Способ получения комплексного ферментного препарата ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы Е.coLI Советский патент 1989 года по МПК C12N9/12 C07H19/20 C12N9/12 C12R1/19 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биохимии и может быть

использовано в биохимической промышленности для получения ферментов ацетокиназы и аденилаткиназы, из биомассы Е. coli, широко используемых для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ).

Известны способы выделения и очистки ацетокиназы и аденилаткиназы в от-, дельности.

В частности, известен способ получения аденилаткиназы из биомассы Е. coli, состоящий из следующих стадий:

1)разрушение клеток биомассы в гомогенизаторе под вакуумом;

2)удаление клеточных остатков центрифугированием, получение супернатанта - так называемого грубого экстракта ;

3)фракционирование сульфатом аммония (60-68%);

А) геЛь-хроматография на сефадексе G-100;

5)первая хроматография на ДЭАЭцеллкшозе; .

6)вторая хроматография на ДЭАЭцеллюлозе;

7)хроматография на гидроксилапатите; ; / .. : . , -, , ,, ;

8)изоэлектрофокусирование. Полученньй по такой схеме фермент аденилаткиназа - имеет удельную активность 620 Е/мг (здесь и далее для всех ферментов приводятся единицы ак мкмоль субстрата ч тивности Е - - - ) мг- белка х мин

Недостатками способа получения aAeнилаткиназы является его многостадийное ть и сложность очистки, а также крайняя неетабнльность получаемого фермента, что делает невозможным его использование для синтеза АТФ. .

Для прикладных целей (например, для ферментативного синтеза АТФ изАМФ) обычно используют аденилаткиназу. из мьвщ кролика (миокиназу) ввиду ее большой стабильности.

Известен способ получения аденипаткиназы из мьшц кролика, включающий следующие стадии:

1)получение грубого экстракта из гомогената мьшц экстракцией раствором NaCl;

2)рН-фракционирование;

3)фракционирование ацетатом цинка

4)экстракция цитратом аммония;

5)первое фракционирование сульфатом аммония в количестве 0,58 от степени нacьroj eния;

6)второе фракционирование сульфатом аммония в количестве 0,88 от степени насыщения;

7)диализ сорбция и десорбция на смоле ГКС-ЗО (ХЕ64);

8)третье фракционирование сульфатом аммония.

Прлученный таким образом фермент имеет удельную активность 1500 Е/мг.

Недостатками данного способа получения аденилаткиназы являются многостадийность, сложность вьщеления фермента и использование в качестве источника фермента пищевого продукта (мьшц кролика).

Известен также способ получения ацетокиназы из биомассы Е. coli, состоящий из следующих стадий.:

1)получение грубого экстракта из биомассы;

2)первое фракционирование ацетоно в количестве 40-55%;

3)первое фракционирование сульфатом аммония (О,5-0,6 насыщ.) ;

4)второе фракционирование ацетоно в количестве 50-55%;.

5)второе фракционирование сульфа- том аммония (0,5-0,6 насьщ.);

. 6) третье фракционирование сульфатом аммония (0,49-0,53 насыщ.).

Полученный таким образом фермент ацетокиназа - имеет удельную активность 220 Е/мг.

Недостатками способа являются многостадийность и использование метода фракционирования белков ацетоном, которьй является весьма сложным, в исполнении, так как строго зависит от температуры. Кроме того, использовани легковоспламеняющихся жидкостей, особенно при увеличении масштабов технологии j значительно ее усложняет.

Полученные вьшеуказанными способами высокоочищеннью ферменты-адёнилат- киназу и ацетокиназу Г31 иммобилизуют на БгСЫ-сефарозе и используют для получения АТФ ферментативным фос- форилированием аденозинмонофосфата или аденозиндифосфата путем пропускания через реактор с иммобилизованными ферментами реакционной смеси, содержащей АМФ или АДФ, ацетилфосфат, ионы буфер трис-НС1 t4, 5. Производительность реактора составляет 24 г АТФ в сутйи, чистота АТФ 96-97%.

