Способ получения комплексного ферментного препарата ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы Е.coLI Советский патент 1989 года по МПК C12N9/12 C07H19/20 C12N9/12 C12R1/19 

Описание патента на изобретение SU837066A1

Изобретение относится к молекулярной биологии и биохимии и может быть

использовано в биохимической промышленности для получения ферментов ацетокиназы и аденилаткиназы, из биомассы Е. coli, широко используемых для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ).

Известны способы выделения и очистки ацетокиназы и аденилаткиназы в от-, дельности.

В частности, известен способ получения аденилаткиназы из биомассы Е. coli, состоящий из следующих стадий:

1)разрушение клеток биомассы в гомогенизаторе под вакуумом;

2)удаление клеточных остатков центрифугированием, получение супернатанта - так называемого грубого экстракта ;

3)фракционирование сульфатом аммония (60-68%);

А) геЛь-хроматография на сефадексе G-100;

5)первая хроматография на ДЭАЭцеллкшозе; .

6)вторая хроматография на ДЭАЭцеллюлозе;

7)хроматография на гидроксилапатите; ; / .. : . , -, , ,, ;

8)изоэлектрофокусирование. Полученньй по такой схеме фермент аденилаткиназа - имеет удельную активность 620 Е/мг (здесь и далее для всех ферментов приводятся единицы ак мкмоль субстрата ч тивности Е - - - ) мг- белка х мин

Недостатками способа получения aAeнилаткиназы является его многостадийное ть и сложность очистки, а также крайняя неетабнльность получаемого фермента, что делает невозможным его использование для синтеза АТФ. .

Для прикладных целей (например, для ферментативного синтеза АТФ изАМФ) обычно используют аденилаткиназу. из мьвщ кролика (миокиназу) ввиду ее большой стабильности.

Известен способ получения аденипаткиназы из мьшц кролика, включающий следующие стадии:

1)получение грубого экстракта из гомогената мьшц экстракцией раствором NaCl;

2)рН-фракционирование;

3)фракционирование ацетатом цинка

4)экстракция цитратом аммония;

5)первое фракционирование сульфатом аммония в количестве 0,58 от степени нacьroj eния;

6)второе фракционирование сульфатом аммония в количестве 0,88 от степени насыщения;

7)диализ сорбция и десорбция на смоле ГКС-ЗО (ХЕ64);

8)третье фракционирование сульфатом аммония.

Прлученный таким образом фермент имеет удельную активность 1500 Е/мг.

Недостатками данного способа получения аденилаткиназы являются многостадийность, сложность вьщеления фермента и использование в качестве источника фермента пищевого продукта (мьшц кролика).

Известен также способ получения ацетокиназы из биомассы Е. coli, состоящий из следующих стадий.:

1)получение грубого экстракта из биомассы;

2)первое фракционирование ацетоно в количестве 40-55%;

3)первое фракционирование сульфатом аммония (О,5-0,6 насыщ.) ;

4)второе фракционирование ацетоно в количестве 50-55%;.

5)второе фракционирование сульфа- том аммония (0,5-0,6 насьщ.);

. 6) третье фракционирование сульфатом аммония (0,49-0,53 насыщ.).

Полученный таким образом фермент ацетокиназа - имеет удельную активность 220 Е/мг.

Недостатками способа являются многостадийность и использование метода фракционирования белков ацетоном, которьй является весьма сложным, в исполнении, так как строго зависит от температуры. Кроме того, использовани легковоспламеняющихся жидкостей, особенно при увеличении масштабов технологии j значительно ее усложняет.

Полученные вьшеуказанными способами высокоочищеннью ферменты-адёнилат- киназу и ацетокиназу Г31 иммобилизуют на БгСЫ-сефарозе и используют для получения АТФ ферментативным фос- форилированием аденозинмонофосфата или аденозиндифосфата путем пропускания через реактор с иммобилизованными ферментами реакционной смеси, содержащей АМФ или АДФ, ацетилфосфат, ионы буфер трис-НС1 t4, 5. Производительность реактора составляет 24 г АТФ в сутйи, чистота АТФ 96-97%.

