Способ получения растений - регенерантов пшеницы из пыльцы в культуре пыльников Советский патент 1991 года по МПК A01H4/00 C12N5/00 

Изобретение относится k биотехнологии, а именно к получению растений из пыльцы в культуре изолированных пыльников яровой пшеницы для ускоренного получения новых исходных форм и константных гибридных линий.

Целью изобретения является повышение выхода регенерантов за счет увеличения выхода эмбриональных структур.

Способ состоит в том, что проводят выделение колосьев донорных растений, у которых влагалище предпоследнего листа расположено на центральной части колоса, обработку колосьев пониженной температурой, вычленение пыльников, культивирование их на питательной среде для регенерации растений, при этом перед культивированием пыльников на питательной среде проводят определение дозы натриевой соли 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), стимулирующей рост корешков семян пшеницы с последующей добавкой соответствующего количества в питательную среду для инициации эмбриоидов из пыльников в концентрации от 0,25 до 1,0 мг/л в зависимости от сорта, в низких концентрациях обладающей аукси- ноподобным типом действия.

Способ осуществляют следующим образом.

Семена разных сортов проращивают в темноте на стеклянных плотиках при 27°С в течение 3 сут. Затем измеряют длину центрального корешка и переносят проростки в чашки Петри по 10 шт в 15 мл раствора 2,4-Д в возрастающей концентрации от 0,1 до 12 мг/л и помещают в те же условия. Через два дня измеряют длину корня и определяют степень ингибирова- ния или стимуляции роста корней под действием гербицида.

Сбор материала для культивирования может проводиться круглосуточно из открытого и закрытого грунта. Колосья, у которых влагалище предпоследнего листа расположено в центральной части колоса, срезают

(Л

С

о ся о о л

и ставят в холодильник на 7-9 дней при температуре 4-5°С. Затем колосья с листовой оберткой промывают в автоклавирован- ной дистиллированной воде, стерилизуют 70%-ным спиртом в течение 7 с, вновь промывают стерильной водой и продолжают стерилизацию 3%-ной перекисью водорода в течение 6 мин и дважды промывают дистиллированной водой. В стерильных условиях (в шкафах с ламинарным потоком стерильного воздуха) вычленяют пыльники и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для инициации эмбриогенеза в биологические пробирки.

Среда I содержит минеральные соли, витамины по прописи № 10%-ный картофельный экстракт, (9%-ную сахарозу, 0,7%- ный агар и гормональные добавки в виде различных концентраций 2,4-Д (от 0,25 до 1 мг/л) в зависимости от культивируемых генотипов. Пробирки с образцами культивируют в темноте при температуре + 27°С.

Образовавшиеся через 21-29 дней культивирования эмбриоиды пересаживают на среду II, способствующую регенерации растений. Результаты приведены в табл.1. Она не содержит 2,4-Д. В качестве гормональных добавок включается кинетин и индоли- луксусная кислота. Пробирки с эмбриоидами помещают на светоплощадку на 16-часовой фотопериод и при 10-12°С. Регенерировавшие при этих условиях растения высаживают в почву.

Пример 1. Определение чувствительности сорта Скала к различным концентрациям 2,4-Д и интенсивность эмбриоидогенеза на искусственных питательных средах с различной концентрацией 2,4-Д.

Чувствительность сорта к различным концентрациям 2,4-Д определяют описанным способом. Затем выясняют стимулирующую зону. В питательную среду для культивирования пыльников добавляют соответствующую стимулирующей зоне дозу 2,4-Д, как гормон ауксинового типа действия.

Для проверки изобретения пыльники сорта Скала культивируют и на альтернативной среде с содержанием 2,4-Д 1 мг на 1л среды. Полученные результаты представлены в табл.2.

Пример 2. Аналогичный эксперимент проводят для линии 35 (Иния 66 х Кавказ). Полученные результаты приведены втабл.З.

Интенсивность эмбриоидогенеза выше на среде, содержащей стимулирующую дозу 2,4-Д.

Пример 3. Выявляют стимулирующие

дозы 2,4-Д для сорта Саратовская 29 по той же методике, что и в примерах 1 и 2. Определение интенсивности эмбриоидогенеза проводят на искусственных питательных средах, различающихся по 2,4-Д. Максимальный выход эмбриоидов для сорта Саратовская 29 наблюдают на среде, содержащей стимулирующую дозу 2,4-Д. Результаты приведены в табл.4.

В результате проведенных исследований выявлены следующие ингибирующие и стимулирующие эмбриоидогенез концентрации 2,4-Д для различных сортов пшеницы. Результаты приведены в табл.5 и 6. Преимуществом изобретения являются

возможность культивирования любых генотипов с целью получения эмбриоидов для регенерации из них растений, идентичность растений-регенерантов и исходных форм, высокий выход эмбриоидов, быстрота процесса, занимающего от момента определения стимулирующей дозы 2,4-Д до образования растений 45-90 дней, возможность круглогодичного проведения работ, предсказуемость и интерпретируемость

результатов эксперимента, многократное увеличение выхода эмбриоидов и растений по сравнению с прототипом.

Формула изобретения Способ получения растений-регенерантов пшеницы из пыльцы в культуре пыльников, включающий выделение колосьев донорных растений, у которых влагалище предпоследнего листа расположено на центральной части колоса, обработку колосьев

пониженной температурой, вычленение пыльников, культивирование их на питательной среде, получение эмбриоидов и пересадку на питательную среду для регенерации растений, отличаю щийс я тем, что, с целью повышения выхода регенерантов за счет увеличения выхода эмбриональных структур, перед культивированием пыльников на питательной среде предварительно определяют количество натриевой соли дихлорфенилуксусной кислоты, оптимальное для эмбриоидогенеза, по стимуляции роста корешков семян, после чего соответствующее количество ее вносят в питательную среду в концентрации (0,25 1,0) мг/л в зависимости от сорта.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к культивированию раститель- ных тканей и касается получения растений-регенерантов пшеницы из пыльцы. Целью изобретения является повышение выхода регенерантов за счет увеличения выхода эмбриональных структур. Способ состоит в гом, что в питательную среду, на которой культивируют пыльники, вносят стимулирующее количество 2,4-Д, предварительно определенное по степени отрастания корешков семчн 6 табл

Среда I

Ne модифицированная, мг/л

Картофельный эк

КМОз

Са(МОз)2 4Н2О

MoS04 7H20

(ЫНф SO4

NaHa РО4- НаО

КН2РО4

CaCl2 2H2O FeS04 7H2d Na2 ЕДТА«2Н20 CuS04 5H20

MnS04 H2O

KCI

ZnS04-7H20

Na2MoO/t 2H20

НзВОз

Kl

Тиамин

Аскорбиновая кис

Пиридоксин

Никотиновая кисл

Мезо-инозит

Сахароза

Агар

2,4-Д

Кинетин

Индолилуксусная

рН до автоклави

Среда I

Среда II

Гамборга-Эвелега ВБ модифицированная

0%-ный

1000

100

125

100

200

27,8 37,3

35

1,0

90000

7000

,1-1,0

2500

250 134 150

150

13,9

18,6

0,025

10

2,0

0,25

3,0

0,75

0,5

0.5

1,0

100

20000

6,1

0,2 0,2 6,1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6