СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ E. COLI O157:H7 В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ ОТ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/10 C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/19 

Способ выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е.coli O157:Н7 в биологическом материале от животных.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано в лабораторной практике для выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е.coli O157:Н7 в биологическом материале.

До настоящего времени основным способом выделения и идентификации Е.coli O157:Н7 в ветеринарии является методика с применением специфических бактериофагов.

Сущность метода заключается в применении бактериофага для реакции нарастания титра фага (РНФ) с целью выделения и идентификации эшерихий серологической группы О157 в биологическом материале от павших животных и фекалиях ("Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины". Часть 1. Методы исследования в ветеринарной санитарии и экологии. Москва, 2004 г. - С.119-125).

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является способ выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е.coli O157:Н7, разработанный Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России (Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е.coli O157:Н7: Методические указания. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2001. - 28 с.).

Сущность метода заключается в использовании особенностей биохимических свойств данного микроорганизма (способность ферментировать сорбитол), при этом первоначальный посев производится на дифференциальную среду сорбитол-агара.

Основным недостаткам данного метода, затрудняющим его применение в ветеринарии, является различие микробного состава нормофлоры кишечника животных и человека, что не позволяет в качестве первичной среды использовать сорбитол-агар.

Задачей изобретения является разработка способа выделения и идентификации Е.coli O157:H7 в биологическом материале полученном от животных.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е.coli O157:H7, включающем в себя отбор биологического материала и посев на сорбитол-агар, согласно изобретению дополнительно для выделения Е. coli производят посев материала на среду Эндо, а для идентификации Е.coli O157:H7 от Shigella flexneri 1a 8516 производят посев на SDS-бульон.

Сущность изобретения заключается также в том, что выделенные изоляты Е.coli считают принадлежащими к сероварианту Е.coli O157:H7 в том случае, если колонии на сорбитол-агаре имеют бледно-розовый окрас и изменяют цвет SDS-бульона с зеленого на желтый.

Пример конкретного осуществления способа.

Этап 1. Дифференциация изолятов Е.coli на среде Эндо.

Входящие в состав нормофлоры кишечника животных микроорганизмы рода Proteus подавляют рост Е.coli O157:Н7, что препятствует ее выделению и идентификации в биологическом материале от животных. Были проведены исследования биологического материала (пробы кала) от животных и людей на наличие микроорганизмов рода Proteus (табл.). Из табл. видно, что процент выделения протея от сельскохозяйственных и мелких домашних животных составлял 8,32 и 15,08% соответственно, а от человека - 0,56%. Указанные выше результаты свидетельствуют о том, насколько биологический материал от животных загрязнен микроорганизмов рода Proteus.

Вид животныхКол-во животныхКол-во протея% выделения протеяКРС589498,32Коровы3854511,69Телята204188,82Мелкие домашние животные (общее)1792715,08Кошки79911,39Собаки1001818

Для сравнения исследовали 359 пробы кала от людей различного возраста, при этом процент выделения микроорганизмов рода Proteus составил 0,56%.

Поэтому для исключения контаминации колоний Е.coli ползучими формами микроорганизмов рода Proteus, биологический материал, взятый согласно "Методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных (Утвержденным Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ 27 июля 2000 г.)" предварительно вносят в чашку Петри со средой Эндо и инкубируют в термостате при температуре 37±1°С в течение 18-24 часов. На этой среде колонии эшерихий хорошо растут и имеют характерный металлический блеск.

Полученные результаты показывают отдельно изолированные колонии Е.coli выросшие на среде Эндо.

Этап 2. Дифференциация изолятов Е.coli O157:Н7 на сорбитол-агаре. Для дифференциации производят пересев выросших колоний с характерными для Е.coli морфологическими признаками (колонии круглые с гладкой, выпуклой поверхностью, ровными краями, диаметром 2-4 мм, красно-малинового цвета, с металлическим блеском или без него) на сорбитол Е.coli O157:Н7 агар и инкубируют в термостате при температуре 37±1°С в течение 18-24 часов.

Дифференциальная среда - сорбитол-агар (Питательная среда для выделения и дифференциации Е.coli O157:Н7 сухая) предназначена для выделения и дифференциации энтеробактерий, в частности кишечной палочки Е.coli O157:Н7, выделенной из питьевой и сточных вод, пищевых продуктов, а также из клинического материала по признаку ферментации сорбита. Питательная среда обеспечивает рост тест - штаммов: Escherichia coli O157:Н7, Escherichia coli 3912/41 (055:K59), Shigella flexneri 1a 8516, Salmonella typhimurium 79. При визуальном просмотре чашек колонии выглядят следующим образом: Е.coli 3912/41 (055:К59) в виде круглых колоний малинового цвета с неясно выраженным металлическим блеском или без него, диаметром 1,5-2,5 мм; S. typhimurium 79 в виде круглых колоний малинового цвета с металлическим блеском, диаметром 1,0-2,0 мм; Е.coli О157:Н7 в виде круглых прозрачных бесцветных или слабо-розовых колоний диаметром 1,5-2,5 мм; Shigella flexneri 1a 8516 в виде круглых прозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний, диаметром 1,0-1,5 мм.

После инкубации проводят отбор отдельно изолированных прозрачных или бледно-розовых колоний, которые относят к Е.coli O157:Н7 или к Shigella flexneri 1a 851.

Этап 3. Дифференциация сорбитол (+) Е.coli O157:Н7 от сорбитол (+) Shigella flexneri 1a 8516.

Круглые прозрачных бесцветные или слабо-розовые колонии (сорбитол (+) - реагирующие колонии) вносят в пробирку с 5 мл среды SDS-бульона и инкубируют в термостате при температуре 37±1°С в течение 6-12 часов.

Этап 4. Учет реакции.

Учет реакции проводят следующим образом: выделенные изоляты Е.coli считают принадлежащими к серовариантам Е.coli O157:H7 в том случае, если колонии на сорбитол-агаре имеют бледно-розовый окрас, а также изменяют цвет SDS-бульона с зеленого на желтый.

Таким образом, данная схема выделения и идентификации Е.coli O157:H7 в биологическом материале позволяет в течение 56 часов исследовать животное на бактерионосительство Е.coli O157:H7.

Данный способ выделения и идентификации Е.coli O157:H7 не требует специального оборудования и легко применим в условиях районной, городской и областной ветеринарных лабораторий.

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано в лабораторной практике для выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е.coli O157:H7 в биологическом материале. Способ предусматривает следующее. Отбирают пробы биологического материала. Затем осуществляют посев этих проб на среду Эндо и инкубируют в термостате в течение 18-24 часов. После чего осуществляют посев на сорбитол - агар и инкубируют в течение 18-24 часов. Затем дополнительно осуществляют посев на SDS-бульон с последующим анализом результатов. Изобретение позволяет повысить качество исследования биологического материала, сократить продолжительность исследований и упростить способ. 1 табл.

Способ выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е.coli O157:Н7 в биологическом материале от животных, предусматривающий отбор проб, посев на сорбитол-агар с последующим анализом результатов, отличающийся тем, что предварительно производят посев на питательную среду Эндо, а после посева на сорбитол-агар осуществляют посев на SDS-бульон, причем по бледно-розовой окраске колоний на сорбитол-агаре и изменению окраса SDS-бульона с зеленого на желтый судят о принадлежности микроорганизма к энтерогеморрагической кишечной палочке Е.coli O157:Н7.