ЛЕЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2009 года по МПК C07K16/12 A61K39/395 

Настоящее изобретение связано с соединениями, лекарственными средствами и лечением инфекции, вызываемой Clostridium difficile, наряду с недавно выделенными антителами и их применением в тех же целях. Настоящее изобретение связано также с профилактикой и лечением инфекции, вызываемой бактериями E.faecium и E.faecalis, и предоставляет для этого лекарственные средства и способы лечения.

C.difficile представляет собой грамположительную анаэробную бактерию и считается значительным патогенным фактором для человека, вызывающим спектр заболеваний, имеющий диапазон от умеренной диареи до скоротечных псевдомембранозных колитов (PMC), в совокупности именуемых C.difficile антибиотик-ассоциированной диареей (CDAD). CDAD представляет собой ятрогенное, нозокомиальное (внутрибольничное) заболевание, ассоциированное со значительной распространенностью и летальными исходами, особенно у людей преклонного возраста. Было выделено два фактора, играющие главную роль в патогенезе CDAD - подавление резидентной кишечной флоры посредством введения антибиотиков и продуцирование бактерией двух высокомолекулярных токсинов, экзотоксина А и экзотоксина В.

Эта бактерия эндемична в госпиталях, и исследования показали, что приблизительно одна треть пациентов, получающих лечение антибиотиками в отделении экстренной помощи больницы, заражается бактерией C.difficile, еще находясь в стационаре (Kyne, L., et al., 2002, Clin. Infect. Dis. 34(3), стр.346-53, PMID: 11774082). Более чем у половины из этих пациентов развивались симптомы CDAD, в то время как оставшиеся были бессимптомными носителями. CDAD является основным фактором, распространенным среди пациентов во время их пребывания в стационаре, и оценочные данные дают возможность предположить, что затраты на это заболевание в США превышают 1,1 биллион $ в год (Kyne, L., et al., выше). Пациенты, страдающие от CDAD, хорошо реагируют на лечение, которое включает в себя прекращение введения антибиотика, и на лечение одним из двух антибиотиков - метронидазолом и ванкомицином. Уровень эффективности при начальной терапии антибиотиком может быть высоким (до 95%), но у вплоть до 20% пациентов может возникнуть рецидив в течение одной или двух недель после начала лечения, с риском возникновения рецидива, осложняющегося с каждым последующим случаем рецидива. Рецидив обычно можно лечить антибиотиками, что означает, что рецидив вызван инфицированием различными штаммами C.difficile. К тому же, очевидно, что C.difficile становится резистентным к метронидазолу и частично резистентным к ванкомицину, что диктует необходимость новых альтернатив в лечении CDAD.

Экзотоксины A и B, которые продуцируются патогенными штаммами бактерии, являются цитотоксическими, энтеротоксическими и вызывающими воспаление и рассматриваются как основные болезнетворные факторы указанного неинвазивного микроорганизма. Однако не всякое инфицирование токсикогенными штаммами приводит к заболеванию, что диктует необходимость поиска дополнительных вирулентных факторов. Антигены поверхности бактерии являются предполагаемыми вирулентными факторами и тоже считаются важным фактором, поскольку такие белки, по-видимому, содействуют основным функциям, таким как прилипание к эпителиальному слою пищеварительного канала на первом этапе образования колоний или взаимодействие с медиаторами местного иммунитета. Подобно многим другим бактериям, бактерия C.difficile имеет кристаллический или паракристаллический слой поверхности (S-слой) на внешней поверхности клетки. Такие S-слои содержат белки или гликопротеины, образующие структуру регулярной решетки на внешней поверхности бактерии и, как было ранее показано, являются существенными для вирулентности патогенных бактерий, таких как Aeromanas salmonicida и Campylobacter fetus. В отличие от многих бактерий, которые содержат один S-слой, известно, что C.difficile содержит два наложенных друг на друга паракристаллических S-слоя, каждый из которых состоит из гликопротеиновых субъединиц, которые незначительно отличаются кажущимся молекулярным весом от различных штаммов C.difficile. Большинство штаммов C.difficile экспрессируют два основных S-слоя белков (SLP), один в 32-38 кДа (SLP с низким MВ) и второй в 42-48 кДа (SLP с высоким MВ). SLP с низким MВ, по-видимому, иммунодоминантен и является антигеном, обычно узнаваемым организмом пациента, переносящего заболевание CDAD, и является единственным антигеном, узнаваемым в ЭДТА-экстрактах бактерии с помощью антисыворотки, полученной у кроликов против цельных клеток C.difficile (Calabi, E. et al., 2001, Mol. Microbiol., 40(5), стр.1187-99, PMID: 11401722).

В процессе развития микробной инфекции иммунная система пускает в ход различные адаптивные механизмы. Одним и, возможно, наиболее важным из таких механизмов является продуцирование антител. Антитела, способные связывать антигены, производимые инфицирующим агентом, продуцируются и связываются с микроорганизмами посредством активации комплемента, рекрутинга макрофага и посредством прямого взаимодействия с самим микробом, создавая возможность уничтожения микробов. Терапевтическая эффективность антител, способных связываться с данным антигеном, различна, и это фактически означает, что продукция антител созревает в процессе развития инфекции и становится максимально специфичной в тех случаях, когда пациент успешно борется с инфекцией.

