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 0,68-0,70 (m, 2Н), 0,82-0,88 (m, 2Н), 3,08 (t, J=4,4, 2H), 3,45 (s, 2H), 3,58 (t, J=4,4, 2H), 3,96 (s, 2H), 4,27 (s, 2H), 5,3 - 5,5 (br, 1H), 6,55-6,7 (br, 1H), 6,72 (s, 1H), 7,26-7,36 (m, 6H), 7,51 (t, J=8,8, 1H), 7,60 (d, J=9,9, 1H), 8,02 (d, J=9,9, 1H); ES-MS: 387 [М+Н]⁺.

в) Этиловый эфир [3-(4-бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)-изохинолин-1-ил]-уксусной кислоты

Этиловый эфир (3-хлор-изохинолин-1-ил)-уксусной кислоты (2,50 г, 10,01 ммоль), 4-бензил-4,7-диаза-спиро[2.5]октан (2,23 г, 11,01 ммоль), NaOtBu (1,06 г, 11,01 ммоль), BINAP (249 мг, 0,40 ммоль) и ацетат палладия(II) (180 мг, 0,80 ммоль) смешивают под аргоном. После добавления дегазированного сухого диоксана (36 мл) суспензию нагревают до температуры 85°С. После выдерживания в течение 25 мин при температуре 85°С анализ ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) показывает превращение на 71%. Смесь охлаждают до КТ, разводят EtOAc и промывают Н₂О и насыщенным водным раствором NH₄Cl (обратная экстракция). Объединенные органические слои сушат над Na₂SO₄, растворитель удаляют и остаток очищают с помощью УКХ (гексан/EtOAc 100:0 до 96:4, до 93:7, до 90:10, до 85:15) для получения титульного соединения. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 0,58-0,61 (m, 2H), 0,70-0,73 (m, 2H), 1,18 (t, J=8,8, 3Н), 2,98 (t, J=5,5, 2H), 3,39 (s, 2H), 3,49 (t, J=5,5, 2H), 3,86 (s, 2H), 4,12 (s, 2H), 4,12 (q, J=8,8, 2H), 5,59 (s, 1H), 7,14-7,19 (m, 6H), 7,39 (t, J=8,8, 1H), 7,51 (d, J=9,9, 1H), 7,78 (d, J=9,9, 1H); ES-MS: 417 [M+H]⁺.

г) Этиловый эфир (3-хлор-изохинолин-1-ил)-уксусной кислоты

1,1,1,3,3,3-гексаметил-дисилазан (27,4 мл, 20,37 г, 126,2 ммоль) растворяют в сухом толуоле (150 мл). После охлаждения до температуры -78°С медленно добавляют н-BuLi (79 мл 1,6 М раствора в гексанах, 126,2 ммоль) в течение 20 мин. Суспензию белого цвета перемешивают при температуре -78°С в течение 15 мин и при КТ в течение 15 мин, через указанный период времени получают прозрачный раствор светло-желтого цвета. Данный раствор канюлей переносят во вторую двугорлую колбу, содержащую Pd₂(dba)₃ (1,39 г, 1,51 ммоль) и (2'-дициклогексилфосфанил-бифенил-2-ил)-диметил-амин (1,25 г, 3,18 ммоль). После перемешивания при КТ в течение 10 мин прозрачный раствор темно-красного цвета охлаждают до температуры -10°С. Трет-бутиловый эфир уксусной кислоты (15,7 мл, 13,5 г, 116,1 ммоль) добавляют в течение 5 мин. После выдерживания в течение 10 мин при температуре -10°С добавляют 1,3-дихлор-изохинолин (10,0 г, 50,49 ммоль) в одной порции. Раствору темно-красного цвета дают нагреться до КТ. Через 30 мин выдерживания при КТ анализ с помощью ТСХ показывает полное превращение исходного материала. Реакционную смесь фильтруют через слой оксида кремния толщиной 2 см, который промывают EtOAc/MeOH 98:2. После концентрирования остаток очищают с помощью УКХ (толуол/CH₂Cl₂ 2:1 до толуол/EtOAc 100:0 до 99:1, до 98:2, до 97:3, до 96:4, до 94:6, до 90:10) для получения трет-бутилового эфира (3-хлор-изохинолин-1-ил)-уксусной кислоты. Данное соединение растворяют в насыщенном этаноловом растворе HCl (200 мл) и нагревают с обратным холодильником в течение 15 мин. Концентрирование приводит к получению титульного соединения с количественным выходом. Данные ¹Н ЯМР-спектрометрии (ДМСО, 400 МГц) δ 1,17 (t, J=8,8, 3Н), 4,11 (q, J=8,8, 2Н), 4,28 (s, 2H), 7,51-7,57 (m, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,61-7,66 (m, 1H), 7,72 (d, J=8,8, 1H), 7,98 (d, J=8,8, 1H); ES-MS: 250 [М+Н]⁺.

