СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ АНДРОКЛИННЫХ РЕГЕНЕРАНТОВ ТРИТИКАЛЕ Российский патент 2009 года по МПК A01H4/00 C12N5/00 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале (Triticosekale Wittmack), полученных в культуре пыльников, без использования полиплоидизирующего агента (колхицина) и условий теплицы, за счет опыления смесью пыльцы константных селекционных сортов тритикале в полевых условиях.

Уровень техники

Известен способ получения растений-регенерантов пшеницы из пыльцы в культуре пыльников, включающий выделение колосьев донорных растений, у которых влагалище предпоследнего листа расположено на центральной части колоса, обработку колосьев пониженной температурой, вычленение пыльников, культивирование их на питательной среде, получение эмбриоидов и пересадку их на питательную среду для регенерации растений. Перед культивированием пыльников на питательной среде предварительно, по стимуляции роста корешков семян, определяют оптимальное для эмбриоидогенеза количество натриевой соли дихлорфенилуксусной кислоты, после чего соответствующее ее количество вносят в питательную среду в концентрации 0,25-1,0 мг/л (в зависимости от сорта) (см. а.с.SU №1650051, Кл. А01Н 4/00, C12N 5/00, опубл. 23.05.1991 г.).

Недостатком данного способа является трудоемкость подбора концентраций натриевой соли дихлорфенилуксусной кислоты, токсичность указанного вещества.

Известен способ восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале путем обработки растений 0,1%-ным водным раствором колхицина с добавлением ДМСО, гиббереллина и твина 80. При колхицинировании 365-ти растений погибло 165 регенерантов (45%). Из числа обработанных колхицином выход фертильных растений составил 11,2% (42 растения). Большинство регенерантов оказались химерными и, наряду с озерненными, имели полностью стерильные колосья. Озерненность колосьев составила от 1 до 48 зерен на колос. Число фертильных колосьев, образовавшихся у 42-х регенерантов - 73 шт., общее количество зерен - 1049 шт. (см. Егорова Т.В., Галушко Л.Э. Получение дигаплоидных растений тритикале методом колхицинирования // Биотехнология и селекция кормовых культур. - Ставрополь: Сб. научн. тр. СНИИСХ, 1990. - С.24-27).

Недостатком данного способа является сложность осуществления: наличие специально оборудованной лаборатории и квалифицированного персонала для работы с колхицином, высокая токсичность препарата, гибель регенерантов в процессе обработки, трудность подбора оптимальной дозы колхицина для оптимального увеличения плоидности, низкий уровень фертильности регенерантов.

Известен способ восстановления фертильности пшенично-ржаных амфигаплоидов при помощи опыления пыльцой константных селекционных сортов тритикале и обработкой раствором колхицина по методу Навашина-Веленсика. Опыление пшенично-ржаных амфигаплоидов, полученных в результате скрещивания сортов пшеницы Безостая 1, Мироновская юбилейная, Северокубанка и многолетней ржи Популяция 4, пыльцой тритикале Ставропольский 1 и Амфидиплоид 206 выявило низкую завязываемость семян. В среднем за 4 года она составила 0,21% с колебаниями по комбинациям от 0,09 до 0,5%, по годам - от 0,17 до 0,25%.

При введении колхицина в растения через корни из 38 пшенично-ржаных гибридов к уборке в полевых условиях сохранилось 5 растений, или 13,2%, остальные погибли на разных фазах развития. Только одно растение оказалось фертильным, которое при самоопылении образовало одну хорошо выполненную зерновку (см. Соколенко Н.И. Использование методов биологического и колхицинирования при получении новых форм тритикале на основе многолетней ржи Державина // Биотехнология и селекция кормовых культур. - Ставрополь: Сб. научн. тр. СНИИСХ, 1990. - С.119-128).

Недостатком данного способа является использование первичных амфигаплоидов, полученных в результате отдаленной гибридизации, низкая жизнеспособность полученных семян, сложность осуществления (наличие специально оборудованной лаборатории и квалифицированного персонала для работы с колхицином), высокая токсичность препарата, гибель регенерантов в процессе обработки, трудность подбора оптимальной дозы колхицина для оптимального увеличения плоидности, низкий уровень фертильности регенерантов.