Антительный ответ обусловлен репертуаром B-клеток, где каждая из B-клеток продуцирует разнообразные по структуре молекул антитела. Истинные масштабы репертуара таких B-клеток/антител неизвестны, но предварительно подсчитано, что статистическая клональная частота реактивности для данного антигена высока и может составлять 1 на 100000 в культуре B-клеток (Nobrega, A., et al., Eur J Immunol. 1998 Apr; 28(4): 1204-15; PMID: 9565360). Во время инфекционного заболевания антитела, способные связываться с патогенным организмом, отбираются в процессе изменений в популяции B-клеток, что приводит к [подборке] ключевых антител, продуцируемых в больших количествах. Механизмы указанных изменений включают в себя клональный рост, переключение изотипов и соматическую мутацию вариабельных областей иммуноглобулина. B-клетки, ответственные за выработку антител, которые способны связывать патогенный организм, размножаются, вызывая таким образом сдвиг в репертуаре B-клеток и изменяя соотношение [различных популяций] B-клеток.

На мышиной модели обнаружено, что антитело, специфичное в отношении связывающегося с клеткой домена экзотоксина А бактерии C.difficile, несет защитную функцию, и у пациентов, которые колонизированы C.difficile, но при этом асимптоматичны, обнаружен повышенный титр IgG против экзотоксина А. Инфицированные пациенты, у которых в ответ на заражение обнаруживаются столь повышенные сывороточные титры IgG против экзотоксина А, в 48 раз менее подвержены тому, что им придется страдать от CDAD, чем пациенты, у которых такой повышенный титр не достигается. Поэтому вакцинация экзотоксином А C.difficile и применение антител против экзотоксина A C.difficile рекомендуются в качестве терапевтической стратегии (Giannasca PJ и Warny M., Vaccine, 2004 Feb 17; 22(7): 848-56; PMID: 15040937).

Не основанные на антибиотиках терапевтические схемы лечения/профилактики инфекции C.difficile основаны на вакцинации и пассивной иммунизации. Схема вакцинации включает в себя введение пациенту либо последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуногенный фрагмент белка поверхностного слоя C.difficile, либо вариант ее гомолога, либо эквивалентный полипептидный фрагмент (как раскрыто в Международной заявке на патент WO 02/062379). Пассивная иммунотерапия обычно достигается путем введения пациенту моноклонального антитела, специфичного в отношении иммуногена, продуцируемого патогенным организмом. В основном пассивная иммунотерапия представляется особенно эффективной в лечении пациентов с ослабленным иммунитетом, которые не способны ответить на вакцинацию, и пациентов, нуждающихся в экстренной терапии, которые не могут ждать, пока вакцинация даст эффект. В случае инфицирования C.difficile пассивная иммунотерапия основана на введении пациенту нейтрализующего токсин поликлонального иммуноглобулина (как раскрыто в Международной заявке WO 99/20304) или антител, полученных против цельных бактерий и токсинов (как раскрыто в Международной заявке WO 96/07430).

Следовательно, эффективная терапия инфекции, вызванной бактерией C.difficile, очень важна, и на предшествующем уровне в данной области считалось, что терапия должна быть связана с вакцинацией или пассивной иммунотерапией, направленной против экзотоксина А бактерии C.difficile, против белка наружного слоя, или же она должна быть связана с поликлональной антисывороткой, специфичной в отношении неидентифицированных бактериальных токсинов.

Однако в настоящем изобретении установлена специфическая мишень для терапевтического воздействия. Эксперименты, описанные ниже, показывают, что у пациентов, инфицированных C.difficile, продуцируется повышенный титр антител, специфичных в отношении ацетил-СоА-ацетилтрансферазы (тиолазы), и что антитело против ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолазы), по-существу, пригодно и эффективно в лечении инфекции, вызванной C.difficile. Более того, антитело против ацетил-CoA-ацетилтрансферазы, особенно искусственное антитело, сконструированное из наиболее доминантных CDR-последовательностей из организма пациентов, инфицированных C.difficile, при совместном использовании с антибиотиками ванкомицином или гентамицином дает в результате синергическое лечение инфекции, вызванной C.difficile.

Таким образом, согласно первому аспекту настоящего изобретения предусматривается применение ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной Clostridium difficile.

Используемый в данном документе термин "лечение", если не указано иначе, имеет широкое значение. Таким образом, термины "лечение" или "терапия" означают любую терапию, которая предназначена для излечения, облегчения, устранения или уменьшения симптомов или предотвращения или снижения вероятности заболевания или дисфункции в организме человека или животного. Следовательно, термин "лечение" относится к обоим значениям - и к лечению заболевания, и к его профилактике.

В частности, ацетил-CoA-ацетилтрансфераза может происходить из бактерии Clostridium difficile, и она может иметь последовательность SEQ ID NO: 43.

Возможно применение широкого ряда ингибиторов, специфичных в отношении ацетил-CoA-ацетилтрансферазы. В частности, ацетил-CoA-ацетилтрансфераза может образовывать специфические связанные пары (sbp) с ингибитором, при этом ацетил-CoA-ацетилтрансфераза является первым элементом пары, а ингибитор является вторым элементом пары.

В настоящем документе "Элемент специфически связывающейся пары" представляет собой одну из двух отличающихся молекул, имеющих на своей поверхности или в полости область, которая специфически связывается с другой молекулой и в силу этого считается комплементарной особой пространственной и полярной организации другой молекулы. Элементы специфически связывающихся пар называют лигандом и рецептором (антилигандом), sbp-элементом, sbp-партнером, sbp-членом и пр. Существуют традиционные элементы иммунологической пары, такие как антиген-антитело, хотя этот термин имеет более широкое значение, включающее и другие специфически связывающиеся пары, такие как РНК-белок, ДНК-белок и пр.

