Способ получения ротавирусных антигенов Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 A61K39/00 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной вирусологии, в частное ти к технологии получения антигенных препаратов.

Цель изобретения - повышение выхода биомассы ротавирусных антигенов.

Способ осуществляют следующим образом. В культуру клеток человека или животных, предварительно обработанную гидрокортизоном в дозе 0903-0,07 мг/мл среды в течение 2 ч} вносят ротави- рус в заражающей дозе 0,35 и инкубируют в термостате для накопления биомассы ротавируса в течение 48 ч. Затем клетки вместе с культу- ральной средой трижды замораживают и оттаивают, клеточный детрит осаждают центрифугированием, вируссодер- жащую надосадочную жидкость обрабатывают 1М НС1 до рН 4,0-5,0. В подкисленную надосадочную вирусеодержащую

-шдкость вносят 175 мг/л амикоэтокси- азросила для адсорбции ротавирусных антигенов, встряхивают 5 мкн, центрифугируют при 2 тыс. об/мин - 15 мин, после чего надосадох. уже не содержащий рогавируснкх антигенов, удаляют. К осадку, представляющему собой вирусный антиген, сорбированный частицами аминозтоксиаэросила, добавляют для злюции 0,05 трис-буйер (рН 8,2) в количестве 1% по отношению х исходному объему жидкости, встряхивают и освобождают от амино- этоксиаэросила центрифугированием при 2 тыс. об/мин - 15 минут, надоса- док - готовый продукт.

Пример 1, Получение актиге- ноз рэтавируса обезьян SA-11,

Бо взвесь клеток перевиваемой линии почки свиньи СПЭР в питательной среде (45% среды 199,4S% среды Игла

О

о

СЛ

1

и 10% сыворотки крупного рогатого скота) при посевной концентрации клеток 150 тыс/iin вносят 0,03 мг/мл гидрокортизона, а при посевной концентрации 200 тыс,, кл./мл - 0,07 мг/мл. Дозы глдроксргиаона ниже 0,03 мг/мл недостаточно эффективны, а выше 0S07 мг/мл приводят х угнетению репродукции рот вирусов в клеточных культурах (си. табл. 1). Обработанную взвесь клеток разливают и выращивают во вращз сщихся бутылях в устройстве для ролларпогс культигирования. На сформпроЕавлптпея черео 24 ч монослой клс гок, гфедв ри епьно отмытый от сыворотки раствором Эрлга (рН 7,6), наносят ротавирус обезьян SA-11 в дозе 0S25 1 ЦП э-0 / кл 6 3;- тем через 1 ч адсорбции вируса на клетках при 37 С 2 бутыли заливают поддерзшьающей средой следующего состава: 50% среды 199950% среды Игла, I пкг/мл трипсина.

После достижения максимального логопатического эфуекта через 48 ч 2 бутьши интенсивно встряхивают и переводят клетки тзг взвесъ, которую трижды замораживают и оттаивают, клеточные обломки удаляют центрифугированием

1

прн 2 тьс. оо/мин - 15 мин. Надосадок JQ сорбции вируса на клетках при 37 С

сгбирают, подкисляют Ml HC1 до рН 4,0- 5,0, вносят 17Ь мг/л аминозтоксиаэро- сипа5 встряхивают 5 пин на лаборатор-- ных шейкерах, TTOCJ e чего повторно

бутыли заливают поддерживающей сред следующего состава: 50% среды 199,5 среды Игла, 1 мкг/мл трипсина. После достижения максимального

0

5

ка, титр в РЧГ А антигена и выход конечного продукта, представлены в табл. 4.

Приме р 2. Получение антигенов ротавируса свиней, штамм К.