Наиболее близким по технической сущности и достаточному положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале, включающий получение растений-регенерантов на искусственной питательной среде в культуре пыльников, восстановление их фертильности путем обработки растений 0,3% раствором колхицина при температуре 25°С в течение 5 часов с последующей адаптацией к нестерильным условиям в сосудах с раствором Кнопа, переносом регенерантов в емкости с почвенно-торфяной смесью для проведения их искусственной яровизации в течение 30-45 дней при температуре (+3)-(+5)°С в холодильной камере и получение семенного потомства колхицинированных регенерантов. У полученных растений при наличии высокой кустистости количество озерненных колосьев - 1-2 шт. Фертильность низкая - число нормальных пыльцевых зерен ниже, чем абортивных. Регенеранты, не прошедшие обработку колхицином, полностью стерильны. Во втором поколении (R₂) наблюдается низкая семенная продуктивность растений, связанная с несбалансированностью числа хромосом (см. Внучкова В.А., Чеботарева Т.М., Глушенко Г.И. Получение гаплоидов из пыльников тритикале и фертильного семенного потомства от них // С.-х. биология. - 1983. - 5. - С.20-24).

Недостатком данного способа является сложность осуществления (наличие специально оборудованной лаборатории и квалифицированного персонала для работы с колхицином), высокая токсичность препарата, гибель регенерантов в процессе обработки, трудность подбора оптимальной дозы колхицина для оптимального увеличения плоидности, низкий уровень фертильности регенерантов, низкая продуктивность растений в потомстве регенерантов.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка простого в применении и экологически чистого способа восстановления фертильности регенерантов тритикале, полученных в культуре пыльников.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого способа восстановления фертильности андроклинных регенерантов, сводится к упрощению способа, экологической чистоте, низкой стоимости, повышению эффективности использования ценных регенерантов, получению жизнеспособных рекомбинантов, имеющих селекционную ценность.

Технический результат достигается с помощью способа восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале, включающего получение растений-регенерантов на искусственной питательной среде в культуре пыльников с последующей адаптацией к нестерильным условиям в сосудах с раствором Кнопа, переносом регенерантов в емкости с почвенно-торфяной смесью для проведения их искусственной яровизации в течение 30-45 дней при температуре (+3)-(+5)°С в холодильной камере и получение семенного потомства стерильных регенерантов, при этом полученные в культуре пыльников растения-регенеранты дополнительно размножают in vitro путем отделения боковых побегов с последующим укоренением на искусственной питательной среде (микроклонирование), весной переносят в грунт, размещая в 1 ряд с площадью питания 45×45 см в массиве специально подобранных с учетом сроков наступления фазы цветения смеси сортов тритикале для свободного опыления.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что способ восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале включает получение растений-регенерантов на искусственной питательной среде в культуре пыльников с последующей адаптацией к нестерильным условиям в сосудах с раствором Кнопа, переносом регенерантов в емкости с почвенно-торфяной смесью для проведения их искусственной яровизации в течение 30-45 дней при температуре (-0)-(+5)°С в холодильной камере и получение семенного потомства стерильных регенерантов, при этом полученные в культуре пыльников растения-регенеранты дополнительно размножают in vitro путем отделения боковых побегов с последующим укоренением на искусственной питательной среде, весной переносят в грунт, размещая в 1 ряд с площадью питания 45×45 см в массиве специально подобранных с учетом сроков наступления фазы цветения смеси сортов тритикале для свободного опыления, таким образом, для преодоления стерильности андроклинных регенерантов тритикале, которая определяется мужской стерильностью, предлагается их микроклонирование in vitro, искусственная яровизация, адаптация к нестерильным условиям, перенос в поле, свободное опыление смесью пыльцы константных селекционных сортов.

Различия по срокам наступления фазы цветения у константных сортов тритикале увеличивает продолжительность периода опыления колосьев растений-регенерантов пыльцой сортов опылителей до 25 дней. Этот срок обеспечивает свободное опыление разновозрастных колосьев при большой кустистости - до 40 колосоносных побегов на растение. Наличие разнокачественной пыльцы, пролонгирование периода существования доступной пыльцы смеси сортов - опылителей обеспечивают максимальный эффект (наибольшее число зерновок в колосе) и успешное опыление всех колосьев растений-регенерантов. Способ отличается тем, что специально подбирают сорта тритикале-опылителя, различные по срокам наступления фазы цветения.

Создание жизнеспособных зигот происходит при свободном опылении за счет успешного оплодотворения с участием наиболее жизнеспособных пыльцевых зерен, при этом отличие состоит в том, что наблюдается увеличение запасов изменчивости полученного материала за счет кумуляции в гибридной зиготе мутаций и рекомбинаций (мутационные изменения возникают при культивировании in vitro, рекомбинации являются результатом слияния генетически разнородных гамет).