Следовательно, ингибитором может быть антитело или его антиген-связывающий фрагмент, и он может быть специфичным в отношении эпитопа, представленного пептидом с последовательностью SEQ ID NO:47.

Как подробно описано ниже в разделе "Эксперименты", эпитоп, представленный пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:47, идентифицирован как консервативный участок, присутствующий в разных антигенах, и, следовательно, идентифицирован как пептид, представленный консервативным эпитопом, общим среди таких антигенов.

Термин "антитело" в его различных грамматических формах используется в данном документе для обозначения молекул иммуноглобулина и иммунологически активных сегментов молекул иммуноглобулина, то есть молекул, которые содержат объединяющий антитела комбинированный участок или паратоп. Такие молекулы также именуют "антигенсвязывающими фрагментами" молекул иммуноглобулина.

Иллюстративными молекулами антител являются молекулы иммуноглобулина, по существу, интактные молекулы иммуноглобулина и те сегменты молекулы иммуноглобулина, которые содержат паратоп, включая сегменты, известные в данной области, такие как Fab, Fab', F(ab')2, scFv и F(v). Антитела, их продуцирование и применение хорошо известны в данной области (например, Harlow, E. и Lane, D., "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998).

Как подробно описано ниже в экспериментах, вариабельные тяжелые (VH) и вариабельные легкие (VL) цепи антител, продуцируемых пациентами, инфицированными C.difficile, были клонированы, секвенированы, и были идентифицированы их определяющие комплементарность области (CDR). В результате показано, что существуют высокоиммунодоминантные области CDR 1-3 VH-цепи (CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) и высокоиммунодоминантные области CDR 1-3 VL-цепи (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3).

Таким образом, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут иметь определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 2-4 соответственно. В частности, антитело или его антиген-связывающий фрагмент может иметь VH-цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 1.

Сходным образом, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут иметь определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO: 17-19. В частности, антитело или его антиген-связывающий фрагмент может иметь VL-цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 16.

Было сконструировано и использовано искусственное антитело, имеющее указанные выше последовательности, и, следовательно, антитело может иметь последовательность SEQ ID NO: 41. Антитело, подробно описанное ниже, имеющее последовательность SEQ ID NO: 41, также содержит N-концевую S-метку и C-концевую His-метку. Метки используются для экспериментальных целей, но не являются необходимыми для терапевтического применения антитела, хотя они (или другие метки) и могут считаться полезными. Таким образом, антитело может, например, дополнительно содержать His-метку, к примеру C-концевую His-метку.

Эксперименты, описанные ниже, показали, что не только ингибитор ацетил-CoA-ацетилтрансферазы эффективен сам по себе в успешном лечении инфекции, вызванной Clostridium difficile, но он также пригоден и при использовании в сочетании с существующими антибиотиками, в частности с гентамицином и ванкомицином, и что такое применение может обеспечить синергические результаты. Предварительные экспериментальные результаты также показали, что синергизм достигается и в случае метронидазола.

Следовательно, лекарственное средство может дополнительно содержать, по меньшей мере, один антибиотик из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола.

Разумеется, медицинские композиции согласно изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или инертный наполнитель (Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA; United States Pharmacopoeia, ISBN: 1889788031).

Как подробно описано выше, ингибитор ацетил-CoA-ацетилтрансферазы как таковой эффективен в успешном лечении инфекции, вызываемой Clostridium difficile. Таким образом, согласно настоящему изобретению, также предоставляется выделенное и/или очищенное антитело, содержащее, по меньшей мере, одну из групп, состоящую из

(i) определяющих комплементарность областей (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющих последовательности SEQ ID NO: 2-4 соответственно; и

(ii) определяющих комплементарность областей (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющих последовательности SEQ ID NO: 17-19.

Как указано выше, VH-цепь может иметь последовательность SEQ ID NO: 1. VL-цепь может иметь последовательность SEQ ID NO: 16. Антитело может иметь последовательность SEQ ID NO: 41.

Предоставляется также молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей такое антитело. Молекула нуклеиновой кислоты может быть выделена и/или очищена. В частности, молекула нуклеиновой кислоты может иметь последовательность SEQ ID NO: 46.

Определяется также согласно изобретению применение ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы и ванкомицина в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции, вызванной Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis, в частности, вызванной ванкомицин-резистентной бактерией Enterococcus faecium.

Эксперименты, описанные ниже, показывают, что не только применение ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы и ванкомицина приводит к синергической терапии инфекции, вызванной C.difficile, но также и к синергической терапии инфекции, вызванной E.faecium, особенно к инфекции, вызванной ванкомицин-резистентной бактерией E.faecium. Предварительные эксперименты показали также, что синергичность также наблюдается при лечении инфекции, вызванной E.faecalis.

Ацетил-CoA-ацетилтрансфераза может происходить и из Clostridium difficile.

Ингибитором может быть антитело или его антиген-связывающий фрагмент, и он может быть специфичным в отношении эпитопа, представленного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 47.

Что касается других аспектов настоящего изобретения, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут иметь определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющие последовательности соответственно SEQ ID NO: 2-4. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент VH-цепи может иметь последовательность SEQ ID NO: 1.

Антиген-связывающий фрагмент могут иметь определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющие последовательности соответственно SEQ ID NO: 17-19. Антитело или его антиген-связывающий фрагмент VL-цепи может иметь последовательность SEQ ID NO: 16.

Антитело или его антиген-связывающий фрагмент может иметь последовательность SEQ ID NO: 41.