Согласно процедуре, соответствующей примеру 163, но при использовании соответствующих исходных материалов могут быть получены соединения формулы I, в которой R представляет собой остаток формулы (д), как показано в таблице 5.

Таблица 5ПримерR₉R_aR_bДанные M.S.70-(4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)СН₃НMH⁺ 465713-этил-пиперазин-1-илСН₃НМН⁺ 46772-(4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил)ННMH⁺ 451733-этил-1-пиперазинилННMH⁺ 453743-R-метил-пиперазин-1-илСН₃НМН⁺ 453753-R-метил-пиперазин-1-илННMH⁺ 439763-S-метил-пиперазин-1-илСН₃НМН⁺ 453773-S-метил-пиперазин-1-илННMH⁺ 439784-метил-3-S-метил-пиперазин-1-илСН₃НМН⁺ 467794-метил-3-S-метил-пиперазин-1-илННМН⁺ 45380^*4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илСН₃НМН⁺ 464814,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илНFMH⁺ 479824,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илСН₂-СН₃НMH⁺ 479834,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илНСН(СН₃)₂МН⁺ 495844,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илНОСН₃MH⁺ 471854,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илСН₃СН₂-СН₃MH⁺ 451864,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илНСН₂-СН₃МН⁺ 465874,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илСН(СН₃)₂НMH⁺ 451884,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илСН₃СН₃МН⁺ 479894,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илСН₃ClМН⁺ 499904,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илНClМН⁺ 485914,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-илСН₂-СН₃СН₃MH⁺ 492923-этил-пиперазин-1-илCH₂-СН₃СН₂-СН₃МН⁺ 494* Соединение, соответствующее примеру 80, превращают в его бис-трифторацетатную или ацетатную соль.

Соединения формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли проявляют ценные фармакологические свойства, например ингибируют активность протеинкиназы С (ПКС), например изоформ ПКС, таких как α, β, δ, ε, η или θ, подавляют активацию и пролиферацию Т-клеток, например путем ингибирования продукции Т-клеток или цитокинов, например ИЛ-2, посредством подавления пролиферативного ответа Т-клеток или цитокинов, например ИЛ-2, например, как показано в тестах in vitro и in vivo, и на основании этого предложено их терапевтическое применение.

A. In vitro

1. Анализ с использованием протеинкиназы С

Соединения формулы I тестируют на активность в отношении различных изоформ ПКС согласно опубликованному методу (см. D. Geiges et al., Biochem. Pharmacol., 1997, 53:865-875). Анализ проводят в 96-луночной полипропиленовой плате для микротитрования (Costar 3794), которую предварительно силиконизируют с использованием Sigmacote® (Sigma SL-2). Реакционная смесь (50 мкл) содержит 10 мкл соответствующего изомера ПКС, а также 25 мкл тест-соединения и 15 мкл смешанного раствора, который содержит 200 мг/мл сульфата протамина, 10 мМ Mg(NO₃)₂, 10 мкМ АТФ (Boehringer 519987) и 3750 Бк ³³Р-АТФ (Hartmann Analytic SFC301, 110 ТБк/ммоль) в 20 мМ Трис-буфере рН 7,4+0,1% БСА (бычьего сывороточного альбумина). Инкубирование проводят в течение 15 мин при температуре 32°С в термостате со встряхиванием для плат для микротитрования (Biolabo Scientific Instruments). Реакцию останавливают добавлением 10 мкл 0,5 М Na₂ЭДТК (этилендиаминтетрауксусной кислоты), рН 7,4. 50 мкл смеси пипеткой наносят на предварительно увлажненную фосфоцеллюлозную бумагу (Whatmann 3698-915) при осторожном надавливании. Неинкорпорированную АТФ отмывают с использованием 100 мкл бидистиллированной H₂O. Бумагу дважды промывают в 0,5% Н₃PO₄ в течение 15 мин, а затем в течение 5 мин в EtOH. После этого бумагу сушат и помещают в универсальный фильтр (Packard 6005219) и накрывают слоем Microscint-O (Packard 6013611) в количестве 10 мл/лунку перед подсчетом в счетчике радиоактивности Topcount (Packard). Измерение IC₅₀ (50% подавляющей или ингибирующей концентрации) проводят на рутинной основе путем инкубирования серийного разведения ингибитора в концентрациях, лежащих в интервале от 1 до 1000 мкМ согласно нижеописанному методу. Значения IC₅₀ рассчитывают с помощью графика в виде эмпирической сигмоидальной кривой.

