СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОПРОТЕИНОВ ИЗ СЕМЯН ПОДСОЛНЕЧНИКА Российский патент 2008 года по МПК C07K1/14 A23J1/14 C07K1/30 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к получению липопротеинов из семян подсолнечника, и может быть использовано при изучении липопротеинового состава сырья в научно-исследовательских работах и промышленного получения в пищевой промышленности.

Известен способ получения липопротеинов из растительного сырья, включающий: диализ против 0.15 М NaCl, содержащего 1 мМ ЭДТА, затем добавление 50 мл смеси эфир-95%-ный этанол (1:3), экстракцию в течение двух часов при медленном вращении, центрифугирование при 2000 об/мин в течение 10 минут, повторную экстракцию, промывание осадка эфиром и высушивание в атмосфере азота (Практическая химия белка: Пер. с англ. / Под ред. А Дарбре. - М.: Мир, 1989. - 623 с., ил.).

Недостатком данного способа является длительность диализа, а следовательно, и длительность самого процесса получения готового продукта, использование эфира, который является сильно токсичным веществом, высушивание в атмосфере азота, что очень трудоемко в лабораторных условиях.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения липопротеинов (В.П.Ржехин, В.Н.Красильников. К изучению взаимодействия липидов с белковыми веществами. // Прикладная биохимия и микробиология. с.618-623, Москва, 1965). Методика включает обезжиривание семян, извлечение растворимых белковых веществ 0.2%-ным водным раствором NaOH, отделение нерастворимого остатка семян центрифугированием, добавление 40 г глицеридов или жирных кислот и смесь нагревали на водяной бане при 40°С в течение 3 часов в атмосфере азота при постоянном перемешивании. Затем содержимое колбы центрифугировали при 2000 об/мин.

Верхний слой, представляющий собой избыток не вступивших во взаимодействие липидов, тщательно отделяли от раствора, содержащего липопротеидный комплекс, который осаждали из раствора 0.1 н. соляной кислотой в изоэлектрической точке рН 4.6-4.8 и отделяли центрифугированием. Осадок перерастворяли в щелочном растворе и затем снова осаждали 0.1 н. раствором соляной кислоты. Осадок промывали водой и высушивали в вакуум-сушильном шкафу при 30°С.

Недостатком этого способа является длительность опыта, нагревание в атмосфере азота, неполное извлечение липопротеинового комплекса.

Задачей изобретения является разработка способа получения липопротеинов из семян подсолнечника с улучшенными качественными показателями, сокращение времени получения при упрощенном аппаратном оформлении.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение липопротеинового комплекса из семян подсолнечника, с повышенным содержанием белка, менее токсичного, уменьшение временного интервала.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения липопротеинов из семян подсолнечника, включающем обезжиривание измельченных семян подсолнечника, экстрагирование, разделение фаз центрифугированием, двукратное осаждение липопротеинового комплекса кислотой в изоэлектрической точке при рН=4.6-4.8, обработку щелочным раствором полученного осадка, промывку твердого остатка водой и сушку, экстрагирование обезжиренного остатка ведут трисглицинатным буфером при соотношении семена:буфер 1:16.7, затем настаивают в течение двух часов, центрифугирование проводят при 8000 об/мин в течение 15 минут, осаждают 0.1 н. раствором янтарной кислотой, обработка щелочным раствором, включающим трисглицинатный буфер, который включает додецилсульфат натрия при соотношении 1:(100-125), и сушат до остаточной влажности в продукте 6-8%.

Липиды обладают способностью образовывать с высокомолекулярными органическими соединениями (белками, углеводами) комплексы, входящие в состав мембран субклеточных компонентов клетки, которые создают оптимальные условия для окислительно-восстановительных процессов. Учитывая это, выбран подсолнечник, который является основным видом масличного сырья и одновременно высокобелковой культурой.

Очищенные семена подсолнечника измельчают для более эффективного протекания процесса обезжиривания, которое происходит под действием растворителя (гексана) на холоде. Обезжиривание проводят до полного удаления масла, при этом удаляются свободные липиды.