Когда настоящее изобретение связано с лекарственными средствами, содержащими два или более активных ингредиентов (например, антитело и антибиотик), настоящее изобретение предоставляет также комбинированные препараты, содержащие такие активные ингредиенты. Например, могут быть предоставлены препараты в составе двух наборов.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предоставляется также комбинированный препарат для лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, содержащий

(i) ингибитор ацетил-CoA-ацетилтрансферазы; и

(ii) по меньшей мере, один антибиотик из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола.

Предоставляется также комбинированный препарат для лечения инфекции, вызванной Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis, содержащий

(i) ингибитор ацетил-CoA-ацетилтрансферазы; и

(ii) ванкомицин.

Бактерии Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis могут быть ванкомицин-резистентными.

Настоящее изобретение также расширяет способы лечения пациентов. Таким образом, согласно настоящему изобретению предоставляется также способ лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы нуждающемуся в этом пациенту. Дополнительно способ может включать в себя введение терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного антибиотика из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола.

Согласно настоящему изобретению предоставляется также способ лечения инфекции, вызванной бактериями Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества:

(i) ингибитора ацетил-CoA-ацетилтрансферазы; и

(ii) ванкомицина

нуждающемуся в этом пациенту.

Enterococcus faecium может быть резистентным к ванкомицину.

Настоящее изобретение станет далее очевидным при последующем описании, в котором только лишь в качестве примера продемонстрированы формы лечения инфекции, вызванной бактериями C.difficile и E.faecium.

Эксперименты

В экспериментах, описанных ниже, искусственное антитело конструировали с использованием предоминантных VH- и VL-последовательностей антитела из организма пациентов, инфицированных C.difficile. Используя такое искусственное антитело, антиген выделяли, и очищали, и для определения предполагаемой частичной последовательности выделенного белка использовали электрораспылительную масс-спектрометрию. Исследуя соответствие геномных последовательностей C.difficile, установили возможную кандидатуру cовпадающей последовательности. Сравнительный анализ последовательности-кандидата из C.difficile позволил выявить ряд гомологичных белков, которые были классифицированы как ферменты ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолаза), и была подтверждена их принадлежность к данному семейству. Наиболее совпадающую последовательность выявили у NP_349376 из Clostridium acetobutylicum, имеющей 68% гомологию более чем по 391 аминокислоте. Клонирование, экспрессия и очистка белка-кандидата привели к получению белка, который прочно связывается с искусственным антителом. Последующие эксперименты показали, что антитело, специфичное в отношении ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолаза) C.difficile, проявляет синергический эффект при его использовании с ванкомицином и гентамицином в лечении инфекций, вызванных C.difficile. Предварительные эксперименты показали также, что синергический эффект может быть достигнут также и с метронидазолом.

Эксперименты показали также наличие синергического эффекта искусственного антитела и ванкомицина в лечении ванкомицин-резистентной бактерии E.faecium. Предварительные эксперименты (не показаны) также указывают на синергичный эффект искусственного антитела и ванкомицина в лечении инфекции E.faecalis.

Если не указано иначе, все процедуры проводили, используя стандартные режимы, и, где применимо, следовали инструкциям изготовителя. Стандартные режимы для различных технических приемов, включая ПЦР, молекулярное клонирование, обработку и секвенирование, изготовление антител, картирование эпитопа и компоновку мимеотопа, культивирование клетки и фаговый дисплей, описаны в текстах, таких как McPherson, M.J. et al. (1991, ПЦР: A practical approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J. et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), Huynh и Davies (1985, "DNA Cloning Vol I - A Practical Approach", IRL Press, Oxford, Ed. D.M. Glover), Sanger, F. et al. (1977, PNAS USA 74(12): 5463-5467), Harlow, E. и Lane, D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998), Jung, G. и Beck-Sickinger, A.G. (1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31: 367-486), Harris, M.A. и Rae, I.F. ("General Techniques of Cell Culture", 1997, Cambridge University Press, ISBN 0521 573645), "Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual" (Eds. Kay, B.K., Winter, J. и McCafferty, J., Academic Press Inc., 1996, ISBN 0-12-402380-0).

Применяемые в способах, описанных в данном документе, реагенты и оборудование, помимо прочего, доступны у таких производителей, как Amersham (www.amersham.co.uk), Boehringer Mannheim (www.boehringer-ingeltheim.com), Clontech (www.clontech.com), Genosys (www.genosys.com), Millipore (www.millipore.com), Novagen (www.novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharmacia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.com), Qiagen (www.qiagen.com), Sigma (www.sigma-aldrich.com) и Stratagene (www.stratagene.com).

Содержание каждой из обсуждаемых здесь ссылок, включая цитируемые тут источники, в полном объеме включены в настоящее описание в виде ссылки.

Здесь "PMID" - это ссылочные номера, предоставленные для публикаций, они являются идентификационными номерами PubMed, присвоенными Национальной Библиотекой Медицины США, у которой на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov доступна вся библиографическая информация и резюме для каждой публикации. Это также предоставляет возможность прямого доступа к электронным копиям полных публикаций, особенно в случае, например, публикаций PNAS, JBC и MBC.

Гомологичность последовательности определяли, используя программу BLAST2 (Tatusova T.A et al., FEMS Microbiol Lett. 1999 May 15; 174(2):247-50; PMID: 10339815) при Национальном Центре Биотехнологической Информации, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov), со стандартными параметрами.