Однако данньй способ нельзя признать достаточно экономичным и технологически удобным, поскольку он основан на использовании ферментов высокой степени очистки (что как показано ав торами, изобретения, совсем не обязательно) и вьщеляемых из разных источНИКОВ трудоемкими и многостадийными способами, причем один из источников ферментов является пгацевым продуктом. Основной недостаток всех известных способов получения ацетокиназы и аденилаткнназы заключается в использовании биомассы только для вьщеления од ного фермента, результатом чего является неоправданно большое количество отходов. Кроме того, все известные способы являются многостадийными и в силу это го трудоемкими и дорогостоящими. Для прикладных целей - для синтеза АТФ из АМФ, целесообразно использовать не высокоочищенные ферменты, а лишь частично очищенные препараты ферментов, в сипу простоты и Низкой стоимости их получения. Поскольку и ацетокиназа.и аденилаткйназа присутствуют в значительных количествах в Ё. coli, причем оба эти фермента широко используются для прикладных целей (например, синтез АТФ из АМФ), нет необходимости в очистке каждого из ферментов в отдельности, выгоднее сразу получать препарат, содержащий оба фермента. Изобретение экспериментально показывает возможность использования частично очищенных ацетокиназы и аденилаткиназы, вьщеленных из одного источника-биомассы Е. coli, для синтеза АТФ. Целью изобретения является разработка нового способа получения комллексного ферментного препарата-ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы Е. coli. Цель достигается новым, не описанным ранее в литературе способом получения комплексного ферментного препа- рата ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы Е. coli, заключающимся, в .том, что биомассу Е. coli разрушают путем обработки ее раствором лизоцима в трис-НС1 буфере рН 7,48-7,5, содержащем О,1-0,15 М КС1, и действием ультразвука с частотой 16-18 кгц, отделяют клеточные остатки центрифугиройанием, полученный супернатант об- рабатьшают стрептомицинсульфатом, пос ле чего осаждают из него белки сульфа том аммония в количестве 68-70% от насыщения с последующим растворением осадка ацетокиназы и аденилаткиказы путем разбавления суспензии белков двукратным объемом трис-НС1 буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30-37% и удалением нерастворившегося осадка. Обычно стрептомицинсульфат используют в количестве 1-3%. Существенными отличиями способа являются разрушение биомассы Е. coli раствором ЛИЗоцима в трис-НС1 буфере рН 7,48-7,5, содержащем 0,1-0,15 М КС1, и действием ультразвука с частотаэй 16-18 кгц, отделение клеточных остатков центрифугированием, обработ- . ка полученного супернатанта стрептомицин сульфатом , осаждение белков сульфатом аммония в количестве 68-70% от насьпцения, растворение осадка ацетокиназы и аденилаткиназы путем разбавления суспензии белков двухкратным объемом трис-НС буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30 - . 37% и удаление нерастворившегося осадТаким образом, ацетокиназу и аденилаткиназу получают комплексно на основе совместной грубой очистки из одного источника, а именно, из биомассы Е. coli. Это позволяет избежать трудоемких стадий очистки аденилаткиназы и ацетокиназы в отдельности и удешевить процесс за счет исключения дорогого и дефицитного сырья - мышц кролика и сокраще1шя расходов на реагенты и .оборудование. Описываемый способ получения ферментного препарата, содержащего аденйлаткиназу и ацетокиназу, заключается в следующем: биомассу Е. coli MRE600 разрушают сначала лизоцимом, а затем ультразвуком в трис-НС1 буфере, содержащем О,1-0,15 М КС1 (для полноты экстракщш белков) и получают грубьй экстракт. Такой способ разрушения биомассы позволяет вьщелить на стадии грубого экстракта в 10 раз большее количество единиц активности ацетокиназы и аденилаткиназы по сравнению с разрушением биомассы только лизоцимом или только ультразвуком Грубьй экстракт обрабатывают 3%-ным раствором стрептомицинсулЬфата для удаления нуклеиновых кислот. Затем проводят фракцнонирова- ние сульфатом аммония в следующем порядке: сначала осаждают белки при концентрации сульфата аммония 68-70% на- сыцения, а затем растворяют осаяаденные

белки доведением концентрации сульфата аммония до 30-37% наеьщения. Такая последовательность фракционирования сульфатом аммония позволяет получить в 2-3 раза большее количество единиц активности ацетокиназы и аденилаткиназы, чем при фракционировании сульфатом аммония в обычно принятой последовательности: сначала осаждение более низкой концентрацией, а затем - более высокой. Полученную фракцию белков используют как ферментный препарат. Ферментный препарат, полученньй описываемым способом, содержит ацетокиназу с удельной активностью 20-25 Е/мг и аденилаткиназу с удельной активностью 30-40 Б/мг. Полученный ферментный препарат может быть успешно использован для синтеза АТФ из АМФ и ацетилфосфзта. Для этого ферментньй препарат, предварительно обессолив на колонке с Сефадексом G-25 и одновременно произведя смену буфера, иммобилизуют известным способом,5 на BrCN-Сефарозе 4В. Через реактор проточного типа с иммобилизованным ферментным препаратом пропускают реакционную смесь, со. о

держай(ую АМФ, ацетилфосфат, Mg и в качестве затравки незначительное ко-/ лИчёство АТФ. Выход АТФ после реакции составляет 97-98% от запускаег ого количества АМФ.