Испытания показывают, что увеличение количества растений-регенерантов одинакового генотипа благодаря микроклональному размножению in vitro и повышенной кустистости гаплоидных форм дает возможность эффективно восстанавливать фертильность регенерантов тритикале и в большом количестве получать семена от свободного опыления.

Использование предложенного способа восстановления фертильности позволяет сократить количество трудоемких, опасных для здоровья операций, избежать гибели большей части регенерантов и их мозаичности (применение колхицина) и, таким образом, более эффективно использовать андроклинные регенеранты тритикале в селекционном процессе тритикале.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале

Полученные в культуре пыльников регенеранты тритикале, после микроклонирования каждого растения путем отделения боковых побегов и укоренения на искусственной питательной среде в стерильных условиях с последующей адаптацией к нестерильным условиям в сосудах с раствором Кнопа, высаживают в емкости объемом 200 мл с почвенно-торфяной смесью для проведения искусственной яровизации в течение 30-45 дней при температуре (+3)-(+5)°С, весной переносят в грунт, размещая в 1 ряд с площадью питания 45×45 см в массиве специально подобранных с учетом сроков наступления фазы цветения смеси сортов тритикале для свободного опыления.

Пример 1. Регенеранты, полученные при культивировании пыльников озимой тритикале сорта МАД-1, размножают путем отделения побегов и укореняют в стерильных условиях на искусственной питательной среде. Укоренившиеся растения после адаптации к нестерильным условиям в сосудах с раствором Кнопа высаживают в емкости с почвенно-торфяной смесью для проведения искусственной яровизации в течение 30-45 дней при температуре (+3)-(+5)°С. Весной растения переносят в грунт, где размещают в 1 ряд с площадью питания 45×45 см в массиве сорта опылителя. Фазы колошения достигли 60% растений. Перед цветением 2 колоса каждого растения помещают под пергаментный изолятор, по 2 колоса каждого растения, близких по развитию, отмечают этикетками и оставляют для свободного опыления. Озерненность колосьев регенерантов (число зерновок с одного колоса) при свободном опылении пыльцой сорта тритикале Двуручка 77 у первого растения составила 9 и 12 шт., второго - 10 и 19 шт., третьего - 14 и 21 шт., четвертого - 11 и 14 шт., пятого - 8 и 12 шт., шестого - 11 и 17 шт. За счет высокой кустистости растения (19…35 побегов) суммарное количество зерновок у первого регенеранта составило 152 шт., второго - 173 шт., третьего - 205 шт., четвертого - 212 шт., пятого - 234 шт., шестого - 178 шт. Зерновки в изолированных колосьях (контроль) отсутствовали.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но растения-регенеранты размещают в массиве сорта опылителя тритикале МАД-1. Фазы колошения достигли 70% растений. Озерненность колосьев регенерантов (число зерновок с одного колоса) при свободном опылении пыльцой сорта тритикале МАД-1 у первого растения составила 18 и 33 шт., второго - 25 и 29 шт., третьего - 19 и 23 шт., четвертого - 17 и 21 шт., пятого - 14 и 21 шт., шестого - 20 и 27 шт., седьмого - 19 и 25 шт. За счет высокой кустистости (17…36 побегов) суммарное количество зерновок у первого регенеранта составило 248 шт., второго - 317 шт., третьего - 221 шт., четвертого - 205 шт., пятого - 273 шт., шестого - 198 шт., седьмого - 218 шт. Зерновки в изолированных колосьях (контроль) отсутствовали.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, но растения-регенеранты размещают в массиве двух сортов опылителей - Двуручка 77 и МАД-1. Фазы колошения достигли 60% растений. Озерненность колосьев регенерантов (число зерновок с одного колоса) при свободном опылении пыльцой сортов тритикале Двуручка 77 и МАД-1 у первого растения составила 39 и 48 шт., второго - 39 и 46 шт., третьего - 31 и 45 шт., четвертого - 21 и 28 шт., пятого - 27 и 28 шт., шестого - 21 и 39 шт. За счет высокой кустистости (19…38 побегов) суммарное количество зерновок у первого регенеранта составило 344 шт., второго - 492 шт., третьего - 276 шт., четвертого - 434 шт., пятого - 364 шт., шестого - 288 шт. Зерновки в изолированных колосьях (контроль) отсутствовали.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, но регенеранты тритикале высаживают вне массива сорта опылителя. Перед цветением 4 колоса каждого растения помещают под пергаментный изолятор. По достижении фазы цветения 2 изолированных колоса опыляют твел методом (см. Мережко А.Ф., Эзрохин Л.М., Юдин А.Е. Эффективный метод опыления зерновых культур: методические указания / Л.: ВИР, 1973. - 12 с.). Для опыления используют цветущие колосья сорта тритикале Двуручка 77. Фазы колошения достигли 50% растений. Озерненность опыленных колосьев регенерантов (число зерновок с одного колоса) у первого растения составила 6 и 8 шт., второго - 5 и 9 шт., третьего - 9 и 10 шт., четвертого - 7 и 11 шт., пятого - 5 и 10 шт. Зерновки в изолированных колосьях (контроль) отсутствовали.