Идентификация доминантных VH- и VL-последовательностей антител из организма пациентов, инфицированных C.difficile

Чтобы установить последовательности антител из организма пациентов, инфицированных C.difficile, и определить последовательности доминантного антитела, в частности последовательности CDR, использовали способы, описанные в Международной заявке WO 03/052416. Продуцируемые В-клетками антитела идентифицировали, секвенировали и анализировали, используя следующие основные стадии (см. WO 03/052416):

(1) Выделение человеческих VH- и/или VL-кодирующих областей из циркулирующих B-клеток пациентов.

(2) Определение нуклеотидной последовательности репертуара VH и/или VL.

(3) Определение первичных аминокислотных последовательностей VH и/или VL.

(4) Экстракцию областей CDR in silico и внесение их в базу данных.

(5) Определение доминантных CDR и каркасных областей в репертуаре VH и/или VL.

(6) Конструирование и продуцирование терапевтических рекомбинантных антител из последовательностей доминантного антитела.

Секвинировали фрагменты антител из организмов четырех инфицированных пациентов (D01, D02, D03 и D04).

Тяжелая цепь (CDH1)

CDH1 - наиболее часто встречающаяся VH-цепь у пациентов, инфицированных C.difficile. Это было установлено при анализе CDR3-последовательностей VH-цепей антител пациента. 226/1011 (22,4%) клонированных антител пациентов, инфицированных C.difficile, имели одинаковую CDR3-последовательность (CDR-H3, ниже). Обнаружено, что CDH1 присутствует у трех четвертей пациентов. Эта CDR3-последовательность проявлялась у 184/318 (57,9%) клонов от пациента D01; у пациента D03 она проявлялась в 40/291 (13,7%) клонов; и у пациента D04 она проявлялась в 2/252 (0,8%) клонов. Наиболее часто полная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 1.

В пределах данной последовательности VH-цепи, последовательности CDR (области, определяющей комплементарность) представляют собой следующее:

CDR-H1 SEQ ID NO: 2 CDR-H2 SEQ ID NO: 3 CDR-H3 SEQ ID NO: 4.

Исследования гомологии позволили установить несколько других CDR3-последовательностей с более чем 70% гомологией относительно CDR-H3-последовательности (SEQ ID NO: 4), все из которых получены у пациентов, инфицированных C.difficile. Последовательности CDR3 представляют собой SEQ ID NO: 5-15.

Легкая цепь (CDL1)

Легкая цепь для H1L1 была получена из клона с наиболее распространенной CDR3-последовательностью у пациентов, инфицированных C.difficile. CDL1 присутствовала у пациента D01 с частотой 84/251 (33,5%). Наиболее часто последовательность VL, содержащая данную CDR3-последовательность, представляла собой SEQ ID NO: 16.

В пределах данной последовательности VL-цепи, последовательности CDR (области, определяющие комплементарность) представляют собой следующее:

CDR-L1 SEQ ID NO: 17 CDR-L2 SEQ ID NO: 18 CDR-L3 SEQ ID NO: 19.

Исследования гомологии позволили установить несколько других CDR3-последовательностей с более чем 70% гомологией относительно CDR-L3-последовательности, все из которых получены у пациентов, инфицированных C.difficile. Последовательности CDR3 представляют собой SEQ ID NO: 20-40.

Конструирование и клонирование антитела H1L1

Искусственное антитело H1L1 было сконструировано следующим образом: CDH1 и CDL1 были по отдельности ПЦР-амплифицированы из секвенирующего вектора и клонированы в клонирующий вектор pGEM-T easy (Promega Corporation) для облегчения секвенирования ДНК. Для этого 3 мкг ПЦР-продукта готовили для рестрикции, используя очистительные спин-колонки ПЦР QIAquick (Qiagen, UK), согласно инструкциям производителя. ДНК элюировали со спин-колонки 40 мкл буфера EB. Очищенный продукт ПЦР (2 мкл) смешивали с 1 мкл вектора pGEM-T easy, 6 мкл воды и 1 мкл ДНК-лигазы и смесь лигировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Лигаты затем трансформировали в электроустойчивые клетки E. coli TG1 (Stratagene) посредством электроимпульса и высевали на чашки с агаром, содержащим ампициллин 100 мкг/мл^-1 IPTG (100 мкМ) и X-гал (0,006% вес./об.). Колониям предоставляли возможность расти в течение ночи при 37°C и затем хранили при 4°C. Рекомбинантные колонии идентифицировали как белые колонии в данной среде.

В результате получали антитело, имеющее следующую общую структуру:

S-метка - CDH1 - Линкер - CDL1 - His-метка

с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41, с N-концевой S-меткой и C-концевой His-меткой.

Идентификация мишени для антитела H1L1 - ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолаза)

Материалы и способы

Приготовление препарата:

Клетки Clostridium difficile (NCTC 11204), выросшие на чашках с кровяным агаром, суспендировали в 10 мM PBS (солевой раствор фосфатного буфера) и разрушали ультразвуком 5×1 минут на льду. Клеточный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 5 минут и 300 мкл супернатанта осаждали в 20 мл 10% трихлоруксусной кислоты и 20 мМ DTT (дитиотрейтол) в холодном ацетоне в течение 45 минут. Белки собирали путем центрифугирования и осадок трижды промывали холодным ацетоном, содержащим 20 мM DTT.

