Способ выделения из воды вирусов Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для извлечения неопределимо малых количеств вирусов из больших объемов воды и их концентрирования до уровня чувствительности вирусологических методов при осуществлении контроля за степенью зараженности вирусами водных объектов окружающей среды.

Известен метод выделения вирусов путем удаления воды из пробы через диализную мембрану с полиэтиленгликоль (гидроэкстракция). Однако этот метод можно использовать лишь при работе с малыми объемами.

Известен способ выделения вируса гепатита А и энтеровирусов из больших объемов сточной и природной воды, включающий двухэтапное концентрирование вирусов методом сорбции на бетоните и ультрацентрифугирование элюата на заключительном этапе.

Достоинством этого способа является малая зависимость его эффективности от степени загрязнения воды взвешенными веществами. Однако большая длительность и сложное аппаратурное оформление метода затрудняют его применение в лабораторной практике.

2

ю

СА СО СО

Известен способ выделения вирусов из воды с использованием пористых кремнеземов.

К недостаткам этого способа относятся невысокая скорость обработки воды и низкий фактор концентрирования.

Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения вирусов из воды путем их сорбции на положительно заряженных фильтрах Zeta Plus 30S с последующей элюацией 3%-ным мясным экстрактом и рН 9,0. Этот способ имеет следующие недостатки:

- низкий фактор концентрирования (2,5 - 4,5 раза) и малая эффективность открытия ((14,1 ±4,1)%);

-достигнутого фактора концентрирования оказывается недостаточно для анализа и приходится прибегать к гидроэкстракции с полиэтиленгликолем, занимающей порядка 8 ч (ночь).

Цель изобретения заключается в повышении производительности процесса и увеличении фактора концентрирования вируса.

Поставленная цель достигается тем, что анализируемую воду пропускают через фильтр-адсорбент, представляющий собой пространственно-глобулярную структуру (ПГС) из меламиноформальдегидной смолы с проницаемостью материала ЮООуд.об./ч. (Удельный объем (уд. об.) - безразмерная величина, численно равная объему пропущенного фильтрата, отнесенному к объему адсорбента. Проницаемость материала измерялась в уд. об./ч и определялась, как количество уд. об., пропущенных за 1 ч через слой адсорбента толщиной 0,5 см при давлении 0,1 атм (1 м вод, ст.). Сорбированный вирус элюируют буферным раствором, содержащим 0,5 - 1,0 моль NaCI, 3,0 - 3,5% мясного экстракта и имеющим рН 7,5.

Сущность изобретения заключается в выборе адсорбента, обеспечивающего быстрое и эффективное выделение вирусов из воды, и в условиях десорбции вирусов,

Структура адсорбента получается путем коагуляции полимерной фазы в растворе в статических условиях в герметичной форме с последующей фиксацией двухфазной системы термообработки. Положительный эффект изобретения определяется большой внутренней поверхностью адсорбента, доступной для взаимодействия с вирионами, и незначительным гидродинамическим сопротивлением материала адсорбента. При выборе оптимальных условий элюции вирусов учитывают необходимость устранения электростатических и гидрофобных взаимодействий, возникающих между вирусной частицей и внутренней поверхностью фильтра-адсорбента.

В качестве примеров рассматривают процессы выделения вирусов из воды,

Пример (по прототипу). Ротавирус

человека II подгруппы вносят в 250 мл воды, создавая концентрацию 1,3 104 1/мл. Полученную воду пропускают через фильтр Zeta Plus 30S (с размером пор 2 мкм) диаметром

47 мм. Во всех пробах фильтрата вирус не выявлялся, адсорбция вируса 100%. Для элюции вируса используют 3 %-ный мясной экстракт с рН 9,0. Отбирают 10 мл элюата. Концентрация вируса в элюате (4,6 ± 1,3).104

1/мл. Таким образом, фактор концентрирования в данном случае составил всего 2,5 - 4,5 раза, а эффективность открытия - (14,1± 4,1)%. Из-за низкого фактора концентрирования приходится прибегать к гидроэкстракции с полиэтиленгликолем, занимающей порядка 8 ч (ночь).