Пример 5. Проводят аналогично примеру 4, но для опыления регенерантов тритикале используют цветущие колосья сорта тритикале МАД-1. Фазы колошения достигли 70% растений. Озерненность опыленных колосьев регенерантов (число зерновок с одного колоса) у первого растения составила 6 и 7 шт., второго - 9 и 12 шт., третьего - 8 и 11 шт., четвертого - 7 и 10 шт., пятого - 8 и 11 шт., шестого - 10 и 12 шт, седьмого - 11 и 15 шт. Зерновки в изолированных колосьях (контроль) отсутствовали.

Пример 6. Проводят аналогично примеру 4, но опыление колоса регенеранта тритикале последовательно осуществляют цветущим колосом сортов тритикале Двуручка 77 и МАД-1. Фазы колошения достигли 60% растений. Озерненность опыленных колосьев (число зерновок с одного колоса) у первого растения составила 12 и 15 шт., второго - 9 и 14 шт., третьего - 16 и 19 шт., четвертого - 11 и 13 шт., пятого - 16 и 18 шт., шестого - 10 и 17 шт. Зерновки в изолированных колосьях (контроль) отсутствовали.

Таким образом, проведение опытов по способу восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале по примеру 3 является наиболее оптимальным, т.к. он обеспечивает получение наибольшего уровня фертильности (наибольшую озерненность) андроклинных растений-регенерантов при минимальных затратах труда и средств.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- снижение трудоемкости способа, его безопасность для здоровья человека и окружающей среды;

- возможность осуществления в лабораториях, специально не оборудованных для проведения работ с колхицином;

- отсутствие необходимости подготовки специалистов, имеющих допуск к работе с веществами (колхицин) данной группы опасности;

- исключение серии экспериментов по подбору способа обработки регенерантов и концентрации колхицина;

- повышение выживаемости регенерантов и отсутствие у них явления мозаичности, наблюдающееся при обработке растений колхицином;

- формирование большого количества семян за счет высокой эффективности восстановления фертильности стерильных регенерантов;

- высокая всхожесть и жизнеспособность получаемых семян;

- увеличение запасов изменчивости полученного материала за счет кумуляции в гибридной зиготе мутаций и рекомбинаций.

Растения-регенеранты тритикале (Triticosekale Wittmack), полученные в культуре пыльников, дополнительно размножают in vitro путем отделения боковых побегов. Затем размноженные регенеранты укореняют на искусственной питательной среде и весной переносят в грунт. Перенесенные растения размещают в 1 ряд с площадью питания 45×45 см в массиве специально подобранных сортов тритикале для свободного опыления растений. Смесь сортов подбирают с учетом сроков наступления фазы цветения. Увеличение количества растений-регенерантов одинакового генотипа благодаря микроклональному размножению in vitro без использования полиплоидизирующего агента дает возможность эффективно восстанавливать фертильность регенерантов тритикале и в большом количестве получать жизнеспособные семена от свободного опыления.

Способ восстановления фертильности андроклинных регенерантов тритикале, включающий получение растений-регенерантов на искусственной питательной среде в культуре пыльников с последующей адаптацией к нестерильным условиям в сосудах с раствором Кнопа, переносом регенерантов в емкости с почвенно-торфяной смесью для проведения их искусственной яровизации в течение 30-45 дней при температуре (+3)-(+5)°С в холодильной камере и получение семенного потомства стерильных регенерантов, отличающийся тем, что полученные в культуре пыльников растения-регенеранты дополнительно размножают in vitro путем отделения боковых побегов с последующим укоренением на искусственной питательной среде, весной переносят в грунт, размещая в 1 ряд с площадью питания 45х45 см в массиве специально подобранных с учетом сроков наступления фазы цветения смеси сортов тритикале для свободного опыления.