Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека,используемый для культивирования вирусов Советский патент 1987 года по МПК C12N5/00 C12N7/00 

1

Изобретение относится к биотехнлогии и может быть использовано для накопления вирусной биомассы и приготовления вакцин.

Цель изобретения - получение -но- вого диплоидного штамма кожи и мышц эмбриона человека, используемого дл культивирования вирусов и обладающе го большей пролиферативкой активностью по сравнению с известным.

Штамм получают следующим образом

Кожно-мышечные лоскуты 8-недель- ного эмбриона, выделенного путем аборта от здоровой женщины 32 лет, в анамнезе которой нет онкологических, венерических, генетических заболеваний и врожденных аномалий, а также гепатита и туберкулеза, промывают физиологическим раствором для удаления крови, измельчают ножницам и проводят щадящую трипсинизацию. Далее клетки ресуспендируют в среде Игла MEM с 10%-ной сывороткой крупного рогатого скота (СКРС) и экспла тируют в 6 полуторалитровых матраса с концентрацией клеток 8-10 в 1 мл Сосуды с клетками инкубируют при , В первичной культуре монослой формируется в течение 5 сут, первый пассаж проводят на 6 сут, а все последующие - проводят по четкому графику 2 раза в неделю, так что интервал между пересевами клеток постоянно составляет 3 и 4 сут.

Полученный штамм, обладающий морфологической и культуральной стабильностью, обозначают М-22, Штамм М-22 хранится в Коллекции клеточных культур Института вирусологии им, Д.И.Ивановского под номером 2-3и характеризуется следующими признаками. I

Морфологические признаки,

В фазе становления культура характеризуется неоднородностью клеточного состава и представлена фибро- бластоподобными и эпителиоподобными клетками. К 4-5 пассажу культура становится мономорфной и состоит из фиб робластоподобных клеток. Лишь.с встулением в фазу старения вновь отмечаются клетки различной морфологии появляются полигональные и гипертрофированные клетки.

При обследовании гистологических препаратов культур в фазе активного роста, окрашенных гематоксилин-эозином, выявляют ядро овальной или удли

o

5

0

ненной формы, ориентированное вдоль длинной оси клеток, хроматин мелкозернистый, В цитоплазме и ядре специфических включений не наблюдается,

Электронномикроскопическое изучение штамма М-22 на уровне 28 пассажа показывает, что клетки представляют собой фибробластные образования, имеющие характерное для соматических клеток позвоночных субмикроскопическое строение. Б клетках хорошо развита сеть эндоплазматического ретикулума, состоящего из плоских или расширенных цистерн, усеянных многочисленными рибосомами. Удлиненные, вытянутые вдоль длинной оси клеток, ядра содержат одно, реже два, ядрышка и диффузный хроматин. Комплекс Гольджи представлен системой плоских цистерн и многочисленными мелкими везикулами. Округлые или овальные митохондрии имеют характерные для этого органоида строение. Матрикс митохондрий - 5 более электронноплотный по сравнению с гиалоплазмой, В цитоплазме клеток встречаются в умеренных количествах липидные капли, лизосомоподобные структуры, равноразмерные вакуоли. Клеточная поверхность относительно ровная, без многочисленных микроворсинок ,

Биологические признаки.

Время жизни штамма М-22 вне организма составляет 70 пассажей и складывается из трех фаз: становления - на уровнях 1-3 пассажей, активного роста - на уровнях 4-39 пассажей и старения - на уровнях 40-70 пассажей.

На уровнях 14, 15 и 16 пассалсей число популяционных удвоений составляет 1,61;1,68; 1,5 соответственно при использовании сыворотки крупного рогатого скота и 1,58; 1,6; 1,54 соответственно при использовании сыворотки телят.

Средняя для 14-16 пассажей в первом случае составляет 1,6, во втором - 1,57.

Время удвоения популяции при использовании обоих видов сыворотки 55 ч.

