СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНЫХ СТАНДАРТОВ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 G01N1/30 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биологии и может использоваться при проведении научно-исследовательских работ, направленных на изучение локализации и концентрации химических соединений в тканях биологических объектов.

Известен способ количественной оценки интенсивности гистохимического окрашивания гистологических срезов с применением цитоспектрофометра путем оценки оптической плотности (D), являющейся производной от пропускания света исследуемым объектом (Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофотометрия. Аппаратура и методы анализа клеток по светопоглощению. Л., Наука, 1977. - С.257-258).

Однако применение данного метода не дает информации об истинной химической концентрации анализируемого вещества (гистологического красителя) в выбранном участке гистологического препарата, так как отсутствует этап сравнения результата измерений с данными, полученными для градуировочных стандартов.

Известен способ фотометрического определения количества анализируемого вещества с использованием видеоизмерительного комплекса, основанный на измерении оптической плотности раствора анализируемого соединения путем преобразования аналогового сигнала цветного видеоизображения пробы в цифровой сигнал с последующей его обработкой на ЭВМ по параметрам международной колориметрической системы RGB путем сравнения параметра PGB анализируемой пробы с параметрами RGB градуировочных стандартов (Заявка №95110105 РФ, МПК⁶ G01J 3/46. Способ фотометрического определения количества анализируемого вещества с использованием видеоизмерительного комплекса /Холстов В.И., Кучинский Е.В., Маханьков Ю.Д., Щербин СИ., Попов СВ., Ведехин А.В., Войсковая часть 61469 (РФ). - Заявл. 1995.06.14; опубл. 1997.06.20).

Однако данная методика применима для анализа жидких проб и не подходит для количественного исследования такого объекта, как окрашенный гистологический срез, монтированный на предметное стекло. Кроме того, результаты анализа оцифрованных изображений гистологических препаратов зависят от стандартизации условий цифровой фотосъемки, таких как освещенность и выставление баланса белого.

Известен также способ количественной оценки интенсивности гистохимического окрашивания гистологических срезов, основанный на анализе оптической плотности в участках оцифрованных изображений гистологических препаратов (Ирьянов Ю.М. Обработка и анализ изображений в гистологических исследованиях с применением стандартных комьютерных программ. / Ю.М.Ирьянов, Т.А.Силантьева, Е.Н.Горбач, Е.В.Осипова, Т.Ю.Ирьянова // Морфологические ведомости №1-2. - 2004. - С.11-13).

Однако применение этого метода не дает информации об истинной химической концентрации анализируемого вещества (гистологического красителя) в выбранном участке гистологического препарата, так как отсутствует этап сравнения результата измерений с данными, полученными для градуировочных стандартов. Кроме того, результаты анализа оцифрованных изображений гистологических препаратов зависят от стандартизации условий цифровой фотосъемки, таких как освещенность и выставление баланса белого.

Задачей изобретения является объективизация оценки интенсивности гистохимических реакций для определения концентрации метилового зеленого и пиронина в ядре и цитоплазме гепатоцитов.

Поставленная задача решается тем, что в способе изготовления градуировочных стандартов, включающем изготовление гистологических препаратов, имеющих известное количество анализируемого вещества, отличающемся тем, что на основе водного раствора желатина приготовляют серию растворов с различными концентрациями водорастворимого гистохимического красителя, которые полимеризуют, вырезают блоки, затем их замораживают и изготавливают криостатные срезы заданной толщины.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием и примером его практического использования.

Фиг.1 - фото градуировочных гистологических препаратов - стандартов толщиной 7-8 мкм с известной концентрацией красителя, окрашенных пиронином и метиловым зеленым.

Фиг.2 - соответствие интенсивности окрашивания градуировочных стандартов оптической плотности оцифрованного изображения (D) и концентрации гистохимического красителя (С, г/л).

Фиг.3 - график калибровочной функции, которая представляет собой зависимость между концентрацией красителя и вычисленным значением оптической плотности для градуировочных стандартов: А - метилового зеленого; Б - пиронина. В пересечениях пунктирных линий на графике располагаются точки, соответствующие измеренным значениям оптической плотности и определяемым значениям концентрации красителя: 1 - в цитоплазме; 2 - в ядре гепатоцитов.

Фиг.4 - оцифрованные изображения парафиновых срезов печени, окрашенных: А - метиловым зеленым; Б - пиронином. Об. 40, ок. 10. Одиночными стрелками указаны ядра, двойными - цитоплазма гепатоцитов.

Способ осуществляется следующим образом. На основе водного раствора желатина и водорастворимого гистохимического красителя приготовляют серию разведений с известной концентрацией компонентов. Готовые растворы полимеризуют при пониженной температуре выше точки замерзания, вырезают из них блоки, которые замораживают, избегая кристаллизации растворителя, и изготавливают криостатные срезы заданной толщины. Срезы монтируют на предметные стекла и получают гистологические препараты, представляющие собой градуировочные стандарты для полуколичественной и количественной оценки интенсивности гистохимического окрашивания срезов биологических тканей.

