Способ получения растений пшеницы из пыльцы в культуре пыльников Советский патент 1983 года по МПК A01H3/00 

О

Ф М) Изобретение относится к биорогии и мохсвт ёыть истюпьзовано в сепекиии дпя ускоренного получения константных форм в сепекцин на гаплоидном уровне, в исспеаовашях по экспериментальной эмбри опогии и генетике растений. Известен способ получения растений из пыльцы, заключающийся в том, что пыльники изолируют от растений и культ вируют на питательной среде, причем увеличения частоты возникновения андроклинных растений достигаютпутем «изменения химического состава питательной хсреды, добавляя компоненты неопределе ного химического состава, такие как дрожжевой экстракт, кокосовое молоко, т(атный и фруктовый соки ijОднако изменение состава питательной среды не позволяет значительно повысить частоту образования андроклинны растений, поскольку физиологические усл вия культивирования не являются главны фактором в индукции спорофитного развития пыльцы, а введение в среду компоне тов неопределенного состава не всегда обеспечивает воспроизводимость результатов. Известен способ получения растений пшеницы из пыльцы в культуре пыльников, включающий выделение колосьев донорных растений на оцноклеточн стадии развития пыльцы, обработку колосье пониженной температурой, вычленение пыльников, культивирование их на питательной среде, получение из пыльны калпусов или эмбриоидов, их пересадку на свежую питательную среду с последующи выращиванием растений в почве f 2, Однако этот способ нэ.удовлетворяет требованиям селекции из-за низкой часто- ты встречаемости пыльников с эмбриоидами и каплусами. Цель изобретения - повышение выхода растений пшеницы. Поставпенная цепь достигается тем, что в качестве доноров испопьзуют колосья, у KOTOffcix влагалище предпосгюанего листа расположено ва уровне центральной части колоса, при этом вычленение пьшьников производят из одного-аву нижних цветков средней части колоса. Способ осуществляют следующим образом. Донорные растения пшеницы, выбранные из популяции исходного сорта селек- ционной формы или гибрида случайным образом, в количестве 10-100 шт. выращивают в однородных условиях. Оснэвной отбор побегов с колосьями проводят ежедневно в утренние часы, а дополнительный - в другое время дня. Побеги, у KOTOffcix влагалище предпоследнего листа (последний лист флаговый) находится на уровне центральной части колоса (+1 см), срезают на уровне почвы без повреждения последующих побегов. Местоположение колоса в листовой оберт ке определяют на ощупь. При благоприятных погодных условиях, если растения выращивают в поле, в колосьях, среза ных по указанному морфологическому признаку, пыльники двух нижних цветков, колосков содержат одноклеточную пыльцу. Срезанные побеги этикетируют с обозначением номера донорного растения, побега, времени и даты среза, помещают в сосуд с водой, а затем в холодильгную камеру с температурой 1 - +3 С. Все срезанные побеги, независимо от , их принадлежности к одному и тому же или к разным донорным растениям, выцерживают при указанной температуре в течение строго одинакового промежутка времени, но не менее 3 и не более 10 сут. С каждого донорного растения для культивирования пыльников срезают не менее трех побегов с колосьями, а один из последующих оставляют, закрывают изошттором и выращивают до получения семенного потомства путем самоопылёния/. После предобработки пониженной температурой нижнюю часть побегов срезают, а колосья ; вмест ; с листовой оберткой в асептических условиях операционной комнаты стерилизуют в течение 5-7 мин , водным раствором диацида (0,33 г этанЪлмеркупхлорипа;,О,60 г цетилпиридинийхлорида; ОД мл Твин 20 на 1 п воды), после чего промывают тремя порциями стерильной воды. Затем колосья освобождают от листоых оберток, самые нижние (1-3) и верхие (начиная с 15-ого) колоски удаляют, оскольку процессы микроспорогенеза в ыльниках этих колосков проходят со, начительными нарушениями а стадия азвития пыльцы не соответствует таковой в пыльниках центральной части копоа. Поэтому дпя культивирования испольуют пыльники, выделенные из двух нижних ветков 14 колосков средней части колоа. При этом пыльники всех первых (саых нижних) цветков нижней половины опоса (4-8 колоски) объединяют вместе переносят в одну пр)бйрку размером d - 16 MM, и 150 MM с 10 МП пита тепьной среды №1, а пыпьквки всех вт рых цветков тех же колосков - в другу Соответственным образом рассажнва ют пыпьшосв верхней половины колоса (Ю14 колоски). Таким образом, пыльники кажаого