Однако данньй способ нельзя признать достаточно экономичным и технологически удобным, поскольку он основан на использовании ферментов высокой степени очистки (что как показано ав торами, изобретения, совсем не обязательно) и вьщеляемых из разных источНИКОВ трудоемкими и многостадийными способами, причем один из источников ферментов является пгацевым продуктом. Основной недостаток всех известных способов получения ацетокиназы и аденилаткнназы заключается в использовании биомассы только для вьщеления од ного фермента, результатом чего является неоправданно большое количество отходов. Кроме того, все известные способы являются многостадийными и в силу это го трудоемкими и дорогостоящими. Для прикладных целей - для синтеза АТФ из АМФ, целесообразно использовать не высокоочищенные ферменты, а лишь частично очищенные препараты ферментов, в сипу простоты и Низкой стоимости их получения. Поскольку и ацетокиназа.и аденилаткйназа присутствуют в значительных количествах в Ё. coli, причем оба эти фермента широко используются для прикладных целей (например, синтез АТФ из АМФ), нет необходимости в очистке каждого из ферментов в отдельности, выгоднее сразу получать препарат, содержащий оба фермента. Изобретение экспериментально показывает возможность использования частично очищенных ацетокиназы и аденилаткиназы, вьщеленных из одного источника-биомассы Е. coli, для синтеза АТФ. Целью изобретения является разработка нового способа получения комллексного ферментного препарата-ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы Е. coli. Цель достигается новым, не описанным ранее в литературе способом получения комплексного ферментного препа- рата ацетокиназы и аденилаткиназы из биомассы Е. coli, заключающимся, в .том, что биомассу Е. coli разрушают путем обработки ее раствором лизоцима в трис-НС1 буфере рН 7,48-7,5, содержащем О,1-0,15 М КС1, и действием ультразвука с частотой 16-18 кгц, отделяют клеточные остатки центрифугиройанием, полученный супернатант об- рабатьшают стрептомицинсульфатом, пос ле чего осаждают из него белки сульфа том аммония в количестве 68-70% от насыщения с последующим растворением осадка ацетокиназы и аденилаткиказы путем разбавления суспензии белков двукратным объемом трис-НС1 буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30-37% и удалением нерастворившегося осадка. Обычно стрептомицинсульфат используют в количестве 1-3%. Существенными отличиями способа являются разрушение биомассы Е. coli раствором ЛИЗоцима в трис-НС1 буфере рН 7,48-7,5, содержащем 0,1-0,15 М КС1, и действием ультразвука с частотаэй 16-18 кгц, отделение клеточных остатков центрифугированием, обработ- . ка полученного супернатанта стрептомицин сульфатом , осаждение белков сульфатом аммония в количестве 68-70% от насьпцения, растворение осадка ацетокиназы и аденилаткиназы путем разбавления суспензии белков двухкратным объемом трис-НС буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30 - . 37% и удаление нерастворившегося осадТаким образом, ацетокиназу и аденилаткиназу получают комплексно на основе совместной грубой очистки из одного источника, а именно, из биомассы Е. coli. Это позволяет избежать трудоемких стадий очистки аденилаткиназы и ацетокиназы в отдельности и удешевить процесс за счет исключения дорогого и дефицитного сырья - мышц кролика и сокраще1шя расходов на реагенты и .оборудование. Описываемый способ получения ферментного препарата, содержащего аденйлаткиназу и ацетокиназу, заключается в следующем: биомассу Е. coli MRE600 разрушают сначала лизоцимом, а затем ультразвуком в трис-НС1 буфере, содержащем О,1-0,15 М КС1 (для полноты экстракщш белков) и получают грубьй экстракт. Такой способ разрушения биомассы позволяет вьщелить на стадии грубого экстракта в 10 раз большее количество единиц активности ацетокиназы и аденилаткиназы по сравнению с разрушением биомассы только лизоцимом или только ультразвуком Грубьй экстракт обрабатывают 3%-ным раствором стрептомицинсулЬфата для удаления нуклеиновых кислот. Затем проводят фракцнонирова- ние сульфатом аммония в следующем порядке: сначала осаждают белки при концентрации сульфата аммония 68-70% на- сыцения, а затем растворяют осаяаденные

