СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИГИПОКСИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2009 года по МПК A61K36/185 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения лекарственного средства из растительного сырья, обладающего антигипоксическим действием.

Имеются комплексные синтетические антигипоксические средства, включающие бемитил, пирацетам (Патент 2150273), 3,5-диамино-1,2,4-тиадиазол с полиглюкином (Патент 2096043). Эти препараты могут вызывать побочные эффекты, в частности местнораздражающее действие при парентеральном введении.

Известные антигипоксические средства на основе растительного сырья извлекаются, как правило, растворителями. Средство, обладающее антигипоксическим действием, содержит вытяжку экстрактивных веществ 40% этиловым спиртом из высушенной живокости высокой (Заявка №2006124332). Известно средство, представляющее собой спиртовую вытяжку из лепестков гибискуса (Патент 2144373), корня женьшеня (Патент 2125458), не обладающие гепатотоксическим действием и не вызывающие побочных реакций.

Наиболее близким к предлагаемому является средство, обладающее антигипоксическим действием, из листьев липы Folia Tilia. Его получают методом дробной мацерации или перколяции в течение длительного времени сначала водой, затем спиртом, извлекают экстрактивные вещества (Патент 2213570). Однако использование в качестве растворителя этилового спирта ограничивает область применения этого средства для больных, не переносящих действие алкоголя, а также для детей.

Для подготовки растительного сырья известны способы получения высокодисперсных порошков из крапивы для производства напитков, вкусовых приправ, сухих концентратов, детского и диетического питания, а также в виде добавок в мороженое и кондитерские изделия (Заявка №93036480, РФ, 1997 г.). Они включают стадии сушки, охлаждения и измельчения частиц до размера 20-30 мкм. Известен способ получения крапивного порошкообразного полуфабриката с размерами 20-30 мкм, при котором зеленую массу сушат инфракрасными лучами и нагретым воздухом при температуре 60-80°С в слое 8-18 мм, что позволяет сохранить биологически активные вещества (Патент 2154957, РФ, 2000 г.).

Наиболее близким по техническому решению является способ получения порошков из растительного сырья, заключающийся в сушке, измельчении в вакууме и одновременном воздействии на сырье мелющими телами в вибрационном поле; вакуумирование осуществляют до остаточного давления не более 131,6 Па (Патент 2064477, РФ, 1996 г.). Однако измельчение сырья до микрометровых размеров частиц не позволяет в полной мере извлечь биологически активные вещества.

Задача изобретения - создание средства из растительного сырья, обладающего антигипоксическим действием, способа его получения, расширение ассортимента антигипоксических средств, упрощение технологии, повышение биодоступности антигипоксического средства.

Антигипоксическое средство на основе растительного сырья представляет собой порошок нанодиспергированных до размеров 50-90 нм листьев и стеблей крапивы.

Технический результат получают благодаря тому, что сухие листья и стебли крапивы, влажность которых не более 4-6 мас.%, измельчают в шаровых мельницах планетарного, вибрационного, виброцентробежного, роликового типов, обеспечивающих ускорение мелющих тел, например шаров, до 400 м/с². Механическую обработку проводят в среде аргона или азота для обеспечения сохранности каротиноидов.

Содержание экстрактивных жирорастворимых веществ и каротиноидов в диспергированной крапиве определяют следующим образом. Измельченное сырье заливают хлороформом в соотношении порошок крапивы : растворитель 1:10, перемешивают в течение 30 минут. По окончании экстракции раствор фильтруют через плотные бумажные фильтры в мерные колбы. Фильтры промывают хлороформом. На спектрофотометре в диапазоне длин волн 400-700 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм проводят измерение оптической плотности экстрактов. Для определения содержания суммы каротиноидов измеряют оптическую плотность экстрактов при длине волны 450 нм. Раствор сравнения - хлороформ.

Содержание суммы каротиноидов (С) в % в пересчете на β-каротин в абсолютно сухом сырье рассчитывают по формуле

С=D·V·100·/E·m·(100-W),

где D - оптическая плотность испытуемого экстракта;

V - объем раствора в мл;

Е - удельный показатель поглощения 1% раствора β-каротина в хлороформе при длине волны 450 нм = 2335;

m - навеска сырья, г;

W - влажность образца, отн.%, полученная при высушивании исследуемого образца в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы.

В изобретении использованы листья и стебли крапивы двудомной (Urtica dioica L).

В таблице 1 приведены экспериментальные данные по нанодиспергированию крапивы с целью повышения в целевом продукте содержания биологически активных веществ - каротиноидов.