На уровнях 25-, 27, 28 пассажей число популяционных удвоений составляет 1,64; 1,82; 2,2 соответственно с СКРС, а с сывороткой телят - 2,2; 1,57; 1,37 (при средних - 1,88 и 1,71), время удвоения популяции 48 и 53 ч соответственно.

0

5

0

5

0

5

На уровне 40 пассажа число попу- ляционных удвоений (результаты представлены в той же последовательности) составляет 1,72 и 1,8, а время удвоения популяции 56 и 53 ч.

На уровне 50 пассажа число попу- ляционных удвоений при использовани обоих видов сыворотки составляет 0,76, а время удвоения популяции 91

При субкультивировании клетки от стекла отделяют 0,25% раствором трисина. Коэффициент рассева клеток в фазе активного роста составляет 1:2 - 1:3.

Среда культивирования: среда Игл MEM с 10% СКРС или сыворотки телят,

Кариологические признаки.

При анализе 4000 метафаз по 1000 метафаз на уровнях 12, 20, 32, 40 пассажей, установлено, что диплоидный набор хромосом имеют 89,7; 92,0; 89,7; 82,0% метафаз соответственно. Полиплоидные метафазы составляют 1,0; 2,3; 1,7; 1,6%, гипоп лоидные 9,2; 5,3; 6,9; 4,7%, гипер- плоидные - 0,1; 0,4;0,2; 0,1%, разрывы - 0,3; 0,5; 0,2; 0,2%, пробелы - 1,7; 0,5; 1,3; 0,3% - в той же последовательности.

Сведения о контаминации штамма.

При обследовании клеток штамма М-22 на стерильность (наличие грибо бактерий, микоплазм) получены отрицательные результаты на уровнях 10, 20, 24, 30, 33, 40 и 42 пассажей.

При исследовании культуральных жидкостей и самих клеток на уровнях 10, 20, 30 и 40 пассажей в чувствительных клеточных системах, а также в реакциях гемадсорбции не отмечено

наличие вирусов - контаминатов,

1

При обследовании клеток штамма М-22 на тех же уровнях пассажей в опытах на взрослых и сосунках белых мьшей, кроликах, морских свинках, куриных эмбрионах., иммунодепрессиро- ванных мышах линии СВА посторонних агентов не выявлено,

Онкогенная активность клеток штамма М-22 не выявлена и в опытах in vitro в органной культуре куриного эмбриона,

Изозимный спектр, в

Изучение изоферментов в клетках линии М-22 выявляет энзимограмму человека и Г6 ФДГ медленного типа,

Криоконсервация клеток.

5

5

Клетки штамма М-22 сохраняют жизнеспособность порядка 70% при консервировании в жидком азоте. Создан банк отконтролированных посевных клеток на уровне - 9 пассажа в количестве 157 ампул (по 6 миллионов клеток в каждой ампуле),

Чувствительность к вирусам, Штамм М-22 чув-ствйтелен к заражению вакцинными штаммами Сэбина вируса полиомиелита. Так титр типа I на уровне 16 пассажа равен7,741§ БОЕ/МЛ, а на уровне 20 пассажа - 7,71, соответствующие показатели для Птипа 7,60 и 7,75, а для III типа - 7,63 и 7,65,

Штамм М-22 чувствителен также к заражению вирусами из группы ECHO, Коксаки, рино, В частности, титр вируса ЕСКО-11 равен ТЦДго а рино - 7x10 TILUgo .