белки доведением концентрации сульфата аммония до 30-37% наеьщения. Такая последовательность фракционирования сульфатом аммония позволяет получить в 2-3 раза большее количество единиц активности ацетокиназы и аденилаткиназы, чем при фракционировании сульфатом аммония в обычно принятой последовательности: сначала осаждение более низкой концентрацией, а затем - более высокой. Полученную фракцию белков используют как ферментный препарат. Ферментный препарат, полученньй описываемым способом, содержит ацетокиназу с удельной активностью 20-25 Е/мг и аденилаткиназу с удельной активностью 30-40 Б/мг. Полученный ферментный препарат может быть успешно использован для синтеза АТФ из АМФ и ацетилфосфзта. Для этого ферментньй препарат, предварительно обессолив на колонке с Сефадексом G-25 и одновременно произведя смену буфера, иммобилизуют известным способом,5 на BrCN-Сефарозе 4В. Через реактор проточного типа с иммобилизованным ферментным препаратом пропускают реакционную смесь, со. о

держай(ую АМФ, ацетилфосфат, Mg и в качестве затравки незначительное ко-/ лИчёство АТФ. Выход АТФ после реакции составляет 97-98% от запускаег ого количества АМФ.

Пример 1. Приготовление ферментного препарата.

100 г замороженной при - 40 С биомассы Б. coli МКБ-бОО измельчают в ступке, заливают 300 мп 0,1 М КС1 в 0,01 М трис-НС рН 7,5 с 2 мМ/ меркаптоэтанола, перемешивают при доОднородной суспензии, приливают раствор лизоцима в буфере (из расчета 1 мг лизоцима на 1 г биомассы) и перемешивают 10 мин. Затем сус. пензию озвучивают в ледяной бане на ультразвуковом дезинтеграторе (18 кгц) сеансами по 1 мин с перерывами в 1 мин. Общее, время озвучивания 20 мин. Суспензию центрифугируют в течение 40 мин при 10000 об/мин. Супернатант используют как грубьй экстракт, осадок отбрасывают.

Обработка экстракта стрептомицинсульфатом.

К 375 мг грубого экстракта приливают по каплям при тщательном перемешивании 43 мл 30%-ного раствора стрептомицинсульфата в 0,01 М трис-НС1, рН 7,5, содержащем 2 мМ -меркаптоэтанола, до конечной концен1рации стрептомицинсульфата 3%. После этого смесь перемешивают 20 мин. Затем центрифугируют (14000 об/мин, 40 мнн). Осадок отбрасывают. Супернатант подвергают дальнейшей обработке (фракция СС).

Фракционирование сульфатом аммония .

К 380 мл фракции СС при тщательном перемешивании на холоду присьтают небольшими порциями тонко растертые кристаллы сухого сульфата аммония (179,36 г) до конечной концентрации 70% насыщения по (N11 )2 30 . Затем раствор тщательно перемешивают 30 мин и центрифугируют (10000 об/мин, 30 мин). Супернатант Отбрасьшают. Осадок суспендируют в минимальном объеме 0,7 насьш1енного раствора сульфата аммония в 0,01 М трис- НС рН 7,5 + 2м /-меркаптоэтанол. Суспензию разбавляю в 2 раза с буфером и тщательно перемешивают 20 мин затем центрифугируют (14000/об/мин, 30 мин). Осадок отбрасывают, а Супернатант подтитровывают с 0,5 н КОН до рН 7,5. Полученный препарат (100 мп) разливают по 10 мл в герметичные полиэтиленовые флаконы и замораживают при (фракция О,70,37СА). В таком виде препарат хранится 6 месяцев без потери активности

Пример 2. Использование-комплексного- ферментного препарата, содержащего аценилаткиназу и ацетокиназу для синтеза АТФ.

10 мл фракции 0,7-0,37А размораживают на льду и нанЬсят на колонку с сефадексом G-25 (2,6 см х 40), предварительно уравновешенную О,1 М К-фосфатным буфером рН 7,8, содержащим 0,5 н. КС1 и 2 мМ ; тмеркаптоэтанол. После нанесения образца в колонку подают этот же раствор со скоростью 250 мл/ч. Оптическую плотность выходящего из колонки раствора регистри-руют с помощью проточного денситометра при длине волны 280 нм. Фракцию, содержащую белок, собирают отдельно и немедленно подвергают иммобилизации на BrCN-сефарозе.