Пример 1. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 4 мас.%, измельчают в мельнице до размера частиц 20 мкм. Для определения экстрактивных веществ и содержания каротиноидов взвешивают 100 г порошка крапивы. Для определения содержания экстрактивных веществ измельченное сырье заливают хлороформом в соотношении порошок крапивы : растворитель 1:10, перемешивают в течение 30 минут, упаривают на роторном испарителе при остаточном давлении 0,1-0,5 Па и температуре 30°С, высушивают до постоянного веса и взвешивают. Данные приведены в таблице 1. Содержание экстрактивных веществ увеличилось в 100 раз по сравнению с сырьем, измельченным до 1 мм (пример 11). Количество каротиноидов повышается незначительно.

Пример 3. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 6 мас.%. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу планетарного типа АГО. Измельчение проводят в воздушной среде до размера частиц 50 нм при ускорении мелющих тел - шаров 400 м/с². Ускорение мелющих тел - шаров 300 м/с². Выход экстрактивных веществ и содержание каротиноидов определяют по методике, приведенной в примере 1. В табл.1 показано увеличение выхода экстрактивных веществ более чем в 100 раз и при этом соответственно повышается количества каротиноидов.

Пример 5. Листья и стебли крапивы содержат 10 мас.% влаги. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу планетарного типа АГО. Измельчение проводят в воздушной среде до размера частиц 90 мкм при ускорении мелющих тел - шаров 400 м/с². Выход экстрактивных веществ и содержание каротиноидов определяют по методике, приведенной в примере 1. В табл.1 показано, что увеличение влажности сырья приводит к снижению выхода каротиноидов.

Пример 7. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 4 мас.%. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу планетарного типа АГО. Диспергирование проводят в среде аргона до размера частиц 90 нм при ускорении мелющих тел - шаров 300 м/с². Выход экстрактивных веществ и содержание каротиноидов определяют по методике, приведенной в примере 1. В табл.1 отмечен максимальный выход экстрактивных веществ и каротиноидов.

Пример 8. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 4 мас.%. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу виброцентробежного типа. Измельчение проводят в среде аргона до размера частиц 90 нм при ускорении мелющих тел - шаров 400 м/с². Выход экстрактивных веществ и содержание каротиноидов определяют по методике, приведенной в примере 1. В табл.1 приведен выход экстрактивных веществ и каротиноидов.

Пример 9. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 4 мас.%. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу роликового типа. Измельчение проводят в среде аргона до размера частиц 90 нм при помощи металлических роликов, укрепленных на вращающемся роторе. Выход экстрактивных веществ и содержание каротиноидов определяют по методике, приведенной в примере 1. В табл.1 приведен выход экстрактивных веществ и каротиноидов.

Как видно из примеров, механическая обработка в виброактиваторе с измельчением сырья до размера частиц 50-90 нм позволяет в полной мере разрушить межмолекулярные и межагрегативные связи в комплексах органоминеральных компонентов и перевести в свободное биодоступное состояние биологически активные вещества - каротиноиды.

Исследование антигипоксического действия порошка наноизмельченной крапивы проводили на 170 беспородных белых мышах самцах массой 18-22 грамма. Для этого использовали модель гипобарической гипоксической гипоксии (% погибших животных на высоте 10500 м при 20 мин экспозиции). Для создания необходимого разрежения использовали барокамеру «Ока-МТ». Фиксировали время гибели животных в минутах.

Объектом исследования служил порошок крапивы, измельченный по предлагаемому способу до 50 нм. В качестве препаратов сравнения использовали Ноотропил (Пирацетам), обладающий антигипоксической активностью, производства ЮСБ Фарма Сектор (Бельгия), в дозе 300 мг/кг, листья крапивы измельченные до 1 мм и настой из листьев крапивы (аптечный). Животные опытных групп в течение десяти дней (последнее введение за 2 часа до гипоксии) получали порошки измельченной и нанодиспергированной крапивы в виде водной суспензии внутрижелудочно через зонд в дозе 100 мг/кг. Доза для настоя листьев крапивы составляла 100 мг/кг в пересчете на содержание экстрактивных веществ. По аналогичной схеме вводили внутрижелудочно ноотропил в дозе 300 мг/кг один раз в сутки в течение 10 дней, последнее введение за 2 часа до гипоксии. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество растворителя - воду очищенную.

Результаты исследований обрабатывали, используя параметрический (t-критерий Стьюдента) и непараметрические (U-критерий Манна-Уитни, W-критерий Вилкоксона и χ²-критерий) методы с определением средней арифметической (X) и ее стандартной ошибки (m). Значимость различий считали достоверной при P_t, P_u<0,05 [1, 2]. Расчеты проводили с использованием программы Statistica 6.0 для Windows.