Во взвесь клеток перевиваемой линии почки свиньи СПЭВ в питательной среде (45% среды 199,45% среды Игла и 10% сыворотки крупного рогатого скота) при посевной концентрации клеток 150 тыс/мл вносят 0,03 мг/мл гидрокортизона, а при посевной концентрации 200 тыс.кл/мл - 0,07 мг/мл. Дозы гидрокортизона ниже 0,03 мг/мл недостаточно эффективны, а выше 0,07 мг/мл приводят к угнетению репродукции ротавирусов в клеточных культурах. Данные по подбору оптимальной дозы гидрокортизона приведены в табл. 5. Обработанную взвесь клеток разливают и выращивают во вращающихся бутылях в устройстве для роллерного культивирования. На сЛор- мировавшийся через 24 ч монослой клеток, предварительно отмытый от сыворотки раствором Эрла (рИ 7S6), наносят ротавирус свиней, штамм К в дозе 0,25 ТЦДео/кл. Затем через 1 ч адбутыли заливают поддерживающей средой следующего состава: 50% среды 199,50% среды Игла, 1 мкг/мл трипсина. После достижения максимального

Изобретение относится к медицинской ч ветеринарной BHpvconorHH, в частности к технологии получения антигенных препаратов, Цель изобретения - повышение выхода биомассы ро- (Тавирусных антигенов. Это достигается предварительной обработкой культуры клеток гидрокортизоном в количестве 0,03-0,07 мг/мл за 24 ч до заражения, а затем внесением вируса и после завершения его репродукции очисткой и концентрированием антигенов адсорбцией ча частипах сорбента - амино- этоксиазросила при кислых значениях рН 4,0-5,0 и элюпией при щелочных значениях рН 8,2. 12 табл.

центрифугируют при 2 тыс. об/мин в те-т,- цитопатического через 48 ч бучение Ь мин. Надосадок удаляют и элюнруют ротавирусные антигены 0,5М трис-буфером (рН ) в объем, составляющий i% от исходного.

Экспериментальные данные по влия- 40 нию рН реакционной среды на адсорбцию ротавпруса обезьян SA--1 1 представлены в табл. 2. Установлено, что 93,8% ротавируса адсорбируется на частицах аминоэтоксиазроспла при кислых значе- $ нкях рИ (4,0-5,0),

Дэнныз пс чзч-чениэ эгЬфективности элюции ротавируса обезьян SA-11 с аминоэтоксиа росила в зависимости от рН элюируюдего раствора представле-сп ны в табл. 3, Чаивысшеп элюирующей способностью оРлядае1 1 0505 М трис- буфср с рП 8,2.

CpaB iTiTajibnbir данныеs показываютыли интенсивно встряхивают и переводят клетки во взвесь, которую трижды замора кивают и оттаивают, клеточные обломки удаляют центрифугировали, ем при 2 тыс, об/мин - 15 мин. Надосадок отбирают, подкисляют Ш НС1 до рЧ 4,0-5,0, вносят 175 мг/л амино- этоксияоросила, встряхивают 5 мин на лабораторных шейкерах, после чего повторно центрифугируют при 2 тыс. об/мин - 15 мин. Надосадок удаляют и элюируют ротавирусные антигены 0,5Н трис-буйзером (рН 8,2) в объем, составляющий 1% от исходного.

Экспериментальные данные по влиянию рН реакционной среды на адсорбцию po rasupvca свиней, штамм К представлены в табл. 6. Установлено, что 93,8% ротавируса свиней, штамм К

гц-ге преимущества предложенного спос.о- адсорбируется на частицах аминоэток

сиаэросила при кислых значениях рЧ (4,0-5,0).

ба по сравнению с фототипом на этапах очистки ч концентрирования ротавируса обезьян SA-11 терис гикам

по таким харак- содержание белтыли интенсивно встряхивают и переводят клетки во взвесь, которую трижды замора кивают и оттаивают, клеточные обломки удаляют центрифугировалием при 2 тыс, об/мин - 15 мин. Надосадок отбирают, подкисляют Ш НС1 до рЧ 4,0-5,0, вносят 175 мг/л амино- этоксияоросила, встряхивают 5 мин на лабораторных шейкерах, после чего повторно центрифугируют при 2 тыс. об/мин - 15 мин. Надосадок удаляют и элюируют ротавирусные антигены 0,5Н трис-буйзером (рН 8,2) в объем, составляющий 1% от исходного.