2. Анализ протеинкиназы С θ

Человеческую рекомбинантную ПКС θ используют в условиях анализа, как описано выше. В данном анализе соединения формулы I ингибируют ПКС θ с IC₅₀≤1 мкМ. Соединение, соответствующее Примерам 33 и 69, ингибирует ПКС θ в данном анализе с IC₅₀ 6,8 и 12,1 нМ, соответственно.

3. Анализ протеинкиназы Сα

Человеческую рекомбинантную ПКСα получают из фирмы Oxford Biomedical Research и используют в условиях анализа, как описано выше в Разделе A.1. В данном анализе соединения формулы I ингибируют ПКСα с IC₅₀≤1 мкМ. Соединение, соответствующее примеру 29, ингибирует ПКСα в данном анализе с IC₅₀ 4,3 нМ.

4. Анализ протеинкиназы С β1

Человеческую рекомбинантную ПКСβ1 получают из фирмы Oxford Biomedical Research и используют в условиях анализа, как описано выше в Разделе A.1. В данном анализе соединения формулы I ингибируют ПКСβ1 с IC₅₀≤1 мкМ. Соединение, соответствующее Примеру 33, ингибирует ПКСβ1 в данном анализе с IC₅₀ 19,6 нМ.

5. Анализ протеинкиназы Сδ

Человеческую рекомбинантную ПКСδ получают из фирмы Oxford Biomedical Research и используют в условиях анализа, как описано выше в Разделе A.1. В данном анализе соединения формулы I ингибируют ПКСδ с IC₅₀≤1 мкМ. Соединение, соответствующее Примеру 29, ингибирует ПКСδ в данном анализе с IC₅₀ 20 нМ.

6. Анализ протеинкиназы Cε

Человеческую рекомбинантную ПКСε получают из фирмы Oxford Biomedical Research и используют в условиях анализа, как описано выше в Разделе A.1. В данном анализе соединения формулы I ингибируют ПКСε с IC₅₀≤1 мкМ. Соединение, соответствующее Примеру 69, ингибирует ПКСε в данном анализе с IC₅₀ 18 нМ.

7. Анализ протеинкиназы Cη

Человеческую рекомбинантную ПКСη получают из фирмы PanVera и используют в условиях анализа, как описано выше в Разделе А.1. В данном анализе соединения формулы I ингибируют ПКСη с IC₅₀≤1 мкМ. Соединение, соответствующее примеру 29, ингибирует ПКСη в данном анализе с IC₅₀ 27,4 нМ.