Практическое использование заявляемого способа иллюстрируется примером на основе гистологического препарата №4427.

Для каждого из двух водорастворимых гистохимических красителей (метиловый зеленый и пиронин) приготовили насыщенные растворы и определили их концентрацию, следуя определенному регламенту. Первоначально подготовили и промаркировали пенициллиновый флакон и лист фильтровальной бумаги; во флакон внесли заведомо избыточное количество красителя и высушили его вместе с фильтровальной бумагой до достижения постоянного веса. На аналитических весах измерили совокупную массу флакона, листа фильтровальной бумаги и стеклянной воронки небольшого диаметра (m₁, г). Во флакон долили заведомо недостаточный объем дистиллированной воды (подбирается эмпирически), приготовили насыщенный раствор, профильтровали его в мерную пробирку через подготовленный лист, затем измерили полученный объем жидкости (V, л). Флакон, использованный лист фильтровальной бумаги и стеклянную воронку высушили до постоянного веса и определили совокупную массу (m₂, г). Далее вычитанием значения m₁ из m₂ получили массу красителя, растворенного в дистиллированной воде (m₃, г). По полученным значениям m₃ и V вычислили концентрацию насыщенного раствора красителя С, г/л.

Из полученных растворов приготовили серии разведений в коллоидном растворе желатина при температуре 37°С с конечной концентрацией желатина 20%. Желатиновые растворы красителей разлили в пластиковые контейнеры объемом около 1 см³ и поместили для полимеризации в холодильную камеру бытового холодильника. Через сутки из образцов, имеющих консистенцию плотного геля, лезвием вырезали блоки размером 5×5×5 мм, заморозили их в жидком азоте для предотвращения кристаллизации воды и поместили на охлажденные блокодержатели криомикротома, после чего изготовили криостатные срезы толщиной 7-8 мкм. Срезы разместили на заранее маркированных с указанием конечных концентраций красителя предметных стеклах (не менее 5 срезов на стекло), высушили на воздухе и заключили под покровные стекла в канадский бальзам (Фиг.1).

Изготовленные таким образом градуировочные стандарты просматривали перед микроскопированием окрашенных теми же гистохимическими красителями гистологических препаратов такой же толщины (для стандартизации визуальной полуколичественной оценки) либо фотографировали с использованием цифровой фотокамеры, обладающей функцией выставления баланса белого и смонтированной на исследовательском микроскопе. При этом выбор объектива микроскопа определялся увеличением, при котором проводили исследование гистологических препаратов биологической ткани. Процедуру цифровой съемки градуировочных стандартов выполняли после выставления баланса белого в начале каждого сеанса оцифровки изображений гистохимически окрашенных гистологических препаратов. На полученных изображениях оценивали оптическую плотность в соответствии с известной методикой (Фиг.2). Значения оптической плотности использовали для построения графика калибровочной функции, которая представляет собой зависимость между концентрацией красителя в градуировочном стандарте (по оси абсцисс) и вычисленным значением оптической плотности (по оси ординат) (Фиг.3).

На цифровых изображениях гистологических препаратов печени, окрашенных метиловым зеленым и пиронином (Фиг.4), проводили измерения и вычисляли оптическую плотность в участках, соответствующих профилям ядер и цитоплазмы гепатоцитов. Соответствующие значения концентраций красителей определяли графически (Фиг.3). Концентрация метилового зеленого в цитоплазме гепатоцитов составляла 3,12, в ядре - 3,71; пиронина - соответственно 6,82 и 7,22 (г/л).

Предложенный способ изготовления градуировочных стандартов используется в ФГУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А.Илизарова Росмедтехнологий». Он позволяет получить наборы гистологических препаратов со срезами печени известной толщины и объективизировать оценку интенсивности гистохимических реакций с определением концентрации метилового зеленого и пиронина в ядре и цитоплазме гепатоцитов.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биологии и может быть использовано при изучении локализации и концентрации химических соединений в тканях биологических объектов. Сущность способа изготовления градуировочных стандартов, имеющих известное количество анализируемого вещества, заключается в том, что для оценки интенсивности гистохимических реакций готовят серию растворов на основе 20% водного раствора желатина с различными концентрациями метилового зеленого и пиронина, которые полимеризуют, вырезают блоки, замораживают и изготавливают криостатные срезы такой же толщины, что и исследуемые гистологические препараты биологической ткани. Использование предлагаемого способа позволяет объективизировать оценку интенсивности гистохимических реакций с определением концентрации метилового зеленого и пиронина в ядре и цитоплазме гепатоцитов. 4 ил.

Способ изготовления градуировочных стандартов, имеющих известное количество анализируемого вещества, отличающийся тем, что для оценки интенсивности гистохимических реакций готовят серию растворов на основе 20%-ного водного раствора желатина с различными концентрациями метилового зеленого и пиронина, которые полимеризуют, вырезают блоки, замораживают и изготавливают криостатные срезы такой же толщины, что и исследуемые гистологические препараты биологической ткани.