Иммобилизация ферментного препарата на BrCN-сефарозе 4В.,

2 г сухой BrCN-сефарозы 4В (фирмы Pharmacia-, Швеция) промьшают на creioiHHHOM пористом фильтре 200 мл 0,001 н, НС1, затем 200 мл 0,1 М К-фосфата рН 7,8, содержащего О,5 Н КС1 и 2 м М -меркаптоэтанол. Отмытую BrCN-сефарозу переносят в чистый флакон вместимостью 15-20 мл. Туда же приливают 7 мл обессоленного ферментного препарата, содержащего 30 мг белка. Смесь легко встряхивают 16 час на холоду (+5 С). После иммобилизации содержимое флакона количественно переносят на стеклянный фильтр и промыч вают на колбе Бунзена.100 мл 1М КС1 в 0,001 М тряс-HClpH 7,5 для снятия ковалентно несвязанных белков. Затем иммобилизованный ферментный препарат (ИФП) встряхивают в течение 30 мин с 30 мл 1М трис-гНС рН 7,5 для экранирования непррреагирманных групп сорбента. После этого ИФП отмьшают на стеклянном пористом фильтре 100 мл 0,01 М трис-НС1рН 7,5, содержащего 2 мМ меркаптоэтанол, слегка отжимают, переносят в герметичный флакон с широким горлом и заливают 200 мл 0,01 М трисИС1 рН 7,5, содержащего 2 мМ АТФ,2мМ MgCl и 2 мМУ -меркаптоэтанол. В таком виде ИФП хранят при +4 С. Синтез АТФ. Синтез АХФ проводят в термостатйрУ емом реакторе проточного типа с иммр- билизованным ферментным препаратом (30 мг белка на 2 г BrCIJ-сефарозы 4В), содержащим 120 ед. ацетокиназы и 100 ед. акт аденилаткиназы. Реакционну смесь следующего состава: 20 Ш АМФ, 2 мМ АТФ, 80 мМ ацетилфосфат, 20 м1Л MgCl, 2 мМу -меркаптоэтанол, 50 мИ трис-НС1 рН 7,5, пропускают через колонку с ИФП, термостатируемую при 37 С 83 610 со скоростью 20 мл/ч. При этом глуби1|а синтеза АТФ составляет не ниже 97,5%. Производительность такого реактора составляет 5 г АТФ в сутки (0,21 г АТф/ч) при его объеме 2 мл. Производительность реактора с частично очищенным ферментным препаратом, содержащим ацетокиназу и аденилаткиназу, и производительность реактора с высокоочищенными ферментами 5 одинакова в пересчете на количество единиц активности фермента, .связанного с матрицей. Преимуществами описьшаёмого способа являются использование одного источника вместо двух источников ферментов - биомассы Е. coll - т.е. упрощение способа; проведение вместо многостадийной (14 стадий) и тонкой очистки каясдого из ферментов четырех, стадийного вьщеления и грубой очистки ферментов; исключение использования пищевого сырья - мьщщ кролика; уменьщение расхода реагентов на очистку ферментов, не требуется сложное аппаратурное оформление. -I.- . При использовании в широких масштабах синтеза АТФ на и a foбилизoвaнныx ферментах, что является наиболее перспективным для полученная АТФ, самой трудоемкой и дорогостоящей стадией является вьщеление ферментов. Поэтому использование вместо высокоочищенньрс ферментов из разных источников, грубоочищенного ферментного препарата из одного источника является экрномически более перспективным.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ФЕРГ-ШНТНОГО ПРЕПАРАТА АЦЕТОКИНА- ЗЫ ИАДЕНИЛАТКИНАЗЫИЗ БИОМАССЫ Е. COLI, о т л и ч а ю щ и и с я тем^ что биомассу Е. coli разрушают путем обработки ее раствором ЛИЗоцю<а в трис-^НС! буфере рН 7,48-7,5, содержащем О,1 - О,15 М KCI, и действием ультразвука с частотой 16-18 кГц, отделяют клеточные остатки центрифугированием, полученный супернатант обрабатывают стреп- томицинсульфатом, после чего осаждают из него белки сульфатом аммония в количестве 68-70% от насыщения с последующим растворением осадка ацетокина- зы и аденилаткинапы путём разбавления суспензии белков двукратным объемом трис-НС1 буфера рН 7,48-7,5 до концентрации сульфата аммония 30-37% и удалением нерастворившегося осадка.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стрептомицин- сульфат используют в количестве 1-3%.(Я