8. Анализ костимуляции CD28

Анализ проводят на клетках Jurkat, трансфицированных конструкцией промотора/сигнального гена интерлейкина-2 человека, как описано в статье Baumann G et al. (см. Transplant.Proc. 1992; 24:43-8), причем сигнальный ген β-галактозидазы замещают геном люциферазы (см. статью de Wet J., et al., Mol. Cell Biol. 1987, 7(2), 725-737). Клетки стимулируют связанными с твердой фазой антителами или форболмиристат ацетатом (ФМА) и ионофором Са⁺⁺ иономицином следующим образом. Для опосредованной антителом стимуляции планшеты для микротитрования Microlite TM1 (Dynatech) покрывают козьими антителами IgG Fc против мыши (Jackson) в концентрации 3 мкг/мл в 55 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS)/лунку в течение трех часов при КТ. После удаления антитела планшеты блокируют инкубированием с 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS (300 мкл/лунку) в течение 2 ч при КТ. После трехкратного промывания с помощью 300 мкл PBS/лунку добавляют 10 нг/мл антител против Т-клеточного рецептора (WT31, Becton & Dickinson) и 300 нг/мл антител против CD28 (15Е8) в 50 мкл 2% БСА/PBS в качестве стимулирующих антител и инкубируют в течение ночи при температуре 4°С. Наконец, планшеты три раза промывают 300 мкл PBS/лунку. В отдельных планшетах готовят семь трехкратных серийных разведений тест-соединений в повторностях в среде для анализа (RPMI 1640/10% сыворотка телячьих эмбрионов (FCS), содержащая 50 мкМ 2-меркаптоэтанол, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), смешивают с трансфицированными клетками Jurkat cells (клон К22 290_Н23) и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С в 5% СО₂. Затем 100 мкл данной смеси, содержащей 1×10⁵ клеток, переносят в планшеты для анализа, покрытые антителом. Параллельно 100 мкл инкубируют с 40 нг/мл ФМА и 2 мкМ иономицина. После инкубирования в течение 5,5 ч при температуре 37°С в 5% CO₂, определяют уровень люциферазы путем измерения биолюминесценции. Планшеты центрифугируют в течение 10 мин при 500 g и удаляют супернатант резким движением. Добавляют лизирующий буфер, содержащий 25 мМ Трис-фосфата, рН 7,8, 2 мМ ДТТ (дитиотреитол), 2 мМ 1,2-диаминоциклогексан-N,N,N',N-тетрауксусную кислоту, 10% (об/об) глицерин и 1% (об/об) Тритон Х-100 (20 мкл/лунку). Планшеты инкубируют при КТ в течение 10 мин при постоянном встряхивании. Активность люциферазы анализируют с помощью биолюминесцентного ридера (Labsystem, Helsinki, Finland) после автоматизированного добавления 50 мкл/лунку буфера для реакции люциферазы, содержащего 20 мМ Трицин, 1,07 мМ (MgCO₃)₄Mg(OH)₂×5H₂O, 2,67 мМ MgSO₄, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 33,3 мМ ДТТ, 270 мкМ кофермента А, 470 мкМ люциферина (Chemie Brunschwig AG), 530 мкМ АТФ, рН 7,8. Время запаздывания составляет 0,5 с, общее время измерения составляет 1 или 2 с. Контрольные значения нижнего уровня представляют собой световые единицы от клеток, стимулированных антителом против Т-клеточного рецептора или ФМА, контрольные значения высокого уровня получают от клеток, стимулированных антителами против Т-клеточного рецептора/антителами против CD28 или ФМА/иономицином без добавления какого-либо тест-образца. Контрольные значения нижнего уровня вычитают из всех значений. Ингибирование, полученное в присутствии тест-соединения, рассчитывают как процент ингибирования контрольного значения высокого уровня. Концентрацию тест-соединений, в результате приводящую к 50% ингибированию (IC₅₀), определяют по кривым зависимости от дозы. В данном анализе соединения формулы I подавляют клетки Jurkat, стимулированные антителом против Т-клеточного рецептора/антителом против CD28 и ФМА/иономицином с IC₅₀≤1 мкМ. Соединение, соответствующее Примеру 29, в данном анализе имеет IC₅₀ 20 нМ.

9. Реакция аллогенной смешанной культуры лейкоцитов (РСКЛ или СКЛ-реакция)

СКЛ-реакцию двух типов проводят согласно стандартным методикам (см. J. Immunol. Methods, 1973, 2, 279 и Мео Т. et al., Immunological Methods, New York, Academic Press, 1979, 227-39). Вкратце, клетки селезенки мышей СВА и BALB/c (1,6×10 клеток каждой линии/лунку в плоскодонных планшетах для микротитрования для тканевых культур, в целом 3,2×10⁵) инкубируют в среде RPMI, содержащей 10% FCS, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco BRL, Basel, Switzerland), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (Fluka, Buchs, Switzerland) и соединения в серийных разведениях. Делают семь трехкратных разведений в повторностях на тест-соединение. Через четверо суток инкубирования добавляют 1мкКи ³Н-тимидин. Клетки собирают через дополнительный четырехчасовой период инкубирования и определяют включенный ³Н-тимидин согласно стандартным методикам. Фоновые значения (контроль нижнего уровня) СКЛ-реакции представляют собой данные по пролиферации монокультуры клеток BALB/c. Значения контроля нижнего уровня вычитают из всех значений. Контрольные значения высокого уровня без содержания какого-либо образца принимают за 100% пролиферацию. Вычисляют процент подавления образцами и определяют концентрации, требующиеся для 50% подавления (значения IC₅₀). В данном анализе соединение, соответствующее Примеру 29, имеет IC₅₀ 28 нМ. Соединения формулы I также демонстрируют значения IC₅₀ в наномолярном (нМ) диапазоне при тестировании в СКЛ-реакции с использованием лейкоцитов человека.