Экспериментальные данные по влиянию рН реакционной среды на адсорбцию po rasupvca свиней, штамм К представлены в табл. 6. Установлено, что 93,8% ротавируса свиней, штамм К

адсорбируется на частицах аминоэток

сиаэросила при кислых значениях рЧ (4,0-5,0).

Данные по эЛбектичности элюции ротавируса свиней, штамм К с амино .этоксиаэроси. глписимостч от рН элюирующего раствора представлены в табл 7. Наивысшей элюирующей способностью обладает 0,05И трис-бутЬер с рН 8,2.

Сравнительные данные, показывающие преимущества предложенного способа по сравнению с известным на этапах очистки и концентрирования ротавируса свиней, штамм К по таким характеристикам, как объем, содержание белка, титр в РИГА антигена и выход конечного продукта, представлены в табл.8.

Пример 3. Получение антигенов jf элюирующего раствора представлены в

ротавирусов свиней, штамм Т.

Во взвесь клеток перевиваемой линии почки свиньи СПЭВ в питательной среде (45% среды 199,45% среды Игла

табл. 11. Наивыспей элюирующей способностью обладает 0,05М трис-бусЬер с РН 8,2.

Сравнительные данные, показывающи

сравнению с известным на этапах очистки и концентрирования ротавируса свиней, штамм Т по таким характеристикам как объем, содержание белка,

и 10% сыворотки крупного рогатого ско 20 преимущества предложенного способа по та) при посевной концентрации клеток 150 тыс.кл/мл вносят 0,03 мг/мл гидрокортизона, а при посевной концентрации 200 тыс.кл/мл - 0,07 мг/мл. Дозы

гидрокортизона ниже 0,03 кг/мл недо- 25 титр в РИГА антигена и выход конеч- статочно эффективны, а выше 0,07 мг/мл приводят к угнетению репродукции ро тавирусов в клеточных культурах. Данные по подбору оптимальной дозы гидрокортизона приведены в табл. 9. 30

гОбработанную взвесь клеток разливают и выращивают во вращающихся бутылях в устройстве для роллерного культивирования . На сформировавшийся че- 55 рез 24 ч монослой клеток, предварительно отмытый от сыворотки раствором Эрла (рН 7,6), наносят ротавирус свиней, штамм Т в дозе 0,25ТЦД5о/кл. Затем через 1 ч адсорбции вируса на 40 клетках при 37°С бутыли заливают поддерживающей средой следующего состава; 50% среды 199,50% среды Игла, 1 мкг/мл трипсина.

ного продукта, представлены в табл.12. Формула изобретения Способ получения ротавирусных антигенов, включающий выращивание рота- вирусов в клеточных культурах, их выделение из инфицированных клеток с последующей очисткой и концентрированием, обличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта5 в среду добавляют гидрокортизон в количестве О,03-0,07 мг/мл за 24 ч до заражения клеточной культуры, а очистку 5-: концентрирование осуществляют адсорбцией ротавирусного антигена на сорбенте при кислых значениях рП 4,0-5,0 с последующей элю- цией при щелочных значениях рН 8,2.

Т а б л и ц а 1

ВлияНИР доз гидрокоптизона на ин- фек тонный титр ротавируса обезьян

После достижения максимального цитопатического эффекта, через 48 ч бутыли интенсивно встряхивают и переводят клерки во взвесь, которую трижды замораживают F оттаивают, клеточ- ные обломки удаляют центрифугированием при 2 тыс. об./мин - 15 мин. . Надосадок отбирают, подкисляют 1М НС1 до рН 4,0-5,0, вносят 175 мг/л амино- этоксиаэросила, встряхивают 5 мин на лабораторных шейкерах, после чего повторно центрифугируют при 2 тыс. об/мин - 15 мин. Надосадок удаляют и элюируют ротавирусные антигены 0,5И

,

JQ

00546

трчс-буЛером (рН 8,2) в объем, составляющий 1% от исходного.