2D-гель-электрофорез:

Осадок белка растворяли в препарате регидратационного раствора (7 M мочевина, 2 M тиомочевина, 3% (вес./об.) CHAPS, 0,002% бромфеноловый синий в воде) и разбавляли тем же раствором для изоэлектрического фокусирования. Изоэлектрическое фокусирование проводили, используя систему Zoom IPGRunner (RTM) (Invitrogen Ltd, Carlsbad, CA, USA) выше нелинейной pH области 3-10 (7 см) до полных 1700 Vh, нанося приблизительно по 15 мкг белка на каждую дорожку. Перед разделением во втором измерении дорожки уравновешивали в течение 15 минут уравновешивающим буфером (50 мM Трис-HCl, pH 8,8, 6 M мочевина, 30% глицерин, 2% (вес./об.) SDS, 0,002% бромфеноловый синий в воде), содержащим 65 мM DTT, а затем тем же буфером, содержащим 125 мM йод-ацетамид, в течение следующих 15 минут.

Разделение во втором измерении проводили, используя гели NuPage 4-12% Bis-TrisZoom и MOPS-буфер (Invitrogen Ltd, Carlsbad, CA, USA). Белки переносили на блот-мембрану в Invitrolon PVDF (Invitrogen Ltd, Carlsbad, CA, USA) и блокировали в 5% обезжиренном молоке в 0,1% Tween20 в 10 мM PBS в течение 1 часа.

Иммуноблоттинг:

Для идентификации мишени антитела H1L1 мембрану инкубировали в течение 1 часа с очищенным антителом H1L1 в 5% обезжиренном молоке в 0,1% Tween20 в 10 мM PBS. После промывания анти-His-антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (использовали Santa Cruz Biotechnologies), разводили в соотношении 1:500 0,1% Tween20 в 10 мM PBS для выявления связанного H1L1. После промывания 0,1% Tween20 в 10 мM PBS блот проявляли, используя ECL (Amersham biosciences, Little Chalfont, UK).

Для визуализации мишеней для IgG-антител у пациентов, инфицированных Clostridium difficile, мембраны инкубировали в течение 1 часа с иммунной сывороткой, разведенной в соотношениях 1:20-1:50 0,1% Tween20 в 10 мM PBS. Использовали анти-IgG-антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (для ECL) или щелочной фосфатазой (Sigma), где мембрану проявляли, используя SigmaFast (RTM) 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат/нитро голубой и таблетки тетразолия (Sigma).

Электрораспылительная масс-спектрометрия:

Окрашенные полосы или пятна белка, вырезанные из геля, промывали в 25 мM бикарбонате аммония в течение 10 минут и дегидрировали, используя 25 мM бикарбонат аммония: ацетонитрил 1:2 в течение 15 минут. После повторной промывки бикарбонатом аммония и стадии дегидрирования кусочки геля сушили в SpeedVac (RTM). Малые объемы трипсина (10 мкг/мл в 25 мM бикарбонате аммония) добавляли до тех пор, пока кусочки геля не принимали их первоначальный размер, и добавляли малое количество 25 мM бикарбоната аммония, чтобы кусочки геля оставались влажными в процессе расщепления. Образцы расщепляли в течение 4,5 часов при 37°C и белки экстрагировали в течение 15 минут посредством добавления 80 мкл ацетонитрила. Супернатант просушивали в SpeedVac до тех пор, пока весь ацетонитрил не испарялся. Образец обессоливали с применением C-18 Zip-Tips (Millipore) и анализировали, используя нанораспылительный времяпролетный масс-спектрометр (Q-TOF, Micromass, Manchester, UK).

Результаты:

Выделение мишени для антитела с использованием 2D-гелей и иммуноблоттинга

Чтобы точно определить положение антигена на 2D-геле, использовали 2D-гели в совокупности с иммуноблоттингом. Проводили сличение двух блотов, в одном из которых использовали иммунную сыворотку, взятую из организма пациента, у которого имелось наибольшее количество антител - его использовали как шаблон для H1L1, и в другом использовали экспрессированный и очищенный H1L1. Оба взаимодействовали с тем же белковым пятном. Один и тот же белок оказался антигенным для четырех пациентов, которые выздоравливали от диареи, вызванной C.difficile.

Выделение белка-мишени с использованием способа хроматографии на колонке

Клинический изолят бактерии C.difficile (упоминаемый здесь как штамм CD 14000287, выделенный из организма пациента, инфицированного C.difficile) анаэробно культивировали в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом, дополненным тиогликолевой кислотой и L-цистеин-HCl в течение 48 часов при 37°C. Клеточную суспензию центрифугировали в центрифуге Sorval RC-3B при 5000 об/мин в течение 20 минут до осаждения клеток и клеточный осадок промывали один раз PBS и снова центрифугировали, как указано выше. Промытый клеточный осадок ресуспендировали в PBS и хранили при -20°C до последующего использования. Аликвоту в 2 мл замороженной клеточной суспензии размораживали и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 минут на настольной микроцентрифуге для осаждения клеток, и осажденные клетки ресуспендировали в 4 мл 6 M гуанидин-HCl, pH 8,0. Гуанидиновый экстракт белка осветляли путем центрифугирования при 45000 об/мин на ультрацентрифуге Beckman L8-70M в течение 1 часа при 20°C. Супернатант трижды диализовали при комнатной температуре против 2 литров 20 мM натрийкарбонатного буфера, pH 9,5, для замены буфера экстрагированного белка на сходный для хроматографической колонки AminoLink (поставляемой Perbio). 2 мл раствора антитела H1L1 (~2 мг/мл) в 20 мM карбоната натрия, pH 9,5, ковалентно сшивали со смолой AminoLink, уравновешенной 20 мM карбонатом натрия, pH 9,5, в предварительно набитой 2 мл колонке, следуя инструкциям производителя (Perbio). Экстракт C.difficile, содержащий антиген (1,5 мл), затем наносили на ковалентно сшитую H1L1 колонку и инкубировали со смолой в течение 1 часа при комнатной температуре. Несвязанный материал вымывали с колонки 12 мл 20 мM буфера карбоната натрия, pH 9,5, а связанный антиген элюировали, нанося 8 мл 0,1 M глицинового буфера, pH 2,5-3,0. Элюированный белок нейтрализовали 1 M Tris, pH 9,0, перед концентрированием от 15 мл до ~200 мкл на адаптор-концентраторе производства Amicon. Этот материал концентрированного белка затем анализировали с помощью 10% (вес./об.) ДСН-ПААГ и визуализировали путем окрашивания Кумасси голубым. Окрашенную полосу интерактивного белка H1L1 затем идентифицировали с помощью масс-спектрометра.

Идентификация выделенного белка при помощи масс-спектрометра

Белковую полосу или пятно вырезали из геля и расщепляли трипсином при 37°C. Образцы анализировали, используя наноэлектрораспылительный времяпролетный масс-спектрометр, который давал последовательность SEQ ID NO: 42.

Тот же самый пептид был обнаружен в эксперименте в образцах из 2D-геля, как и из белка, выделенного при использовании хроматографии на колонке.

Исследования генома Clostridium difficile при Sanger Institute с использованием BLAST-анализа дают последовательность SEQ ID NO: 43 в качестве эквивалентной последовательности.

Теоретически - pI 5,74, молекулярный вес 43430,30 Да, что хорошо коррелирует с расположением белка на 2D-геле, где молекулярный вес приблизительно составляет 44 кД, а pI 5,5-6.

Используя белковую последовательность SEQ ID NO: 43 в белок-белковом NCBI BLAST-исследовании и используя обычные установки, обнаружили высокую степень подобия образцу ацетил-CoA-ацетилтрансферазы (тиолаза), номер NP_349376, с 68% идентичностью свыше 391 аминокислоты.

Клонирование ацетил-CoA-ацетилтрансферазы

Для клонирования и экспрессии в E.coli последовательность, кодирующую ацетил-CoA-ацетилтрансферазу, ПЦР амплифицировали напрямую из геномной ДНК C.difficile и готовили, используя спин-колонку DNeasy (Qiagen), согласно инструкции по применению.

Используемые ПЦР-праймеры, идентифицированные и предназначенные для прямого сравнения с геномной последовательностью ДНК бактерии C.difficile, кодирующей эквивалентную ацетил-CoA-ацетилтрансферазе последовательность-кандидат, представляют собой SEQ ID NO: 44 и 45, синтезированные с помощью SIGMA Genosys. Амплификацию проводили, используя Taq-ДНК-полимеразу (Invitrogen), допуская прямое независимое от лигирования клонирование в вектор экспрессии pBAD-TA (Invitrogen), добавляя слитую с C-концом His₆-метку к экспрессированной ацетил-CoA-ацетилтрансферазе под контролем индуцируемого арабинозой промотора araBAD. Клонируемую смесь трансформировали в экспрессирующий штамм TOP10 (Invitrogen) и рекомбинанты идентифицировали, используя ДСН-ПААГи иммуноблоттинг, используя моноклональное антитело против конъюгированного с His-меченой пероксидазой антитела (SIGMA). Полученная плазмида упоминается здесь, как pThioll.

Экспрессия и очистка ацетил-СоА-ацетилтрансферазы

Для повышенной экспрессии белка, слитого с 6-His-меченой тиолазой, клетки штамма TOP10 E.coli (pThioll) культивировали до поздней экспоненциальной фазы (OD₆₀₀ 1,0 при 37°C при встряхивании при 200 об/мин) и экспрессию белка индуцировали добавлением арабинозы до конечной концентрации 0,2%. Еще через 240 минут роста бактерии собирали путем центрифугирования (500 g, 10 минут, 4°C) и осадок ресуспендировали в лизисном буфере (6 M гуанидин-гидрохлорид, 50 мM Tris-HCl, pH 8) до 1/20 начального объема и солюбилизировали при перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Нерастворенный материал удаляли на последующей стадии центрифугирования (10000 g, 10 минут при комнатной температуре) и супернатант наносили на спин-препаративную колонку Ni-NTA Qiagen, следуя инструкциям производителя. Колонку трижды промывали 600 мкл лизисного буфера с последующей троекратной промывкой 600 мкл промывочного буфера-1 (8 M мочевина, 50 мM Tris/HCl, pH 8), и три раза - 600 мкл промывочного буфера-2 (8 M мочевина, 50 мM TrisHCl, pH 8, 25 мM имидазол). His-меченый белок элюировали с колонки 100 мкл буфера для элюции (8 M мочевина, 50 мM Tris/HCl, pH 8, 250 мM имидазол), фазу элюции повторяли и обе фракции объединяли. Образцы анализировали методом ДСН-ПААГ.

Тестирование антитела H1L1 против клонированной ацетил-СоА-ацетилтрансферазы

Клонированную и очищенную ацетил-CoA-ацетилтрансферазу смешивали в соотношении 1:1 с загрузочным буфером и DTT и нагревали при 90°C в течение 5 минут. Отбирали 5-15 мкл и в течение 35 минут наносили на 10% BisTris гель (Invitrogen,) используя подвижный (running) буфер NuPAGE-MES SDS (Invitrogen).