В табл.2 приведены результаты определения антигипоксического эффекта средства на основе крапивы, полученного предлагаемым способом. В условиях гипобарической гипоксии средняя продолжительность жизни контрольных животных составляла 12,4 мин, летальность от гипоксии достигала 90%. Препарат сравнения нотропил увеличивал в 1,6 раза продолжительность жизни, летальность уменьшалась в 1,8 раза (строка 2). Терапия суспензией листьев крапивы, измельченных до 1 мм, не была достоверно эффективной (табл.2). Применение настоя листьев крапивы удлиняла время жизни в 1,3 раза, но не влияло на показатель выживаемости. Суспензия порошка наноизмельченных листьев крапивы обладала антигипоксическим действием, продолжительность жизни животных увеличивалась в 1,5 раза, количество погибших животных за 20 мин уменьшалось в 1,4 раза.

Таким образом, более эффективным антигипоксическим эффектом обладает суспензия листьев крапивы, измельченной до 50-90 нм, которая не уступает по активности препарату сравнения - ноотропилу.

Измельчение листьев крапивы до 50-90 нм способствует высвобождению каротиноидов из связанных комплексов и повышению их суммарного выхода. Выход каротиноидов возрастает в 15-20 раз по сравнению с крапивой, измельченной до 1 мм. Снижение содержания влаги в сырье и создание инертной среды в зоне механообработки обеспечивает сохранность биологически активных веществ.

Таблица 1 Влияние условий нанодиспергирования на выход экстрактивных веществ из листьев крапивы № Влажность сырья, мас.% Среда Размеры частиц сырья Содержание экстрактивных веществ, % Содержание каротиноидов, мг % 1 4 воздух 20 мкм 13,5 89 2 4 воздух 50 нм 22,7 155 3 6 воздух 50 нм 20,0 141 4 6 воздух 90 нм 21,1 142 5 10 воздух 90 нм 18,1 103 6 4 аргон 20 мкм 16,4 96 7 4 аргон 50 нм 30,8 181 8 6 аргон 50 нм 29,3 167 9 6 аргон 90 нм 29,0 170 10 10 аргон 90 мн 10,5 108 11 (пр) 4 воздух 1 мм 0,13 78

Таблица 2 Влияние суспензии листьев крапивы, полученной с помощью нанотехнологии, на выживаемость животных в условиях гипобарической гипоксии № Группы животных Время жизни, мин t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни Летальность от гипоксии % χ²-критерий, W-критерий Вилкоксона 1 Контроль 12,41±0,69 90% 2 Ноотропил 20,33±1,58¹ 50%¹ 3 Крапива миллиразмер 14,451,19² 85%² 4 Настой крапивы 16,45±1,55¹ 80%² 5 Крапива наноразмер 18,30±1,62^1,3 65%^1,3 Примечание: ¹ - достоверное различие (Р<0,05) по сравнению с контролем; ² - достоверное различие (Р<0,05) по сравнению с ноотропилом; ³ - достоверное различие (Р<0,05) по сравнению с крапивой миллиразмер.

Изобретение относится к созданию средства из растительного сырья, обладающего антигипоксическим действием. Средство, обладающее антигипоксическим действием, на основе растительного сырья содержит порошок листьев и стеблей крапивы, нанодиспергированных до размеров 50-90 нм. Способ получения средства, обладающего антигипоксическим действием, включает сушку и измельчение растительного сырья, воздействуя на сырье мелющими телами, при этом листья и стебли крапивы сушат до остаточной влажности 4-6 мас.%, измельчают до размеров 50-90 нм в шаровых мельницах планетарного, вибрационного, виброцентробежного, роликового типов, обеспечивающих ускорение мелющих тел, например шаров, до 400 м/с² в среде аргона или азота. Экспериментально показано, что средство, полученное данным способом, значительно увеличивает показатель выживаемости по сравнению с пирацетамом. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.

1. Средство, обладающее антигипоксическим действием, на основе растительного сырья, отличающееся тем, что оно содержит порошок листьев и стеблей крапивы, нанодиспергированных до размеров 50-90 нм.

2. Способ получения средства, обладающего антигипоксическим действием, путем сушки и измельчения растительного сырья, воздействуя на сырье мелющими телами, отличающийся тем, что листья и стебли крапивы сушат до остаточной влажности 4-6 мас.%, измельчают до размеров 50-90 нм в шаровых мельницах планетарного, вибрационного, виброцентробежного, роликового типов, обеспечивающих ускорение мелющих тел, например шаров, до 400 м/с² в среде аргона или азота.