10. Ингибирование GSK-3β

Анализ связывания GSK-3β проводят реакциях объемом 50 мкл в 96-луночных полипропиленовых планшетах, причем каждая реакция содержит 20 мМ хлорида магния, 40 мкМ АТФ, 2 мМ ДТТ, 88,5 мкМ биотинилированного и фосфорилированного CREB-пептидного субстрата (биотин-KRREILSRRPS(PO₄)YR-OH; Q.M. Wang et al., J.Biol.Chem. 269, 14566-14574, 1994), [γ-³³Р]АТФ (1 мкКи) и 2 мкл тестируемого соединения ДМСО (диметилсульфоксид) (в различных концентрациях). Добавляют 15 мкл GSK-3β (в различных концентрациях) и инкубируют смесь при температуре 30°С в течение 1 ч. Реакцию останавливают перенесением 25 мкл смеси на фосфоцеллюлозную пластинку, содержащую 130 мкл 1,85% фосфорной кислоты. Свободные радионуклиды в мембране отмывают под вакуумом 1,85% фосфорной кислотой (5 раз). После последнего промывания пластинку переносят на переходную плату, добавляют 50 мкл сцинтиляционной смеси (Microscint-20, Packard, cat. №20-133) в каждую лунку и подсчитывают уровень радиоактивности с помощью счетчика (top counter). Соединения формулы I проявляют активность в данном анализе. Соединения формулы I можно также тестировать с помощью других стандартных анализов связывания GSK-3β при использовании других субстратов, например, таких как имеющиеся в продаже.

В. In vivo

Трансплантация сердца у крыс

Используют комбинацию линий: самцы Lewis (RT¹ гаплотип) и BN (гаплотип RT¹). Животным проводят анестезию с использованием ингаляционного изофлуорана. После гепаринизации крысы-донора через брюшной отдел нижней полой вены при одновременном обескровливании через аорту вскрывают грудную клетку и быстро охлаждают сердце. Аорту лигируют и отделяют дистально по отношению к первой ветви и плечеголовной ствол отделяют на уровне первого разветвления. Левую легочную артерию лигируют и отделяют, правую сторону отделяют, но оставляют открытой. Все остальные сосуды препарируют, лигируют и отделяют, и сердце донора удаляют для помещения в ледяной физиологический раствор.

Подготовку реципиента осуществляют путем препарирования и пережатия подпочечной брюшной аорты и полой вены. Трансплантат имплантируют с помощью анастомозов типа "конец в бок" при использовании одноволоконного шовного материала 10/0 между плечеголовным стволом донора и аортой реципиента и правой легочной артерии донора к полой вене реципиента. Зажимы снимают, трансплантат соединяют ретроабдоминально, содержимое брюшной полости промывают теплым физиологическим раствором и животное зашивают и дают ему восстановиться под нагревательной лампой. Выживаемость трансплантата мониторируют путем ежедневной пальпации сокращений сердца донора через брюшную полость. Отторжение считают полным, когда сердце перестает сокращаться. Повышение выживаемости трансплантата получают у животных, которых лечат соединением формулы I, которое вводят перорально при суточной дозе от 1 до 30 мг/кг при приеме дважды в день.

Модель трансплантат против хозяина

Клетки селезенки (2×10⁷) крыс Wistar/F вводят подкожной инъекцией в подушечку на подошве правой задней лапы гибридных крыс (Wistar/F x Fischer 344)F₁. Подушечку задней левой лапы оставляют нелеченой. Животных лечат тест-соединениями в течение 4 последующих дней (0-3). В день 7 удаляют подколенные лимфатические узлы и определяют разницу в массе между двумя соответствующими лимфатическими узлами. Результаты выражают как подавление увеличения лимфатических узлов (приводят в процентах), сравнивая разницу в массах лимфатических узлов в экспериментальных группах с разницей в массах между соответствующими лимфатическим узлами групп животных, оставшихся нелечеными тест-соединением. В данном анализе подавление 100% получают при использовании соединения, соответствующего примеру 29, при введении в дозе 30 мг/кг/два раза в день.