колоса рассаживают в 4 пробирки по 1ё шт. в каждой. На проби ке указывают номер аонорного колоса, цветка и часть колоса, из кото рой взяты пыльники. Состав среды Nil для культивирован пыльников предеrajansH ниже/ Макроэлементы Содержание, мг/л .1000 КСе65 KHiPO4ЗОО МИдМО 1000 Ajjr504 ® Ca(NO,,2.347 Микроэлементы .6 ,4 Zh9O41,5 KV0,8 FeS04-H2028 Трилон Б ( N02 ЭДТА)37 Витамины Никотиновая кислота1 Аскорбиновая кислота1 Тиамин0,5 Пиридоксин0,5 Миоинозит8О-100 Сахароза 70ООО 130О Агар 6ООО-8000 2,4-Дюс лорфе HOKCfr. уксусная кислотаОД-0,5 ВодаОстальное Состав среды для прорастания 9мбрш идов представлен ниже. Макроэлементы по Блвйдзу Содержа KNO 100О ксе65 IC.H4P04ЗОО NH4NO%100О АЛа е0435 CD CWOa,),.347 Микроэлементы Нг&Оь1,6 ГЛмВ044,4 Zh5O4 levО.8 Ге504-7Н2014 TpjmoH Б (NOi ЗДТА)18,5 Ввтамвны Никотвкювая кислота1 Аскорбвновая кислота1 Тиамин Пиридоксин . Миоинозит 8О-100 Сахароза 1ОООО-2ОООО 60ОО-8ООО 3-41 ндолипуксусная ч кислота О,1-Ю,5 ВодаОстальное Перед автоклавированием рН среды доводят до 5,8-6,0 Пробирки с пыльниками инкубируют в темноте при и относительной влажности 70-80%. Среаа для прорастания эмбриоидов oTnHjjag.TCfl от среды №1 тем, что содержание железа (П) сернокислого 7Н2Р составляет 14 мг/л; Трилона Б (Ма7.ЭДТА) 18,5 мг/л; саX арозы 10 ООО-20 ООО мг/ л; 2,4-Д -заменяется на 3-индолилуксусную кислоту в концентрации 0,1-О,5 мг/п. На этой среде эмбриоиды вырашшзают в условиях периодического освешетп, .создаваемого лампами накатпшания. и дуговыми ртутно-лх инисцентными лампами (освещенность 2ООО-5ООО пк, период освещения 16ч в сутки) при в относительной влажности 70-80%. В таких условиях некоторые эмбрионды заканчивают днфференцировку и прораотают. По мере развития растений и по явления у иих 3-5 листочков и корней их пересаживают в почву и вырашивают андрбкли ные растения до получения семян путем спонтанной дштпо|{двза1ШВ. Способ опробирован на различных сортах пшеницы и тритикале. Результаты сведены в табл 1-3. У пшеницы асвнхронность в прохождении втапов микроспорогаметогенеза (табл.1) между пыльниками разны цветков колоска накладывает ограничение на возможность использования (при од{ювр& менвой посадке) пыльников всех трех нижних цветков. При культивировании пыльяюсов колосьев 1-ой и 2-ой группы получены лучшие результаты, причем подавляющее большинство структур (9.2%) выделено изпыльниковТ н ГГцветков.Отсюпа слеаует.что культивирование пыльников трех цветков для получения андроклинных раотений практвчесжи нецелесообразно. Отбор колосьев 1-ой и 2-ой групп следует прснводить тогда, когда влагалище предпо.спеднего листа находится на уровне цеш ральной части колоса. Табл. 2 иллюстрирует целесообраа- вость культивирования пыльштков Г цветков для получения андрокпин ых струк. S10 тур у пшешщы (fopae opMe 427/77, Лютесценс 72, Саратовская 52) и тритикапе {Оаесский ;кормовой). На табп. 5 , что в эавискмости от объекта пыпьники нижней Н/. (4-8 копосжи) и верхней В (10-14 копоски) поповины копоса различаются по частоте возникновения андроклинных структур. При культивировании пыльников только наиболее продуктивной части колоса общий выход андроклинных структур в зависимости от объекта можно повысить в 1,5-4,0 раза, не увеличивая при этом объема работы.

Таблица 1 6 Применение предлагаемого способа приводит к бопее иитенсивкому использованию явления гаппоидии для решения многих, важных вопросов сепекиии этой сельскохозяйственной культур1 1. В частности, применение гаплоидов позволяет значительно сократить сроки создания константных форм с использованием различного исходного селекционного материапа. Поскольку пшеница является полиплоидом, провеаение селекции на гаплоианом уровне позволяет повысить эффективность селекционного процесса.

т а 6 л и ц а 2

Продолжение табл. 3

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАС;i ТЕНИЙ ;ГШ1ЕНИиЫ ИЗ ПЫЛЬЦЫ В КУЛЬ ТУРЕ ШЯЛЬНИКОВ, включающий выаепе вив колосьев донорвых растеввЛ на одвоклеточной стадии развития пыльиы, обрее ботку колосьев пониженной температурой, вычленение пыльников, культивирование их на питательной среде, получение из пыльцы каллусов или эмбриоиаов, их пересадку на свежую питательную среду с последующим выращиванием растений в почве, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода растений, в качестве доноре используют колосья, у которых влагалище предпоследнего листа расположено на уровне центральной части колоса, при этом шлчленение пыльников производят, из одного-двух нижних цвегков средней части колоса.