Пример 1. Приготовление ферментного препарата.

100 г замороженной при - 40 С биомассы Б. coli МКБ-бОО измельчают в ступке, заливают 300 мп 0,1 М КС1 в 0,01 М трис-НС рН 7,5 с 2 мМ/ меркаптоэтанола, перемешивают при доОднородной суспензии, приливают раствор лизоцима в буфере (из расчета 1 мг лизоцима на 1 г биомассы) и перемешивают 10 мин. Затем сус. пензию озвучивают в ледяной бане на ультразвуковом дезинтеграторе (18 кгц) сеансами по 1 мин с перерывами в 1 мин. Общее, время озвучивания 20 мин. Суспензию центрифугируют в течение 40 мин при 10000 об/мин. Супернатант используют как грубьй экстракт, осадок отбрасывают.

Обработка экстракта стрептомицинсульфатом.

К 375 мг грубого экстракта приливают по каплям при тщательном перемешивании 43 мл 30%-ного раствора стрептомицинсульфата в 0,01 М трис-НС1, рН 7,5, содержащем 2 мМ -меркаптоэтанола, до конечной концен1рации стрептомицинсульфата 3%. После этого смесь перемешивают 20 мин. Затем центрифугируют (14000 об/мин, 40 мнн). Осадок отбрасывают. Супернатант подвергают дальнейшей обработке (фракция СС).

Фракционирование сульфатом аммония .

К 380 мл фракции СС при тщательном перемешивании на холоду присьтают небольшими порциями тонко растертые кристаллы сухого сульфата аммония (179,36 г) до конечной концентрации 70% насыщения по (N11 )2 30 . Затем раствор тщательно перемешивают 30 мин и центрифугируют (10000 об/мин, 30 мин). Супернатант Отбрасьшают. Осадок суспендируют в минимальном объеме 0,7 насьш1енного раствора сульфата аммония в 0,01 М трис- НС рН 7,5 + 2м /-меркаптоэтанол. Суспензию разбавляю в 2 раза с буфером и тщательно перемешивают 20 мин затем центрифугируют (14000/об/мин, 30 мин). Осадок отбрасывают, а Супернатант подтитровывают с 0,5 н КОН до рН 7,5. Полученный препарат (100 мп) разливают по 10 мл в герметичные полиэтиленовые флаконы и замораживают при (фракция О,70,37СА). В таком виде препарат хранится 6 месяцев без потери активности

Пример 2. Использование-комплексного- ферментного препарата, содержащего аценилаткиназу и ацетокиназу для синтеза АТФ.

10 мл фракции 0,7-0,37А размораживают на льду и нанЬсят на колонку с сефадексом G-25 (2,6 см х 40), предварительно уравновешенную О,1 М К-фосфатным буфером рН 7,8, содержащим 0,5 н. КС1 и 2 мМ ; тмеркаптоэтанол. После нанесения образца в колонку подают этот же раствор со скоростью 250 мл/ч. Оптическую плотность выходящего из колонки раствора регистри-руют с помощью проточного денситометра при длине волны 280 нм. Фракцию, содержащую белок, собирают отдельно и немедленно подвергают иммобилизации на BrCN-сефарозе.