Обезжиренные семена подсолнечника обрабатывают трисглицинатным буфером (рН 8.3), содержащим детергент - додецилсульфат натрия, в соотношении (100:1 трисглицинатный буфер: додецилсульфат натрия). Настаивают в течение двух часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Использование трисглицинатного буфера обусловлено тем, что он обладает высокой буферной емкостью, мало токсичен, не образует комплексов с ионами металлов по сравнению с NaOH. Глицин, входящий в состав буфера, обладает таким свойством, как стабилизация диэлектрической проницаемости. Для извлечения природных липопротеинов из биомембран клеток применяют обработку детергентами. Используемый нами в качестве детергента додецилсульфат натрия участвует в высвобождении природных липопротеинов в нативном виде, то есть в таком виде, в каком они находятся в живой клетке в процессе ее жизнедеятельности. Додецилсульфат натрия очень мягко воздействует на структурные компоненты клетки и сохраняет их структуру. При этом солюбилизация мембранных структур клетки может быть достигнута обработкой материала детергентами, которые способны связываться как с белками биомембраны гидрофобными связями, так и одновременно своими гидрофильными полярными группами с молекулами воды. Взаимодействуя с молекулами белков в структуре липопротеинов, молекулы детергента упрощенно моделируют взаимодействие полярных липидов с белками. Додецилсульфат натрия образует выраженные мицеллярные структуры, по сравнению с другими детергентами, которые образуют лишь агрегаты из нескольких молекул. Солюбилизация клеточных мембран детергентом представлена на чертеже.

При невысоких концентрациях в растворе молекулы детергента разрыхляют структуру биомембраны, при повышении концентрации - молекулы детергента образуют с белками мембраны смешанные мицеллы, а при еще большей концентрации детергента белковые молекулы высвобождаются и переходят в раствор. Обработка детергентом, таким образом, заменяет липидное окружение белка или липопротеина в биомембране, представленное, в основном, полярными липидами - фосфолипидами, на окружение полярными молекулами детергента и позволяет, таким образом, «вырвать» липопротеин из биомембраны. Данная концентрация 2.5 г додецилсульфата Na на 250 мл трисглицинатного буфера (1:100) является наиболее оптимальной.

Для наиболее полного разделения жидкой фазы от хлопьевидной центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин. Липопротеиновый комплекс после обработки буфером с добавлением додецилсульфата натрия выпадает в виде мелких хлопьев. Полученный осадок обрабатывают 0.1 н. раствором янтарной кислоты для создания изоэлектрической точки рН 4.6-4.8. Указанный интервал рН обеспечивает достижение изоэлектрической точки, так как в этом положении белок обладает наименьшей растворимостью и наибольшей вязкостью, в результате чего происходит наиболее легкое осаждение белка из раствора.

Выбор янтарной кислоты обусловлен тем, что она является естественным метаболитом, участвует в процессе окислительного фосфорилирования цикла Кребса, протекающего при дыхании в живой клетке. В частности, является донором электронов и служит активатором биологических структур, потерявших свою жизненную активность. Янтарная кислота является природным консервантом и обладает комплексом физиологических свойств - способствует нейтрализации вредных веществ, то есть поддерживает процессы дезинтоксикации и выведения чужеродных веществ из живых систем.

Отделение осадка проводят путем центрифугирования в течение 15 минут при 8000 об/мин. Для получения наиболее достоверных результатов проводят повторную обработку трисглицинатным буфером и осаждение янтарной кислотой. После чего осадок промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу при 30°С до остаточной влажности 6-8%, что соответствует критической влажности при хранении масличных культур. Повышение температур не рекомендуется из-за инактивации ферментов. Высушенный материал является готовым продуктом. Совокупность проведенных операций обеспечивает получение липопротеинового комплекса с улучшенными характеристиками.

Заявляемый способ поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

15 г обезжиренных семян заливают 250 мл трисглицинатного буфера (рН 8.3), содержащего 2 г детергента - додецилсульфата натрия, то есть в соотношении (125:1 трисглицинатный буфер: додецилсульфат натрия). Настаивают в течение двух часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Затем разделяют фазы центрифугированием в течение 15 мин при 8000 об/мин. Полученный осадок обрабатывают 0.1 н. раствором янтарной кислоты до рН 4.0. Отделяют осадок путем центрифугирования в течение 15 минут при 8000 об/мин. Повторно обрабатывают трисглицинатным буфером и повторно осаждают янтарной кислотой. Осадок промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу при 30°С до остаточной влажности 6%.

Пример 2.