Вследствие этого соединения формулы I эффективны для лечения и/или профилактики заболеваний или состояний, опосредуемых Т-лимфоцитами и/или ПКС, например, острого или хронического отторжения алло- или ксенотрансплантатов органов или тканей, болезней трансплантат против хозяина, атеросклероза, закупорки сосудов вследствие повреждения сосудов, такого как при ангиопластике, рестеноза, ожирения, синдрома X, нарушения толерантности к глюкозе, синдрома поликистоза яичников, гипертензии, сердечной недостаточности, хронической обструктивной легочной болезни, заболеваний ЦНС, таких как болезнь Альцгеймера или боковой амиотрофический склероз, рака, инфекционных заболеваний, таких как СПИД, септический шок или респираторный дистресс-синдром взрослых, ишемических/реперфузионных повреждений, например инфаркта миокарда, инсульта, ишемии кишки, почечной недостаточности или геморрагического шока, либо травматического шока, например травматического повреждения головного мозга. Соединения формулы I используют также для лечения и/или профилактики опосредованных Т-клетками острых или хронических воспалительных заболеваний или нарушений, либо аутоиммунных заболеваний, например ревматоидного артрита, остеоартрита, системной красной волчанки, тироидоза Хашимото, рассеянного склероза, злокачественной миастении, диабета типа I или II и связанных с ним нарушений, например ангиопатии, диабетической пролиферативной ретинопатии, диабетического макулярного отека, нефропатии, невропатии и синдрома Дауна, респираторных заболеваний, таких как астма или воспалительное повреждение легкого, воспалительных повреждений печени, воспалительных гломерулярных повреждений, кожных проявлений иммунологически опосредованных нарушений или болезней, воспалительных и гиперпролиферативных кожных заболеваний (таких как псориаз, атопический дерматит, аллергический контактный дерматит, контактный дерматит, вызываемый раздражающими веществами, и другие экзематозные дерматиты, себорейная экзема), воспалительных глазных заболеваний, например синдрома Шегрена, кератоконъюнктивита или увеита, воспалительной болезни кишки, болезни Крона или язвенного колита. Для вышеуказанных применений необходимая доза, конечно, будет варьироваться в зависимости от способа введения, конкретного состояния, лечение которого предусматривают, и необходимого эффекта. В общем, как показано, удовлетворительные результаты системно получают при суточных дозировках от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мг/кг массы тела. Необходимую суточную дозу для более крупного млекопитающего, например человека, которая лежит в интервале от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 2000 мг, рекомендуют вводить, например, в разделенных дозах до четырех раз в сутки или в форме с пролонгированным действием.

Соединения формулы I можно ввести любым принятым образом, в частности энтерально, например перорально, например, в форме таблеток или капсул, или парентерально, например, в форме инъекционных растворов или суспензий, местно, например, в форме лосьонов, гелей, мазей или кремов, или в назальной форме, или в форме суппозиториев. Фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли в сочетании с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, можно приготовить принятым образом посредством смешивания с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Унифицированные дозированные формы для перорального применения содержат, например, от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 500 мг активной субстанции.

Наружное нанесение осуществляют, например, на кожу. Другой формой наружного применения является нанесение на глаз.

Соединения формулы I можно применять в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, например, как указано выше. Данные соли могут быть получены принятым путем и иметь такой же порядок активности, что и свободные соединения.

В соответствии с вышеизложенным данное изобретение далее представляет:

1.1. Способ профилактики или лечения нарушений или заболеваний, опосредованных Т-лимфоцитами и/или ПКС либо GSK-3β, например, как указано выше, у субъекта, нуждающегося в таком лечении, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

1.2. Способ профилактики или лечения острого или хронического отторжения трансплантата или опосредованных Т-клетками воспалительных или аутоиммунных заболеваний, например, как указано выше, у субъекта, нуждающегося в таком лечении, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

2. Соединение формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли для применения в качестве фармацевтического препарата, например, в любом из способов, как указано в пунктах 1.1 и 1.2 выше.

3. Фармацевтическую композицию, например, для применения в любом из способов, как в пунктах 1.1 и 1.2 выше, включающую соединение формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли в сочетании с его фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

4. Соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль для использования при приготовлении фармацевтической композиции для применения в любом из способов, как указано в пунктах 1.1 и 1.2 выше.