Экспериментальные данные по влиянию рН реакционной среды на адсорбцию ротавиоуса свиней, штамм Т представлены в табл. 10. Установлено, что 92% ротавир са свиней, штамм Т, адсорбируется на частицах амино- этоксиаэросила при кислых значениях рН (4,0-5,0),

Данные по эффективности элюции ротавируса свиней, штамм Т с амино- этоксиаэросила в зависимости от рН

табл. 11. Наивыспей элюирующей способностью обладает 0,05М трис-бусЬер с РН 8,2.

Сравнительные данные, показывающие

сравнению с известным на этапах очистки и концентрирования ротавируса свиней, штамм Т по таким характеристикам как объем, содержание белка,

преимущества предложенного способа по

титр в РИГА антигена и выход конеч-

ного продукта, представлены в табл.12. Формула изобретения Способ получения ротавирусных антигенов, включающий выращивание рота- вирусов в клеточных культурах, их выделение из инфицированных клеток с последующей очисткой и концентрированием, обличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта5 в среду добавляют гидрокортизон в количестве О,03-0,07 мг/мл за 24 ч до заражения клеточной культуры, а очистку 5-: концентрирование осуществляют адсорбцией ротавирусного антигена на сорбенте при кислых значениях рП 4,0-5,0 с последующей элю- цией при щелочных значениях рН 8,2.

Т а б л и ц а 1

ВлияНИР доз гидрокоптизона на ин- фек тонный титр ротавируса обезьян

Инфекционный титр ротавируса обезьян SA-11, Ч с ТЧЛм/мл

,5 5,0 6,3 7,0 7,0 7,0 6,0 1,0

Таблица

Влияние рП реакционной среды на адсорбцию ротавируса обезьян

рН реакционной среды

Таблица 3

Эффективность элюции ротавируса обезьян с амино- этоксиаэросила в зависимости от рН элюирующего раствора

Таблица Сравнительные характеристики биомассы продукта

Ротавирус обезьян SA-1 1 100

Ротавирус обезьян SA-11 100

Процент адсорбированного ротавируса обезьян SA-11, %

20

9,3

1:640

68,8

100

1,82

1 :204ЯО 11252

Т a б л и ц а 5 Влияние доз гидрокортизона на инфекционный титр ротавируса свиней

Доза гидрокортизона, мг/мл

Инфекционный титр ротавируса свиней,

Таблицаб

Влия-ние рН реализационной среды на адсорбцию ротавируса свиней

Процент адсорбированного ротавируса свиней, штамм К, %

3,5 4,0

75,0 ,93,8

Таблица Сравнительные характеристики биомассы продукта

Ротавирус ев иней, штамм К

100

Продолжение табл.6

Таблица 7

Эффективность элюции ротавируса свиней с аминоэтоксиаэросила в зависимости от рН элюируюп;его раствора

25

20

8,5

1 :640

75,2

Ротавирус свиней,

штамм К

100

Таблица)

Влияние доз гидрокортизона на ин- .фекционный титр ротавируса свиней

Инфекционный титр ротавируса свиней,

штамм Т,

TK Tin 50/мл

Таблица ТО

Влияние рН реакционной среды на адсорбцию ротавируса свиней

рН реакционной ср еды

Процент адсорбированного ротавируса свиней,

3S5 4,0

73 92

Продолжение табл.8

100

1,9

1:20480 10779

Продолжение табл.10

Та блица 11 Эфективность элюции ротавируса свиней с аминоэтоксиаэросила в зависимости от рН элюирующего раствора

Та блица 12 Сравнительные характеристики биомассы продукта

Ротавирус свиней, штймм Т

100

Ротавирус свиней, штамп Т

100

20

5,5

1 :320

58,

100

1,2

1:5120 4266,6