СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ РАННЕЙ ФАРМАКОЦИТОКИНЕТИКИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ IN VITRO Российский патент 2008 года по МПК G01N33/15 G01N21/64 

Изобретение относится к области исследований и анализа взаимодействия фармацевтических препаратов с живыми культурами клеток с использованием сканирующей оптической конфокальной микроскопии, в частности, для исследования фармакоцитокинетики поступления, накопления и распределения окрашенного флуоресцентным красителем фармпрепарата в живых клетках.

Известен способ, основанный на осмотре тканей в зоне эпителизации и определении наибольшего размера между краями нарастающего эпителиального пласта [1].

Недостатком способа является его относительно узкая область применения, поскольку он не позволяет исследовать динамические изменения в клетках тканей, в частности в зоне эпителизации.

Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому является способ исследований структуры клеток тканей и их органоидов, основанный на использовании конфокальной микроскопии, в соответствии с которым клетки тканей предварительно окрашиваются люминесцентным (флуоресцирующим) красителем с дальнейшим их конфокальным сканированием [2].

Недостатком наиболее близкого решения является относительно узкая область применения, поскольку способ не позволяет исследовать взаимодействие фармпрепаратов с живой клеткой, в частности тестирование фармакоцитокинетики.

Требуемый результат заключается в расширении области применения.

Требуемый результат достигается тем, что по способу, основанному на прижизненном конфокальном сканировании клеток в культуре, сканирование осуществляется при добавлении к живой культуре фармпрепарата, либо обладающего собственным спектром флуоресценции в видимой области, либо окрашенным флуоресцентным красителем [6].

Этот способ можно использовать и для изолированных из тканей организма клеток, и для нефиксированных гистологических срезов, если такие удается изготовить, не нарушая жизнеспособности клеток [7].

Способ позволяет быстро (в течение 1-2 часов) тестировать фармакоцитокинетику поступления, накопления и распределения окрашенного флуоресцентным красителем препарата в живых клетках при помощи конфокальной микроскопии в режиме реального времени (Time lapse) и ответить на вопрос, является ли исследуемое вещество (сложный комплекс) перспективным для решения тех или иных медицинских задач [3, 4].

Альтернативный метод изучения биологического эффекта фармпрепаратов in vitro - МТТ тест - позволяет определить концентрацию цитотоксического агента, необходимую для того, чтобы половина клеток в живой культуре погибла (IC₅₀). Ограничением этого давно известного метода являются, во-первых, возможность рассчитывать лишь токсическую ингибирующую рост и пролиферацию клеток дозу препарата, во-вторых, длительность каждого эксперимента - на проведение МТТ теста требуется 4 дня.

Исследование фармакоцитокинетики поступления, накопления и распределения окрашенного флуоресцентным красителем препарата на живых культурах клеток может быть проведен с использованием метода конфокальной микроскопии в режиме реального времени (Time lapse), например, с шагом в 30 секунд, получая серию микросрезов. Для этого используется любой конфокальный микроскоп, например Leica TSC SP2 AOBS DMIRE.

На графических изображениях представлены:

на фиг.1 - ранняя (20 минут) фармакоцитокинетика липосомальных препаратов доксорубицина на примере клеточной линии карциномы молочной железы T47D, конфокальное сканирование в режиме Time lapse (фиг.1, а - водный раствор доксорубицина, справа - последний слайд в серии сканирований, на котором показано количество поступившего в клетки препарата, слева - график скорости поступления препарата в клетки, фиг.1, б то же для доксорубицина, инкапсулированного в стерически стабилизированные липосомы (ССЛ-Dox), фиг.1, в - то же для доксорубицина, инкапсулированного в антиген-направленные липосомы (АТЛ-Dox));

на фиг.2 - ранняя (20 минут) фармакоцитокинетика липосомальных препаратов доксорубицина на примере клеточной линии аденокарциномы молочной железы MCF-7, конфокальное сканирование в режиме Time lapse (фиг.2, а - водный раствор доксорубицина, фиг.2, б - ССЛ-Dox, фиг.2, в - АТЛ-Dox);