Соединения формулы I могут применяться в виде монокомпонентного активного ингредиента или в комбинации с другими лекарственными препаратами в схемах иммуномодуляции или с другими противовоспалительными агентами, например, для лечения или профилактики острого или хронического отторжения алло- или ксенотрансплантата или воспалительных либо аутоиммунных нарушений. Например, их можно использовать в комбинации с циклоспоринами или аскомицинами или их аналогами либо производными, обладающими иммунодепрессивными свойствами, например циклоспорином A, ISA T×247, FK-506, ABT-281, ASM 981, с ингибитором mTOR, например рапамицином, 40-O-(2-гидрокси)этилрапамицином, CCI779, АВТ578 или рапалогом, например АР23573 и т.п., с кортикостероидами, циклофосфамидом, азатиопреном, метотрексатом, агонистом рецептора EDG, обладающим свойствами ускорения хоминга лимфоцитов, например FTY 720 или его аналогом; лефлуномидом или его аналогами, мизорибином, микофеноловой кислотой, мофетилмикофенолятом, 15-дозоксиспергуалином или его аналогами, иммунодепрессивными моноклональными антителами, например, моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например МНС, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD 27, В7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM), OХ40, 4-1BB и их лигандам, например CD154, или другими иммуномодулирующими соединениями, например рекомбинантными связывающими молекулами, включающими по меньшей мере часть экстрацеллюларного домена CTLA4 или его мутанта, например по меньшей мере экстрацеллюларную часть CTLA4 или его мутанта, связанную с последовательностью белка не-CTLA4, например CTLA4Ig (например обозначаемую АТСС 68629) или его мутанта, например LEA29Y, либо другими ингибиторами молекулы адгезии, например mAbs (моноклональными антителами) или низкомолекулярными ингибиторами, включая антагонисты LFA-1, антагонисты селектина и антагонисты VLA-4. Соединения формулы I могут также применяться вместе с антипролиферативным лекарственным препаратом, например химиотерапевтическим лекарственным препаратом, например таким, как используют при лечении рака, включая без ограничения перечисленным ингибиторы ароматазы, антиэстрогены, ингибиторы топоизомеразы I, ингибиторы топоизомеразы II, агенты, активные в отношении микротрубочек, алкилирующие агенты, ингибиторы гистондезацетилазы, ингибиторы фарнезилтрансферазы, ингибиторы СОХ-2, ингибиторы ММР, ингибиторы mTOR, противоопухолевые антиметаболиты, соединения платины, соединения, снижающие активность протеинкиназы, и другие антиангиогенные соединения, агонисты гонадорелина, антиандрогены, бенгамиды, бисфосфонаты, антипродиферативные антитела и темозоламид, или с антидиабетическим лекарственным препаратом, стимулятором секреции инсулина или соединением, усиливающим секрецию инсулина, например сульфонилмочевиной, например толбутамидом, хлорпропамидом, толазамидом, ацетогексамидом, 4-хлор-N-[(1-пиролидиниламино)карбонил]-бензолсульфонамидом (гликопирамидом), глибенкламидом (глибуридом), гликлазидом, 1-бутил-3-метанилилмочевиной, карбутамидом, глибонуридом, глипизидом, глисоксепидом, глибутиазолом, глибузолом, глигексамидом, глимидином, глипинамидом, фенбутамидом или толилцикламидом, пероральным производным инсулинотропного агента, например быстродействующим стимулятором инсулина, например меглитинидом, репаглинидом, производным фенилуксусной кислоты, например натеглинидом, ингибитором DPP IV, например 1-{2-[(5-цианопиридин-2-ил)амино]этиламино}ацетил-(2S)-циано-пирролидин дигидрохлоридом, LAF237, GLP-1 или аналогом агониста GLP-1, либо агентом, повышающим чувствительность к инсулину, например агонистом активируемого пероксисомным пролифератором рецептора γ (PPARγ), например глитазоном, агентом неглитазонового типа, таким как аналог N-(2-бензоилфенил)-L-тирозина, например GI-262570, или оксолидиндионом, например JTT501, двойным агонистом PPARγ/PPARα, например DRF-554158, NC-2100 или NN-622, агонистом рецептора ретиноида Х или рексиноидом, например 2-[1-(3,5,5,8,8-пентаметил-5,6,7,8-тетрагидро-2-нафтил)-циклопропил]-пиридин-5-карбоновой кислотой, 4-[(3,5,5,8,8-пентаметил-5,6,7,8-тетрагидро-2-нафтил)-2-карбонил]-бензойной кислотой, 9-цис-ретиноевой кислотой или их аналогом, производным или фармацевтически приемлемой солью, при лечении диабета.

Согласно вышеизложенному, настоящее изобретение представлено в еще одном аспекте:

5. Способ, как определено выше, включающий совместное применение, например одновременное или последовательное, терапевтически эффективного количества ингибитора GSK-3β, ПКС или активации и пролиферации Т-клеток, например соединения формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, и второй лекарственной субстанции, причем вторая лекарственная субстанция представляет собой иммунодепрессант, иммуномодулирующий, противовоспалительный, антипролиферативный или антидиабетический лекарственный препарат, например такой, как указано выше.

6. Терапевтическая комбинация, например набор, включающий а) ингибитор GSK-3β, ПКС или активации и пролиферации Т-клеток, например соединение формулы I в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, и б) по меньшей мере один второй агент, выбранный из иммунодепрессанта, иммуномодулирующего, противовоспалительного, антипролиферативного и антидиабетического лекарственного препарата. Компонент а) и компонент б) могут быть использованы одновременно или последовательно. Набор может включать инструкции по применению.