Пример 2 (по предлагаемому способу). Ротавирус обезьян SA-II осветляют центрифугированием при 2000 об/мин в

течение 10 мин и добавляют в воду, содержащую 0,005 моль MgCl2, создавая концентрацию 118 АГед/мл (по данным иммуноферментного анализа. По 3 л такой воды пропускают через фильтр-адсорбент с

проницаемостью материала 1000 уд. об./ч, выполненный в виде таблетки диаметром 1,7 см и толщиной 0,5 см (объемом чуть более 1 мл с площадью поверхности 2,3 см2). Скорость пропускания воды 30 мл/мин

(1700 уд.об./ч). Во всех пробах фильтрата вирус не выявлялся, адсорбция вируса 100%.

Для элюции вируса с фильтра-адсорбента используют девять различных буферных растворов, содержащих 0,05 моль трис-HCI; 0,5, 0,7 или 1,0 моль NaCI; 3,0, 3,2 или 3,5% мясного экстракта (Beef extract, Dlfco) и имеющих рН 7,5. Элюат отбирают по 15-20

мл. Определяя всякий раз концентрацию вируса в исходном образце и в элюате, вычисляют фактор концентрирования и эффективность открытия вируса. Результаты представлены в таблице.

В данном случае эффективность открытия менялась от опыта к опыту в диапазоне 60-70% (погрешность определения порядка 10%), а фактор концентрирования - в диапазоне 680 - 700 раз. Таким образом,

можно говорить о слабой зависимости этих важных характеристик процесса выделения от концентрации NaCI и мясного экстракта в заявляемом диапазоне. Всякий раз операция выделения занимала 1 ч 45 мин.

Пример 3 (по предлагаемому способу).

Вирус полиомелита типа I, штамм LSc2ab осветляют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин и добав- ляют в воду, содержащую 0,005 моль MgCl2, создавая концентрацию 8,3 /мл определяемую титрованием на культуре клеток почек американских зеленых мартышек. 1 л такой воды пропускают через фильтр-адсорбент, выполненный в виде таблетки диаметром 1,7 см и толщиной 0,5 см. Скорость пропускания воды 30 мл/мин (1700 уд.об./ч). Для элюции вируса с фильтра-адсорбента используют буферный рас- твор, как в примере 2.

В данном случае фактор концентрирования 168 раз, а эффективность открытия - 27,7%. Вся операция заняла 34 мин.

Использование предлагаемого способа выделения из воды вирусов обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества:

- высокие скорости обработки воды, что существенно увеличивает производитель- ность процесса (не менее чем в 4 раза по сравнению с прототипом);

- высокий фактор концентрирования вируса (до 700 раз, что в 150 раз больше по сравнению с концентрированием на фильтрах Zeta Plus).

Использование изобретения возможно в лабораторной практике санитарно-эпидемиологических станций и подобных учреждений при осуществлении контроля за степенью зараженности вирусами водных объектов окружающей среды.

Влияние злюента на процесс выделения вируса SA-II из воды с помощью ПГС-адсорбента из меламиноформальдегидной смолы.

Формула изобретения Способ выделений из воды вирусов путем их сорбции на поверхности адсорбента с последующей элюцией, отличающий- с я тем, что, с целью повышения производительности процесса и степени концентрации вируса, в качестве адсорбента используют меламиноформальдегидную смолу с проницаемостью материала 1000 уд. о б./ч, а элюцию осуществляют буферным раствором рН 7,5, содержащим 0,5 -1,0 моль Nad и 3,0 - 3,5% мясного экстракта.

Способ выделения из воды вирусов. Использование извлечение неопределимо малых количеств вирусов из больших объемов воды и их концентрирования до уровня чувствительности вирусологических методов. Сущность изобретения: анализируемую пробу пропускают через фильтр-адсорбент, представляющий собой пространственно- глобулярную структуру из меламинофор- мальдегидной смолы с проницаемостью материала 1000 уд. об./ч. Сорбированный вирус элюируют буферным раствором, содержащим 0,5 - 1,0 моль М NaCI, 3,0 - 3,5% мясного экстракта и имеющим рН 7,5. (Л С

Влияние элюента на процесс выделения вируса SA-II из воды с помощью П ГС-адсорбента из меламиноформальдегидной смолы