на фиг.3 - ранняя (20 минут) фармакоцитокинетика липосомальных препаратов доксорубицина на примере клеточной линии аденокарциномы молочной железы MDA-MB-435S, конфокальное сканирование в режиме Time lapse (на фиг.3, а - водный раствор доксорубицина, на фиг.3, б - ССЛ-Dox, на фиг.3, в - АТЛ-Dox.);

на фиг.4 - ранняя (15 минут) фармакоцитокинетика димегина в комплексах с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ), конфокальное сканирование в режиме Time lapse (фиг.4, а - начало сканирования димегин-КМЦ - JC-1, фиг.4, б - конец сканирования димегин-КМЦ - JC-1);

на фиг.5 - фототоксический эффект водных растворов и комплексов с полимером карбоксиметилцеллюлозой (фиг.5, а - димегина, фиг.5, б -фотодитазина).

Предложенный способ реализуется следующим образом.

Культура живых клеток, растущая в виде монослоя на поверхности пластика, рассеивается на специальные чашки Петри 35 мм, имеющие стеклянное дно для создания возможности пользования объективами инвертированного микроскопа с большим увеличением, например, 20-40-кратным. В зависимости от скорости пролиферации клетки рассеиваются в концентрации 10⁵-2×10⁵, поскольку идеальное время для того, чтобы брать их в опыт - 24-36 часов, и лучше, если к этому времени плотность культуры приближается к монослою.

Перед постановкой на столик микроскопа чашки Петри с живой культурой ее следует промыть PBS рН 7.4 2-3 раза для удаления фона флуоресцирующих агентов из среды и сыворотки.

Сканирование проводится с шагом в 20-30 секунд на разных полосах (диапазонах длины волны) поглощения-эмиссии одного лазера либо одной полосе двух или трех лазеров. Первый канал представлят собой поглощение-эмиссия фармпрепарата, второй-третий - поглощение-эмиссия вспомогательных флуоресцентных агентов (моноклональных антител, китов, зондов, показывающих наличие определенного биологического эффекта). Количество одновременно сканируемых диапазонов длин волн определяется количеством вспомогательных флуоресцентных агентов, но обычно не должно быть больше трех-четырех, поскольку в прижизненном Time lapse no сравнению со сканированием фиксированных в метаноле-параформальдегиде препаратов расхождение полос снижается так же, как качество изображения. Культуры инкубируются с изучаемым препаратом в течение 10-25 мин в условиях подогрева до 37°С при помощи термостатируемого столика непосредственно под объективом микроскопа. В этом случае при конфокальном сканировании можно определить как количество, так и скорость входа препарата в клетки.

Шаг при этом способе конфокального сканирования не должен быть слишком частым, чем больше суммарное время сканирования, тем реже должен быть шаг. Лучше, если он составляет не менее 30 секунд, поскольку при освещении лазером происходит достаточно сильное выжигание «прозрачных» для него клеток и они гибнут достаточно быстро. В случае если клетки в культуре погибли при сканировании, невозможно получить объективные данные по фармакоцитокинетике исследуемого препарата, поскольку количество и скорость его входа будут совершенно другими, чем в живых клетках. При медицинском применении препарата его фармакоцитокинетика воспроизводится в условиях прижизненного конфокального сканирования при добавлении к культуре клеток.

Как контроль можно использовать флуоресцентную микроскопию на инвертированном микроскопе с цифровой охлаждаемой камерой при помощи 40х объектива с водной иммерсией в режиме реального времени (Time lapse) с шагом в 10-20 секунд, получая серию микрофотографий фармакоцитокинетики доставки препаратов в клетки [5].

Пример 1. Определение активности противоопухолевых препаратов.

Конфокальное сканирование выполнено следующим образом.

Культуру клеток в чашке Петри 35 мм со стеклянным дном с 1 мл р-ра PBS рН 7.4 или р-ра Хенкса помещали на столик микроскопа, выставляли параметры Time lapse: продолжительность, шаг, длину волны для лазера при сканировании. В нашем случае эти параметры были: время сканирования - 20 минут, шаг - 20 секунд, лямбда для доксорубицина - возбуждение аргоновый лазер 488 (540) нм, эмиссия 580-595 нм, для окрашенных FITC моноклональных антител возбуждение 488 (495) нм, эмиссия 520 нм). Далее начинали сканирование и вносили препараты доксорубицина (в данном случае различные лекарственные формы собственной разработки) в концентрации, приведенной по доксорубицину 10 мМ (10^-5 М) на 1 мл объема или 1 чашку Петри 35 мм.