Когда ингибитор GSK-3β, ПКС или активации и пролиферации Т-клеток, например соединение формулы I, вводят в сочетании с другим иммунодепрессантом/иммуномодулирующим, противовоспалительным, антипролиферативным или антидиабетическим терапевтическим препаратом, например, с целью профилактики или лечения острого или хронического отторжения трансплантата или воспалительных либо аутоиммунных нарушений, таких как определены выше в данном контексте, дозировки совместно применяемого иммунодепрессанта, иммуномодулирующего, противовоспалительного, антипролиферативного или антидиабетического соединения обязательно будут варьироваться в зависимости от типа используемого для совместного введения лекарственного препарата, например от того, является ли он стероидом или циклоспорином, от конкретного лекарственного препарата, который используют, от состояния, которое лечат, и т.д.

Соединения формулы I имеют интересный фармакокинетический профиль и интересные активности in vitro и in vivo.

Изобретение относится к соединениям формулы (I),

в которой R_a обозначает Н, СН₃ или изопропил, R_b обозначает Н, галоген, C_1-6алкокосигруппу или С_1-6алкил, и либо

I. R обозначает радикал формулы (б)

R₄ обозначает 1-пиперазинил, замещенный СН₃ в положениях 3 и/или 4, R_a отлично от Н или СН₃, когда R₄ обозначает 4-метил-1-пиперазинил; либо

III. R обозначает остаток формулы (в)

в которой R₁₄ обозначает 1-пиперазинил, необязательно замещенный СН₃ в положении 3; или 4,7-диаза-спиро[2.5]окт-7-ил, R₁₅ обозначает галоген, CF₃ или СН₃, R₁₅ отлично от СН₃, когда R₁₆ обозначает СН₃, R_a обозначает Н или СН₃, R_b обозначает Н, и R₁₄ обозначает 4-метил-1-пиперазинил, и R₁₆ обозначает Н, СН₃ или CF₃, R₁₆ отлично от Н, когда R₁₅ обозначает Cl, R_a обозначает Н или СН₃, R_b обозначает Н, и R₁₄ обозначает 4-метил-1-пиперазинил, либо

IV. R представляет собой радикал формулы (г)

в которой R₈ обозначает 1-пиперазинил, 3-метил-пиперазин-1-ил или 4-бензил-пиперазин-1-ил, либо

V. R представляет собой радикал формулы (д)

в которой R₉ обозначает 4,7-диаза-спиро[2,5]окт-7-ил или пиперазин-1-ил, замещенный в положении 3- этилом, или его соль, способу их получения, фармацевтической композиции на их основе и применению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний либо нарушений, опосредованных Т-лимфоцитами и/или ПКС. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Соединение формулы I

в которой R_a обозначает Н, СН₃ или изопропил,

R_b обозначает Н, галоген, C_1-6алкокосигруппу или C_1-6алкил, и либо

I. R обозначает радикал формулы (б)

в которой R₄ обозначает 1-пиперазинил, замещенный СН₃ в положениях 3 и/или 4, R_a отлично от Н или СН₃, когда R₄ обозначает 4-метил- 1-пиперазинил; либо

III. R обозначает остаток формулы (в)

в которой R₁₄ обозначает 1-пиперазинил, необязательно замещенный СН₃ в положении 3; или 4,7-диаза-спиро [2.5]окт-7-ил,

R₁₅ обозначает галоген, CF₃ или СН₃, R₁₅ отлично от СН₃, когда R₁₆ обозначает СН₃, R_a обозначает Н или СН₃, R_b обозначает Н, и R₁₄ обозначает 4-метил-1-пиперазинил, и

R₁₆ обозначает Н, СН₃ или CF₃, R₁₆ отлично от Н, когда R₁₅ обозначает Cl, R_a обозначает Н или СН₃, R_b обозначает Н, и R₁₄ обозначает 4-метил-1-пиперазинил, либо

IV. R представляет собой радикал формулы (г)

в которой R₈ обозначает 1-пиперазинил, 3-метил-пиперазин-1-ил или 4-бензил-пиперазин-1-ил, либо

V. R представляет собой радикал формулы (д)

в которой R9 обозначает 4,7-диаза-спиро[2,5]окт-7-ил или пиперазин-1-ил, замещенный в положении 3-этилом, или его соль.

в котором R_a и R_b имеют значения, как определено в п.1, с соединением формулы III

в котором R имеет значения, как определено в п.1,

и, в случае необходимости, превращение конечного соединения формулы I, полученного в свободной форме, в форму соли или наоборот.

Приоритет по пунктам: