ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ СИНТЕЗА БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2009 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к векторам для экспрессии трансгенов в клетках млекопитающих с целью их применения в клеточной инженерии и в генной терапии. Векторы в соответствии с данным изобретением могут применяться для трансфекции широкого спектра эукариотических клеток. Они также могут применяться для трансфекции клеток млекопитающих in vivo, в частности для генной терапии.

В настоящее время плазмидные векторы являются одним из возможных средств доставки трансгенов и экспрессии белков. Традиционный плазмидный вектор для экспрессии трансгенов в клетках млекопитающих (например, вектор pcDNA3.1 компании Invitrogen) содержит такие функциональные элементы, как промотор ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), участок клонирования, сигнал полиаденилирования мРНК гена гормона роста быка, ген устойчивости к антибиотику G418, ген β-лактамазы, обеспецивающий устойчивость к ампициллину, участок инициации репликации Col E1 [Invitrogen, Каталог 2002 г., с.159].

С целью усиления экспрессии трансгенов было предложено вводить в его состав такие регуляторные элементы, как интронные последовательности различных генов, последовательности инициации трансляции, посттранскрипционные и транспортные элементы и т.д. [Romano G. "Current development of nonviral-mediated gene transfer." Drug News Pespect. (2007), v.20, pp.227-231]. Каждый из подобных элементов в отдельности позволяет увеличить экспрессию трансгена, причем величина эффекта, как правило, зависит от выбранной модельной системы экспрессии.

В качестве интронной последовательности, в частности, используется последовательность IVS2 из гена бета-глобина кролика, которая помещается в плазмидный вектор непосредственно после промотора [van Ooyen A., van den Berg J., Mantei N., Weissmann C. "Comparison of total sequence of a cloned rabbit beta-globin gene and its flanking regions with a homologous mouse sequence." Science (1979), v.206, pp.337-344]. Данный элемент используется, например, в плазмидном векторе pVSV-G компании Clontech, предназначенном для экспрессии белка оболочки вируса везикулярного стоматита [BD Biosciences Clontech, Каталог 2002 г., стр.128]. По опубликованным данным подобный элемент позволяет усилить экспрессию трансгена в 1,6 раз [Yew N.S., Wysokenski D.M., Wang K.X., Ziegler R.J., Marshall J, McNeilly D., Cherry M., Osburn W., Cheng S.H. "Optimization of plasmid vectors for high-level expression in lung epithelial cells." Hum Gene Ther. (1997), v.8, pp.575-584].

Известно использование в качестве посттранскрипционного регуляторного элемента, который, по-видимому, облегчает транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, последовательности WPRE из вируса гепатита североамериканского лесного сурка, которую помещают в плазмидный вектор между сайтом встраивания трансгена и сигналом полиаденилирования. Этот элемент позволяет увеличить уровень экспрессии гена в 5-8 раз [Zufferey R., Donello J.E., Trono D., Hope T.J. "Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors." Journal of Virology (1999), v.73, pp.2886-2892]. Он применяется, в частности, в лентивирусном векторе pCDH-CMV-MCS компании SBI [http://www.systembio.com/cDNA_Cloning_Vectors.htm].

Наиболее близким в заявляемому является вектор pGL3 -Promoter Vector компании Promega [Promega, Каталог 2000 г., с.10.7], который предназначен для экспрессии гена люциферазы и состоит из следующих элементов: промотор ранних генов вируса SV40, последовательность инициации трансляции, ген люциферазы Photinus Pyralis с модифицированной кодонной последовательностью, сигнал полиаденирования поздних генов вируса SV40, последовательность инициации репликации (origin) E.coli, ген β-лактамазы, обеспецивающий устойчивость к ампициллину, последовательность инициации репликации (origin) фага F1 и дополнительный синтетический сигнал полиаденилирования. Элементы вектора перечислены в порядке их расположения. Дополнительным функциональным элементом в данном векторе является последовательность инициации трансляции.

Технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлась разработка более эффективного эукариотического вектора, позволяющего обеспечить достижение более высокого уровня экспрессии трансгенов в клетках.

Технический результат достигался созданием вектора, общая схема которого представлена на фиг.1.

Вектор состоит из следующих элементов: промотор ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), интрон, последовательность инициации трансляции, участок клонирования, посттранскрипционный регуляторный элемент, сигнал полиаденилирования мРНК гена гормона роста быка, сигнал полиаденилирования мРНК ранних генов вируса SV40, ген β-лактамазы, обеспецивающий устойчивость к ампициллину, участок инициации репликации Col E1. Элементы вектора перечислены в порядке их расположения.

В качестве последовательности инициации трансляции может использоваться последовательность инициации трансляции из вектора pGL3-Promoter Vector компании Promega. В качестве интрона используется последовательность IVS2 гена бета-глобина кролика, а в качестве посттранскрипционного регуляторного элемента - модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита лесного сурка (WPRE).

Полная последовательность нуклеотидов предложенного вектора в случае использования названных элементов приведена на фиг.2.

Существенными отличиями заявляемого изобретения является то, что вместо экспрессионных векторов с традиционными функциональными элементами в виде промотора и сигнала полиаденилирования, а также векторов следующего поколения, содержащих один дополнительный регуляторный элемент, обеспечивающий усиление экспрессии трансгена, сконструирован вектор, в котором содержится сразу три таких дополнительных элемента, эффекты которых могут взаимно усиливаться. В частности, в наиболее близком векторе pGL3-Promoter Vector отсутствуют два из названных элементов, а именно интрон и посттранскрипционный регуляторный элемент.

Функциональная схема предложенного вектора приведена на фиг.1.

Существо и промышленная применимость изобретения (в биотехнологии и генной терапии) иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Создание плазмидного вектора pC4W для высокоэффективной экспрессии трансгена.

Вектор был получен с использованием стандартных методов генной инженерии, коммерчески доступных плазмид и химически синтезированных олигонуклеотидов [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989].

Вектор состоит из функциональных элементов, перечисленных ниже в порядке их расположения:

1) промотор ранних генов цитомегаловируса человека (CMV) предназначен для транскрипции мРНК, кодирующей трансгенный белок;

2) интрон IVS2 гена бета-глобина кролика предназначен для сплайсинга мРНК и усиления экспрессии трансгена;

3) последовательность инициации трансляции предназначена для эффективного связывания рибосом;

4) участок клонирования предназначен для встраивания последовательности ДНК, кодирующей трансгенный белок;

5) модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита лесного сурка (WPRE) предназначен для эффективного транспорта мРНК из ядра в цитоплазму и усиления экспрессии трансгена;

6) сигнал полиаденилирования мРНК гена гормона роста быка предназначен для правильного процессинга мРНК и добавления последавтельности поли(А) на 3'-конец мРНК;

7) сигнал полиаденилирования мРНК ранних генов вируса SV40 предназначен для улучшения процессинга мРНК;

8) ген устойчивости к ампициллину (β-лактамаза) предназначен для отбора бактерий, содержащих вектор pC4W, в процессе его наработки;

9) Участок инициации репликации Col E1 предназначен для репликации вектора pC4W, в бактериях E.coli.

Функциональная схема вектора pC4W с указанием координат функциональных элементов представлена на фиг.1, а полная нуклеотидная последовательность этого вектора представлена на фиг.2. Порядок расположения функциональных элементов является существенным для эффективной работы вектора.

Пример 2. Сравнение двух векторов, различающихся наличием одного дополнительного функционального элемента (последовательности инициации трансляции из вектора pGL3-Promoter Vector компании Promega).

Клетки НЕК293, высеянные в лунки 24-луночной плашки (50000 клеток на лунку) в среде DMEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки, трансфицировали векторами pcDNA3-Luc или pcDNA3-K-Luc, несущими последовательность кДНК люциферазы. Вектор pcDNA3-K-Luc содержит также последовательность инициации трансляции из вектора pGL3-Promoter Vector компании Promega (К). Трансфекцию проводили с использованием 1 мкг ДНК и 1 мкл реагента Липофектамин 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Через 24, 48 и 72 ч после трансфекции клетки лизировали и измеряли активность люциферазы с использованием набора компании Beckton-Dickinson и люминометра 1250 компании LKB. Измерения проводили в 3 параллелях и определяли среднее значение и стандартное отклонение. Полученные данные представлены на фиг.3.

Пример 3. Сравнение векторов с различным набором дополнительных функциональных элементов.

Клетки НЕК293, высеянные в лунки 24-луночной плашки (50000 клеток на лунку) в среде DMEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки, трансфицировали следующими векторами: pCMV-K-GL3 (содержащим в качестве единственного дополнительного функционального элемента последовательность инициации трансляции, К), pCMV-INT-K-GL3 (содержащим помимо элемента К второй дополнительный элемент - последовательность IVS2 из гена бета-глобина кролика, INT), pCMV-K-GL3-WPRE (содержащим помимо элемента К второй дополнительный элемент - модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита лесного сурка, WPRE) и pCMV-INT-K-GL3-WPRE (содержащим все три дополнительных функциональных элемента - К, INT и WPRE). Трансфекцию проводили с использованием 1 мкг ДНК и 1 мкл реагента Липофектамин 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Через 24, 48 и 72 ч после трансфекции клетки лизировали и измеряли активность люциферазы с использованием набора компании Beckton-Dickinson и люминометра 1250 компании LKB. Измерения проводили в 3 параллелях и определяли среднее значение и стандартное отклонение. Полученные данные представлены на фиг.4.

Пример 4. Сравнивали способность плазмидных векторов pC4W и pcDNA3 (Invitrogen) экспрессировать люциферазу из светляка Photinus pyralis в культуре клеток почки эмбриона человека НЕК293.

Клетки НЕК293, высеянные в лунки 24-луночной плашки (50000 клеток на лунку) в среде DMEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки, трансфицировали векторами pC4W-Luc или pcDNA3-Luc, несущими последовательность кДНК люциферазы. Трансфекцию проводили с использованием 1 мкг ДНК и 1 мкл реагента Липофектамин 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Через 24, 48 и 72 ч после трансфекции клетки лизировали и измеряли активность люциферазы с использованием набора компании Beckton-Dickinson и люминометра 1250 компании LKB. Измерения проводили в 4 параллелях и определяли среднее значение и стандартное отклонение. Полученные данные представлены на фиг.5.

Пример 5. Сравнивали способность плазмидных векторов pC4W и pcDNA3 (Invitrogen) экспрессировать урокиназу человека в культуре клеток почки эмбриона человека НЕК293.

Клетки НЕК293, высеянные в лунки 24-луночной плашки (50000 клеток на лунку) в среде DMEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки, трансфицировали векторами pC4W-UPA или pcDNA3-UPA, несущими последовательность кДНК урокиназы человека, а также контрольным вектором pC4W. Трансфекцию проводили с использованием 1 мкг ДНК и 1 мкл реагента Липофектамин 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Через 24, 48 и 72 ч после трансфекции клетки культуральную среду собирали и заменяли на свежую. Анализировали накопление урокиназы в культуральной среде за каждые 24 часа между сменами среды. Ингибитор урокиназы, присутствующий в эмбриональной телячьей сыворотке, инактивировали добавлением к среде соляной кислоты до рН 3,0 на 15 мин, после чего среду нейтрализовали добавлением раствора NaOH до рН 7,5. В обработанной таким образом среде измеряли активность урокиназы с использованием хромогенного субстрата S-2444 (Sigma). Измерения проводили в 4 параллелях и определяли среднее значение и стандартное отклонение. Полученные данные представлены на фиг.6.

Пример 6. Сравнивали способность плазмидных векторов pC4W и pcDNA3 экспрессировать красный флуоресцентный белок DsRed-Express из морской анемоны Discosoma в клетках в культуре клеток почки эмбриона человека НЕК293.

Клетки НЕК293, высеянные в лунки 24-луночной плашки (50000 клеток на лунку) в среде DMEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки, трансфицировали векторами pC4W-DsRed или pcDNA3-DsRed, несущими модифицированную последовательность кДНК DsRed, а также контрольным вектором pC4W. Трансфекцию проводили с использованием 1 мкг ДНК и 1 мкл реагента Липофектамин 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Через 24, 48 и 72 ч после трансфекции клетки собирали, фиксировали 1%-ным формальдегидом и измеряли средний уровень флуоресенции в красной области при длине волны возбуждения 488 нм с использованием проточного цитофлуориметра FACS Calibur (BD). Измерения проводили в 4 параллелях и определяли среднее значение и стандартное отклонение. Полученные данные представлены на фиг.7.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен эукариотический вектор, который состоит из следующих элементов: промотор ранних генов цитомегаловируса человека, последовательность инициации трансляции, участок клонирования, модифицированный сигнал полиаденилирования мРНК гена гормона роста быка, сигнал полиаденилирования мРНК ранних генов вируса SV40, ген устойчивости к ампициллину и участок инициации репликации Col El, интрон-последовательность IVS2 из гена бета-глобина кролика, расположенный между промотором и последовательностью инициации трансляции, и посттранскрипционный регуляторный элемент WPRE из вируса гепатита североамериканского лесного сурка, расположенный между участком клонирования и сигналом полиаденилирования. Изобретение может быть использовано для трансфекции широкого спектра эукариотических клеток, в частности для генной терапии. 7 ил.

Эукариотический вектор для экспрессии трансгенов в эукариотических клетках, содержащий промотор ранних генов цитомегаловируса человека, последовательность инициации трансляции, участок клонирования, модифицированный сигнал полиаденилирования мРНК гена гормона роста быка, сигнал полиаденилирования мРНК ранних генов вируса SV40, ген устойчивости к ампициллину и участок инициации репликации Col El, отличающийся тем, что он также содержит дополнительно интрон-последовательность IVS2 из гена бета-глобина кролика, расположенный между промотором и последовательностью инициации трансляции, и посттранскрипционный регуляторный элемент WPRE из вируса гепатита североамериканского лесного сурка, расположенный между участком клонирования и сигналом полиаденилирования.