По результатам изучения фармакоцитокинетики антиген-направленных и стерически стабилизированных липосомальных препаратов доксорубицина в сравнении с водным раствором цитостатика можно с уверенностью сказать, что приготовленные АТЛ-препараты обеспечивали гораздо более быструю доставку агента в клетки (фиг.1в, 2, в). На фиг.1, 2 и 3 слева представлены реконструкции сканирования по эмиссии 585 нм инкубированных с препаратами клеток линий T47D, MCF-7 и MDA-MB-43 5 S соответственно с водным раствором доксорубицина, с ССЛ-доксорубицином, с АТЛ-25-доксорубицином, а справа - графики кинетики входа в клетки того же препарата, рассчитанные при помощи программного обеспечения конфокальной микроскопии Leica Video Symulator Full Version. Графики представляют собой картину реальной скорости и количества поступления доксорубицина в живые клетки, по оси Х рассчитывается время в секундах, по оси Y - интенсивность флуоресценции. Когда кривая переходит в горизонтальную плоскость, это значит, что весь флуоресцентный агент или краситель попал в клетки и кинетика остановилась.

Из анализа графиков видно, что доксорубицин из водного раствора поступает в клетки постепенно путем диффузии через мембраны, ССЛ блокируют его поступление в первый момент и задерживают в дальнейшем (фиг.1,в, 2,в, 3,в), АТЛ-25 - резко вбрасывают агент в клетки, и он весь оказывается внутри за первые 5-8 минут инкубации (фиг.1в, 2в, 3в). Внимательное изучение фармакоцитокинетики липосомальных препаратов доксорубиципа позволяет нам сделать вывод о том, что эффективность антиген-направленных систем доставки противоопухолевых препаратов в большей степени зависит от уровня экспрессии рецептора-мишени в органах и тканях, клетки которых прошли злокачественную трансформацию и в меньшей - от того, является ли антиген-мишень интернализуемым.

Пример 1 иллюстрирует, как можно определить, будет ли работать новая лекарственная форма цитостатика (или новый цитостатик) на основании данных скорости ее попадания в клетки по сравнению с известными лекарственными формами или химиотерапевтическими препаратами.

Пример 2. Определение активности фотодинамических препаратов.

В примере 2 показано, как можно использовать метод изучения фармакоцитокинетики для определения рабочей дозы фармпрепаратов. Исследовали дозы фотодинамических агентов димегина, фотодитазина и фотосенса в комплексах с полимерами карбоксиметилцеллюлозой и поливиниловым спиртом по сравнению со свободными формами в водных растворах.

Конфокальное сканирование выполнено следующим образом.

Культуру клеток в чашке Петри 35 мм со стеклянным дном с 1 мл р-ра PBS рН 7.4, или р-ра Хенкса вносили кит для детекции гибели клеток (начальных фаз апоптоза) JC-1 (Invitrogen) в концентрации 10 мкг/мл и преинкубировали в CO₂-термостате при +37°С в течение 20 мин. Затем промывали культуру р-ром PBS или Хенкса и добавляли в условиях слабого рассеянного света фотодинамический агент либо его комплекс с полимером в различных концентрациях. Далее помещали чашку на столик микроскопа и выставляли параметры Time lapse. Для димегина эти параметры: продолжительность 15 мин, шаг 20 секунд, длина волны - возбуждение красный лазер 594 (628) нм, эмиссия 640-750 нм, для JC-1 - возбуждение 488 нм, эмиссия 520 нм, сдвиг при изменении митохондриального потенциала возбуждение 535 нм, эмиссия 590 нм. Для изучения активности фотодитазина и его полимерных комплексов параметры Time lapse те же, но для возбуждения используется гелий-неоновый лазер 633 нм или лучше инфракрасный мультифотонный, возбуждение 662 нм при эмиссии 680-750 нм.