Использование Б1тамма М-22 иллюстрируется следующими примерами,

Пример 1, В культуральиый сосуд с диплоидными клетками кожи и мышц эмбриона человека М-22 на уровне 19 пассажа вводят 0,25%-ный раст-. вор трипсина, подогретого до 37 С, Через 7-10 с раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37°с; на 2-3 мин. После этого в него вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхиг ванием. заканчивают процесс отделения

5 клеток от стекла. Затем в клеточную взвесь добавляют среду роста - среда Игла ЖМ с 10% СКРС, и разливают на два сосуда. Эти культуры 20 пассажа инкубируют при 37°С в течение

3 сут до момента формирования плотного слоя, I

При заражении вирусом полиомиелита, штаммом Сэбина, типом I среду из

г культуральных сосудов сливают, клетки один раз промывают рабочим раствором Эрла и вводят вируссодержащую среду из расчета не более 1 БОЕ на клетку, В качестве поддерживающей

Q среды используют 0,3%-ный гидролизах лактальбумина на растворе Эрла, ph 7,5, Культуры инкубируют при З4 с. Сбор вируса проводят на 3-4 сут, Ви- руссодержащую жидкость хранят при

г -20°. Титр вируса определяют по методу образования бляшек при заражении первичной культуры клеток почек африканских зеленых мартьштек. Титр вируса равен 7,71 Ig БОЕ/мл,

0

513

Пример 2, Клетки штамма М-22 на уровне 20 пассажа получают и заражают вирусом полиомиелита штаммом Сэбина, типом II по способу,, описанному в примере.. При этом титр вируса составляет 7,75 Ig БОЕ/мл. П р и м е р 3„ ТСлетки штамма М-22 на уровне 20 пассажа получают и заражают вирусом полиомиелита, штаммом Сэбина, типом III по способу, описанному в примере 1 , При этом титр вируса равен 7,65 Ig БОЕ/мл,

ПримерА Клетки штамма М-22 на уровне 25 пассажа получают, как указано в примере 1, только используют клетки 24 пассажа и заражают вирусом ЕСНО-П из расчета 1 БОЕ на клетку. Культуры инкубируют при 37 С сбор вируса проводят через 5 дней

16

после заражения, затем определяют его титр, который равен 10 ТЦД. Пример5„ Клетки линии М-22 на уровне 25 пассажа получают, как

указано в примере 4, и заражают рино вирусом из расчета 2-3 БОЕ на 1 клетку. Культуры инкубируют при 37 С, сбор вируса проводят через 5 дней после заражения, затем определяют

его титр, который равен 7x10 ТЦД.

Формула изобретения

Штамм диплоидных клеток кожи и ivibnun; эмбриона человека № 2-3-2 (Коллекция клеточных культур Института вирусологии им. Д.И.Ивановского), ис- пользуемьш для культивирования вирусов .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для накопления вирусной биомассы и приготовления вакцин-. Целью изобретения является получение нового диплоидного штамма кожи и мьшц эмбриона человека, используемого для культивирования вирусов. Штамм получают трипсинизацией кожно-мьшечных лоскутов 8-недельного эмбриона человека и адаптацией полученных клеток к стабильным условиям культивирования. Штамм обозначают , он хранится в Коллекции клеточных культур Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером 2-3-2. Время жизни штамма М-22 вне организма составляет 70 пассажей. Среднее число популяционных удвоений на 14-16 пассажах составляет 1,6 при исполь зова- нии сыворотки крупного рогатого скота и 1,57 при использовании сьгеорот- ки телят на уровне 25-28 пассажей 1,88 и 1,71. на уровне 40 пассажа 1,8 и ,72 соответственно. На уровнях 12, 20, 32 и 40 пассажей установлено, что диплоидный набор хромосом имеют 89,7; 92,0; 89,7 и 82,0% клеток соответственно. Штамм не кон- таминирован грибами, бактериями, ми- коплазмой и онкогенными вирусами. Титры вирусов при культивировании на клетках штамма М-22 имеют следующие значения: вирус полиомиелита, штамм Сэбина, типы I, II, III, 7,71 Ig БОЕ/МЛ, 7,75 Ig БОЕ/мл и 7,65 Ig БОЕ/МЛ соответственно. Титр вируса ЕСНО-11 равен Tlffljo. Титр риновируса равен 7 10 ТЦД. i (Л С