Иммобилизация ферментного препарата на BrCN-сефарозе 4В.,

2 г сухой BrCN-сефарозы 4В (фирмы Pharmacia-, Швеция) промьшают на creioiHHHOM пористом фильтре 200 мл 0,001 н, НС1, затем 200 мл 0,1 М К-фосфата рН 7,8, содержащего О,5 Н КС1 и 2 м М -меркаптоэтанол. Отмытую BrCN-сефарозу переносят в чистый флакон вместимостью 15-20 мл. Туда же приливают 7 мл обессоленного ферментного препарата, содержащего 30 мг белка. Смесь легко встряхивают 16 час на холоду (+5 С). После иммобилизации содержимое флакона количественно переносят на стеклянный фильтр и промыч вают на колбе Бунзена.100 мл 1М КС1 в 0,001 М тряс-HClpH 7,5 для снятия ковалентно несвязанных белков. Затем иммобилизованный ферментный препарат (ИФП) встряхивают в течение 30 мин с 30 мл 1М трис-гНС рН 7,5 для экранирования непррреагирманных групп сорбента. После этого ИФП отмьшают на стеклянном пористом фильтре 100 мл 0,01 М трис-НС1рН 7,5, содержащего 2 мМ меркаптоэтанол, слегка отжимают, переносят в герметичный флакон с широким горлом и заливают 200 мл 0,01 М трисИС1 рН 7,5, содержащего 2 мМ АТФ,2мМ MgCl и 2 мМУ -меркаптоэтанол. В таком виде ИФП хранят при +4 С. Синтез АТФ. Синтез АХФ проводят в термостатйрУ емом реакторе проточного типа с иммр- билизованным ферментным препаратом (30 мг белка на 2 г BrCIJ-сефарозы 4В), содержащим 120 ед. ацетокиназы и 100 ед. акт аденилаткиназы. Реакционну смесь следующего состава: 20 Ш АМФ, 2 мМ АТФ, 80 мМ ацетилфосфат, 20 м1Л MgCl, 2 мМу -меркаптоэтанол, 50 мИ трис-НС1 рН 7,5, пропускают через колонку с ИФП, термостатируемую при 37 С 83 610 со скоростью 20 мл/ч. При этом глуби1|а синтеза АТФ составляет не ниже 97,5%. Производительность такого реактора составляет 5 г АТФ в сутки (0,21 г АТф/ч) при его объеме 2 мл. Производительность реактора с частично очищенным ферментным препаратом, содержащим ацетокиназу и аденилаткиназу, и производительность реактора с высокоочищенными ферментами 5 одинакова в пересчете на количество единиц активности фермента, .связанного с матрицей. Преимуществами описьшаёмого способа являются использование одного источника вместо двух источников ферментов - биомассы Е. coll - т.е. упрощение способа; проведение вместо многостадийной (14 стадий) и тонкой очистки каясдого из ферментов четырех, стадийного вьщеления и грубой очистки ферментов; исключение использования пищевого сырья - мьщщ кролика; уменьщение расхода реагентов на очистку ферментов, не требуется сложное аппаратурное оформление. -I.- . При использовании в широких масштабах синтеза АТФ на и a foбилизoвaнныx ферментах, что является наиболее перспективным для полученная АТФ, самой трудоемкой и дорогостоящей стадией является вьщеление ферментов. Поэтому использование вместо высокоочищенньрс ферментов из разных источников, грубоочищенного ферментного препарата из одного источника является экрномически более перспективным.

Похожие патенты SU837066A1

название год авторы номер документа
Способ получения РНК-лигазы 1979
  • Ямковой Виталий Иванович
  • Веньяминова Алия Гусейновна
  • Василенко Станислав Константинович
  • Нечаев Юрий Сергеевич
  • Бакланов Михаил Маратович
  • Чистяков Павел Григорьевич
  • Онищенко Анатолий Михайлович
SU910762A1
Способ получения большого фрагмента ДНК-полимеразы I ЕSснеRIснIа coLI - фрагмента Кленова 1988
  • Баронайте Зита Альгирдовна
  • Вайткявичене Регина Стасевна
  • Марцишаускас Ромуальдас Пранович
  • Суджювене Она Феликсовна
  • Песлякас Ионас-Генрикас Ионович
  • Федорова Наталья Михайловна
  • Пасечник Владимир Артемович
SU1541256A1
Способ выделения полинуклеотидфосфорилазы 1981
  • Загребельный Станислав Николаевич
  • Закабунин Александр Иванович
  • Романов Владимир Павлович
  • Кумарев Виктор Прокопьевич
SU1076445A1
Способ получения щелочной фосфатазы 1988
  • Марцишаускас Ромуальдас Пранович
  • Лакачаускене Рута Витаутовна
  • Дайлиденайте Вита Степановна
  • Суджювене Она Феликсовна
  • Песлякас Ионас-Генрикас Ионович
SU1576563A1
Способ получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-5 @ -трифосфатов, меченных изотопами @ С и @ Н 1984
  • Феофанов С.А.
  • Загребельный С.Н.
  • Мокану О.П.
  • Чудинов А.Р.
SU1251509A1
Способ получения рибонуклеазы Н из ЕSснеRIснIасоLI 1987
  • Чичкова Нина Валентиновна
  • Пейсениекс Варис Элиасиевич
  • Залите Индулис Карлович
SU1495377A1
Способ получения полиадениловой и полиинозиновой кислот 1987
  • Гурьев Владимир Павлович
  • Подгорный Владимир Федорович
SU1470738A1
Способ получения ДНК-полимеразы бактериофага Т4 в клетках ЕSснеRIснIа coLI 1983
  • Шевелев И.В.
  • Крутяков В.М.
  • Махно В.И.
SU1147030A1
Способ получения эндонуклеазы рестрикции 1982
  • Вайткявичюс Д.П.
  • Яскелявичене Б.П.
  • Пунтежис С.-Б.А.
  • Янулайтис Э.-А.А.
SU1095645A1
Способ получения ДНК-полимеразы 1 ЕSснеRIснIа coLI 1988
  • Вайткявичене Регина Стасевна
  • Марцишаускас Ромуальдас Пранович
  • Баронайте Зита Альгирдовна
  • Суджювене Она Феликсовна
  • Песлякас Ионас-Генрикас Ионович
  • Громова Ольга Александровна
  • Гаврюченкова Людмила Павловна
SU1622393A1