Ранее методом МТТ для полимерных комплексов димегина и фотодитазина были экспериментально определены концентрации, необходимые для достижения фототоксического эффекта 50%-ной гибели (выживаемости) - IC₅₀ на культурах опухолевых клеток HBL-100 и Skov-3 (фиг.4, а, б), которые в дальнейших экспериментах служили контролем для тестирования фототоксического эффекта полимеров с покрытием этими агентами. Однако прижизненное конфокальное сканирование позволило находить дозы более быстро и точно.

Из полученных данных видно, что в комплексах, где молярное отношение полимера к фотодинамическому агенту достаточно высокое (а именно, агент нанесен на твердую пленку полимера и высушен на ней), происходит большой сдвиг минимальной дозы IC₅₀ - фототоксичности препарата - в сторону уменьшения дозы. Для димегина этот сдвиг 3-4-кратный: концентрация IC₅₀ 5·10^-6-10^-5 моль/л для водного раствора свободной формы и 1.5-2,5·10^-6 Моль/л для комплексов с полимерами. Сдвиг дозы фотодитазина в комплексах с полимерами еще выше - 10-20-кратный: уже при концентрациях 10^-7-2·10^-7 Моль/л комплексы фотодитазин-полимер вызывают гибель 50% клеток, при том что IC₅₀ водного раствора фотодитазина 5·10^-6-10^-5 Моль/л.

Таким образом, быстро и при условии наличия прибора - конфокального микроскопа - недорого можно определить, являются ли перспективными новые лекарственные формы цитостатиков, агентов для фотодинамической терапии.

Аналогично могут быть проведены исследования биологической активности иных фармпрепаратов, поскольку есть возможность проведения исследований фармакоцитокинетики для различных фармпрепаратов.

Список литературы

1. RU 2125828 C1, 1999.

2. Штейн Г.И. Конфокальная микроскопия. Школа-семинар «Конфокальная микроскопия в биологии и медицине. Москва-Звенигород, 2005, www.cytspb.rssi.ru.

3. Jan Schröder "FRAP: Analyse der Proteindynamik mit einem nicht-fluoreszierenden Protein" Leica Microsystems CMS GmbH, Mannheim and Truc N. Bui, Promega GmbH, Mannheim, 2006, in press, BIOspektrum http://www.elsevier.de.biospectrum/.

4. Wouters F.S., Verveer P.J., Bastiaens P.I.H. "Imaging Biochemistry Inside Cells" Trends in Cell Biol, 2001, 11(5):203-11.

5. Chudakov DM, Chepumykh TV, Belousov W, Lukyanov S, Lukyanov KA. "Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation" Traffic. 2006. Oct;7(10):1304-10.

6. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. "Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging" Trends Biotechnol. 2005 Dec; 23(12):605-13.

7. Добрынин Я.В. Исследование биологических свойств опухолевых клеток человека при кратковременном и длительном культивировании вне организма. Дисс. на соискание ст. д.б.н., Москва, 1970.

Изобретение относится к области исследований и анализа взаимодействия фармацевтических препаратов с живыми культурами клеток с использованием сканирующей оптической конфокальной микроскопии, в частности, для исследования фармакоцитокинетики поступления, накопления и распределения окрашенного флуоресцентным красителем фармпрепарата в живых клетках. Технический результат заключается в расширении области применения и достигается предложенным способом, основанным на прижизненном конфокальном сканировании клеток, обработанных фармпрепаратом, при анализе динамики изменений, происходящих в метаболизме и состоянии живых клеток и их структур, под действием поступающего и распределяющегося фармпрепарата. 5 ил.

Способ исследования фармакоцитокинетики фармацевтических препаратов in vitro, характеризующийся тем, что к живой культуре клеток добавляют фармацевтический препарат, обладающий собственным спектром флуоресценции в видимой области или окрашенный флуоресцентным красителем, и при необходимости, вспомогательные флуоресцентные агенты, такие как моноклональные антитела, киты, зонды, проводят сканирование в режиме реального времени методом прижизненной конфокальной микроскопии, получают серию микросрезов - сканирований, по которым определяют кинетику, скорость попадания препарата в клетки и степень его биологической активности.