15 г обезжиренных семян заливают 250 мл трисглицинатного буфера (рН 8.3), содержащего 2.5 г детергента - додецилсульфата натрия, то есть в соотношении (100:1 трисглицинатный буфер: додецилсульфат натрия). Настаивают в течение двух часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Затем разделяют фазы центрифугированием в течение 15 мин при 8000 об/мин. Полученный осадок обрабатывают 0.1 н. раствором янтарной кислоты до рН 5.5. Отделяют осадок путем центрифугирования в течение 15 минут при 8000 об/мин. Повторно обрабатывают трисглицинатным буфером и повторно осаждают янтарной кислотой. Осадок промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу при 30°С до остаточной влажности 8%.

Пример 3.

15 г обезжиренных семян заливают 250 мл трисглицинатного буфера (рН 8.3), содержащего 2.2 г детергента - додецилсульфата натрия, то есть в соотношении (115:1 трисглицинатный буфер: додецилсульфат натрия). Настаивают в течение двух часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Затем разделяют фазы центрифугированием в течение 15 мин при 8000 об/мин. Полученный осадок обрабатывают 0.1 н. раствором янтарной кислоты до рН 5.5. Отделяют осадок путем центрифугирования в течение 15 минут при 8000 об/мин. Повторно обрабатывают трисглицинатным буфером и повторно осаждают янтарной кислотой. Осадок промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу при 30°С до остаточной влажности 6%.

Пример 4.

15 г обезжиренных семян заливают 250 мл трисглицинатного буфера (рН 8.3), содержащего 2.5 г детергента - додецилсульфата натрия, то есть в соотношении (100:1 трисглицинатный буфер: додецилсульфат натрия). Настаивают в течение двух часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. Затем разделяют фазы центрифугированием в течение 15 мин при 8000 об/мин. Полученный осадок обрабатывают 0.1 н. раствором янтарной кислоты для создания изоэлектрической точки при рН 4.6. Отделяют осадок путем центрифугирования в течение 15 минут при 8000 об/мин. Повторно обрабатывают трисглицинатным буфером и повторно осаждают янтарной кислотой. Осадок промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу при 30°С до остаточной влажности 6%.

Токсичность проверяли по проценту выживших тест-организмов Tetrachymena pyriformis. Качественные показатели липопротеинового комплекса, полученного по предложенному способу прототипа, представлены в таблице.

ТаблицаЛипопротеиновый комплекс, полученный по способуМассовая доля белков, %Массовая доля липидов, %Продолжительность способа получения, чТоксичность, %Прототип5530645Пример 15827456Пример 26522453Пример 36325458Пример 46820463

Экспериментальным путем доказано, что липопротеиновый комплекс, полученный в примере 4, обладает оптимальными характеристиками.

Предложенный способ позволяет получить липопротеиновый комплекс с повышенным содержанием белка, менее токсичный в сокращенное время при несложном аппаратном оформлении.

Изобретение относится к области биохимии, а именно к получению липопротеинов из семян подсолнечника. Семена подсолнечника измельчают, обезжиривают, экстрагируют и разделяют на фазы центрифугированием. Затем осуществляют двукратное осаждение полученного липопротеинового комплекса кислотой в изоэлектрической точке при рН=4.6-4.8, обработку щелочным раствором, промывку твердого остатка водой и сушку. Экстрагирование обезжиренного остатка ведут трисглицинатным буфером при соотношении семена:буфер 1:16.7, затем настаивают в течение двух часов. Центрифугирование проводят при 8000 об/мин в течение 15 минут, а осаждают 0.1 н. раствором янтарной кислотой. Сушку осуществляют до остаточной влажности 6-8%. Предлагаемый способ позволяет получить липопротеиновый комплекс из семян подсолнечника с повышенным содержанием белка, менее токсичный при уменьшении временного интервала. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Способ получения липопротеинов из семян подсолнечника, включающий обезжиривание измельченных семян подсолнечника, экстрагирование, разделение фаз центрифугированием, двукратное осаждение липопротеинового комплекса кислотой в изоэлектрической точке при рН 4.6-4.8, обработку щелочным раствором полученного осадка, промывку твердого остатка водой и сушку, отличающийся тем, что экстрагирование обезжиренного остатка ведут трисглицинатным буфером при соотношении семена: буфер 1:16.7 с последующим настаиванием в течение двух часов, центрифугирование проводят при 8000 об/мин в течение 15 мин, осаждают 0.1 н. раствором янтарной кислоты.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что обрабатывают щелочным раствором, включающим трисглицинатный буфер.3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что трисглицинатный буфер включает додецилсульфат натрия при соотношении 1:(100-125).4. Способ по п.1, отличающийся тем, что сушат до остаточной влажности в продукте 6-8%.