СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Российский патент 1994 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для прижизненной диагностики сибирской язвы путем обнаружения в периферической крови больных животных и бациллоносителей сибиреязвенного антигена.

Известен способ постмортального обнаружения возбудителя сибирской язвы в периферической крови павших животных путем микроскопирования (в световом и люминесцентном микроскопе) мазков крови, приготовленных из надреза уха и посевом крови на питательные среды с последующим выделением гемокультуры.

Однако при использовании известного способа обнаружить прижизненно возбудителя сибирской язвы в периферической крови больных животных и бациллоносителей не удается, поскольку бактериемия (появление в периферической крови возбудителя) наступает перед (агональная стадия) и после гибели животного (постмортально). Вместе с тем из области иммунологии известно, что возбудители болезней, попадая в организм животного, захватываются тканевыми макрофагами, перевариваются и в виде растворимого антигена передаются иммунокомпетентным клеткам (малым, средним и большим лимфоцитам и плазматическим клеткам), которые циркулируют в периферической крови. В связи с этим предполагают, что клетки системы мононуклеарных моноцитов (СМФ), нагруженные растворимым специфическим антигеном, могут быть выявлены путем конъюгирования их гомологичными мечеными антителами (флуоресцирующими сибиреязвенными глобулинами) с последующим иммуноцитолюминесцентным анализом мазков периферической крови.

Целью изобретения является разработка способа прижизненной диагностики сибирской язвы путем выявления в периферической крови больных сибирской язвой животных и бациллоносителей, специфического антигена, модулированного с иммунокомпетентными клетками.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу обнаружения растворимого сибиреязвенного антигена, включающего метод флоуресцирующих антител, отличающемуся тем, что с целью постановки прижизненного диагноза на сибирскую язву исследуют мазки периферической крови больных сибирской язвой животных и бациллоносителей и выявляют антигеносодержащие клетки по степени и характеру свечения их с индексом иммунофлуоресценции 0,2 - 0,4.

Сущность способа заключается в следующем. С соблюдением мер предосторожности у исследуемого животного прокалывают иглой ушную вену, первые капли удаляют тампоном и готовят по 8 - 10, тонких мазков крови на обезжиренных предметных стеклах. После подсушивания мазки фиксируют в метаноле в течение 15 мин, затем на мазки наносят рабочее разведение меченой ФИТЦ адсорбированной сыворотки и мазки помещают на 25 мин в термостат при 37 ±0,5^оС.

По истечении указанного времени мазки промывают дистиллированной водой, подсушивают фильтровальной бумагой и просматривают в люминесцентном микроскопе с использованием иммерсионной системы и нефлуоресцирующего масла. При этом в каждом мазке просматривают не менее 100 полей зрения. Антигенсодержащие клетки идентифицируют по характеру и интенсивности свечения клеток системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) : малых, средних, больших и гигантских лимфоцитов и плазматических клеток.

Для объективной оценки результатов иммуноцитолюминесцентного анализа выводят индекс иммунофлуоресценции (ИИ) путем деления числа светящихся клеток системы мононуклеарных фагоцитов на количество просмотренных полей зрения по формуле
ИИ = A/100 ,
где ИИ - индекс иммунофлуоресценции;
А - количество светящихся клеток системы мононуклеарных фагоцитов;
100 - количество просмотренных полей зрения.

При этом обнаруживают, что в мазках из периферической крови больных сибирской язвой животных выявляется повышенное количество малых, средних и больших лимфоцитов с "ободочным" свечением периферии клеток с индексом 0,2 - 0,4, в то время как иммунизированных против сибирской язвы и интактных животных индекс иммунофлуоресценции не превышает 0,01 - 0,08.

П р и м е р 1. 10 морских свинок заражают возбудителем сибирской язвы "Ч-7" в дозе ЛД₅₀. При этом часть больных погибает через 48 - 72 ч, часть животных переболевает в типичной форме, в часть - без проявления клинических симптомов (бациллоносители). Через 48, 72, 96, 120 ч у больных, выживших (бациллоносителей) и погибших, берут пробы крови и подвергают иммуноцитолюминесцентному анализу. Для сравнения параллельно проводят опыты по известному способу путем микроскопирования мазков в световом микроскопе и посева проб крови на питательные среды для выделения гемокультуры.

Сравнительные данные исследований по известному и предлагаемому способам приведены в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что по известному способу обнаружить прижизненно возбудителя в крови больных и носителей микроскопически (световая микроскопия) и бактериологически не удается, хотя после убоя у всех животных выделяется гемокультура (данные 6-й графы). В отличие от известного, результаты иммунолюминесцентного анализа (графа 4-я) полностью совпадают с результатами бактериологического исследования крови убитых животных (графа 6-я) о специфичности способа.

П р и м е р 2. 10 морских свиной заражают возбудителем сибирской язвы "Ч-7" в дозе ЛД₅₀. 10 иммунизируют противосибиреязвенной вакциной СТИ в дозе 0,2 см³, а 10 животных не заражают и не иммунизируют (интактные). Через 5 дней у выживших после заражения и иммунизации у всех животных берут кровь, готовят мазки и проводят иммунолюминесцентный анализ крови с выведением индекса иммунофлуоресценции. Одновременно проводят опыты по известному способу. Данные исследований приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что индекс иммунофлуоресценции у зараженных возбудителем сибирской язвы животных достоверно выше, чем у вакцинированных и интактных животных и данные МФА полностью совпадают с результатами бактериологических исследований органов и тканей животных после контрольного убоя.

Предлагаемый способ диагностики сибирской язвы путем обнаружения растворимого сибиреязвенного антигена в периферической крови животных по сравнению с известным позволяет прижизненно выявить больных сибирской язвой животных и бациллоносителей и дифференцировать инфекционный процесс от вакционного. (56) Ветеринарная лабораторная практика. М. : Сельхозиздат, 1963, т. 1, с. 268-275.

Использование : диагностика сибирской язвы, ветеринария. Сущность изобретения : у исследуемого животного берут кровь и наносят мазки на предметные стекла. Наносят специфическую меченую ФИТЦ адсорбированную сыворотку. Мазки просматривают в люминесцентном микроскопе. Антигенсодержащие клетки идентифицируют по характеру и интенсивности свечения клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Рассчитывают индекс иммунофлюоресценции путем деления числа светящихся клеток системы мононуклеарных фагоцитов на количество просмотренных полей зрения и при его значении 0,2 - 0,4 животных относят к больным. 2 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, включающий приготовление из исследуемого материала препарата, нанесение специфической меченной ФИТЦ адсорбированной сыворотки с последующей оценкой по количеству светящихся клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности прижизненной диагностики, в качестве исследуемого материала используют мазки периферической крови, дополнительно рассчитывают индекс иммунофлюоресценции и при его значении 0,2 - 0,4 животных относят к больным.