Реферат патента 1989 года Способ получения комплексного ферментного препарата ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы Е.coLI

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ФЕРГ-ШНТНОГО ПРЕПАРАТА АЦЕТОКИНА- ЗЫ ИАДЕНИЛАТКИНАЗЫИЗ БИОМАССЫ Е. COLI, о т л и ч а ю щ и и с я тем^ что биомассу Е. coli разрушают путем обработки ее раствором ЛИЗоцю<а в трис-^НС! буфере рН 7,48-7,5, содержащем О,1 - О,15 М KCI, и действием ультразвука с частотой 16-18 кГц, отделяют клеточные остатки центрифугированием, полученный супернатант обрабатывают стреп- томицинсульфатом, после чего осаждают из него белки сульфатом аммония в количестве 68-70% от насыщения с последующим растворением осадка ацетокина- зы и аденилаткинапы путём разбавления суспензии белков двукратным объемом трис-НС1 буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30-37% и удалением нерастворившегося осадка.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стрептомицин- сульфат используют в количестве 1-3%.(Я

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1989 года SU837066A1

R
К
Holmes, М
F
Singer, "Purification and Characterization of Adenylate Kinase as an Apparent Adenosine Triphosphate - dependent Inhibitor of Ribonuclease II in E
co- li", J
Biol
Chem., 1973, V
Деревянная повозка с кузовом, устанавливаемым на упругих дрожинах 1920
  • Ливчак Н.И.
SU248A1
,L
Noda, S
A
Kuby "Izolation of the Crystalline enzjrae from rabbit skeletal muscle", J
Biol
Chem., 1957, V
Переносное устройство для вырезания круглых отверстий в листах и т.п. работ 1919
  • Сидоров И.В.
SU226A1
Способ обработки легко рассыпающихся и плохо высыхающих осочно-тростниковых торфов при помощи разбавленных щелочей 1922
  • Кирпичников В.Д.
  • Классон Р.Э.
  • Стадников Г.Л.
SU541A1
A
Rose,-M
Grunberg - Мападо et al., "Enzymatic phosphorilation of aicetates", J
r.iol
Chem., 1954, V
Способ добывания бензина и иных продуктов из нефти, нефтяных остатков и пр. 0
  • Квитко В.С.
  • Квитко Е.К.
  • Семенова К.С.
SU211A1
M
Whitesides, A
Chmurny et al.ji "Enzyme Immobilization and Reactor Development", Enzyme Engineering, 1974, V
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Искусственный двухслойный мельничный жернов 1921
  • Паншин В.И.
SU217A1
L
Baughn, 0
Adalsteinsson, G
M
Whitesides, "Large - Scale Enzyme - Catalyzed'Synthesis of ATP from Adenosine and Acetyl Phosphate
Regeneration of ATAP from AMP", JACS, 1978, 100, f? 1, 304-305.

SU 837 066 A1

Авторы

Феофанов С.А.

Загребельный С.Н.

Закабунин А.И.

Романов В.П.

Даты

1989-10-15Публикация

1979-08-15Подача