Белки трансблоттировали на мембрану Invitrolon PVDF (Invitrogen Ltd, Carlsbad, CA, USA) и блокировали в 5% обезжиренном молоке в 0,1% Tween20 в 10 мM PBS в течение 1 часа. Мембрану инкубировали с H1L1 в соотношении 1:10 (концентрация приблизительно 400 мкг/мл) в 0,1% Tween20 в 10 мM PBS в течение 1 часа. Промывали три раза по 5 минут 0,1% Tween20 в 10 мM PBS и затем инкубировали в течение одного часа с HRP-конъюгатом S-белка (Novagen) при соотношении 1:1000. Блот проявляли, используя краску Sigma-Fast DAB, и обнаружили четкое соответствие полосе тиолазы, локализованной непосредственно под маркером в 50 кДа.

Следовательно, антитело из организма пациента, инфицированного C.difficile, направлено против ацетил-CoA-ацетилтрансферазы C.difficile, и искусственное антитело, сконструированное из доминантных легкой и тяжелой цепей CDR данных пациентов, специфично против ацетил-CoA-ацетилтрансферазы C.difficile. Таким образом, ацетил-CoA-ацетилтрансфераза C.difficile представляет собой активный антиген, и антитело H1L1 может быть использовано для его связывания.

Консервативный эпитоп

В каскаде реакций бутанол/бутират-продуцирования Clostridium acetobutylicum последовательно участвуют три фермента, которые присутствуют также на хромосоме Clostridium difficile. Было обнаружено, что они взаимодействуют с антисывороткой кролика, полученной против белков супернатанта из Clostridium difficile (Mullany P. et al., FEMS Microbiol Lett., 1994, Nov 15; 124(1): 61-7; PMID: 8001771).

Полагая, что в ферментах представлен консервативный эпитоп, обнаружили единственную гомологичную область, ассоциированную с остатками 9-12 в тиолазе (номер доступа P45362), которая присутствует в кротоназе (номер доступа P45361) - остатки 5-8, и данная консервативная последовательность представляет собой SEQ ID NO:47.

Комбинированное лекарственное средство MIC Enterococcus faecium и Clostridium difficile

Подготовка к опыту

Организмы культивировали на чашках с кровяным агаром Columbia (CBA) до образования единичных колоний и инкубировали при 37°C в течение 24 часов (E.faecium) или - анаэробно - в течение 48 часов (C.difficile).

Противомикробные агенты готовили согласно методике NCCLS (M7-6A), дающей в итоге 14 концентраций для ванкомицина и гентамицина и 11 концентраций для H1L1. Первоначальные разведения ванкомицина и гентамицина делали в dH₂O, H1L1 сначала разводили в препаративном буфере (в 100 мл: 3,484 г аргинина (200 мM), 3,006 г мочевины (0,5 M), pH 9,5). Последовательные разведения делали в соответствующей среде роста используемого организма. Агенты сохраняли в аликвотах при -20°C и размораживали в день использования.

Концентрации вдвое превышали требуемые концентрации.

1. Приготовление среды

Среда для бактерии E.faecium - Катион-адаптированный бульон Mueller Hinton (NCCLS M7-6A): на 1 литр бульона Mueller Hinton (OXOID, MHB) добавляли 2 мл 10 мг/мл CaCl₂ и 500 мкл 10 мг/мл MgCl₂ .

Среда для бактерии C.difficile -

(1) Дополнительный Brucella бульон (NCCLS M11-A5): на 900 мл бульона Brucella в виде порошка (SIGMA) добавляли 1 мл Hemin (5 мг/мл) и 1 мл витамина K (1 мг/мл). После автоклавирования добавляли 100 мл лизированной крови лошади (5%).

(2) Обогащенную среду клостридий (RCM) готовили согласно инструкциям производителей: 38 г в 1 литре dH₂O.

2. Приготовление MIC-планшета - Таблица 1

Лекарственное средство 1 - ванкомицин или гентамицин (интервал конечных концентраций - от 0,0625 мкг/мл до 512 мкг/мл)

В U-образный 96-луночный титрационный микропланшет добавляли двойную по отношению к требуемой концентрацию ванкомицина или гентамицина (50 мкл), слева направо вдоль первого ряда титрационного микропланшета, оставляя пустой последнюю лунку. Данную процедуру повторяли и в других рядах, используя вдвое меньшие концентрации ванкомицина.

Лекарственное средство 2 - H1L1 антитело (интервал конечной концентрации - от 0,25 мкг/мл до 256 мкг/мл)

H1L1 (50 мл) пропускали через колонки. Двойную концентрацию пропускали через первую колонку. Данную процедуру повторяли на других колонках, двигаясь вдоль планшета (слева направо), вдвое уменьшая концентрации H1L1. Последнюю колонку оставляли пустой.

Последняя колонка содержит только 100 мкл среды роста.

Последовательные концентрации ванкомицина и гентамицина готовили таким же образом, как и выше, но на втором титрационном микропланшете. Концентрации H1L1 были точно такими же, как и выше, также как и контрольная колонка 12, содержащая только среду.

Приготовление прививочного материала - Полная суспензия колоний

- Прививочный материал готовили непосредственно перед использованием бактерии.

- Полную суспензию колоний получали путем ресуспендирования колоний в период роста от 18 до 24 часов (E.faecium) или 48 часов (C.difficile) на чашках с агаром в соответствующей среде роста или стерильном физиологическом растворе.

- Доводили до 0,5 стандарта MacFarlands, затем разбавляли в соотношении 1:10 в среде роста (приблизительно 1×10⁷ КОЕ/мл) согласно NCCLS M7-6A (E.faecium) и NCCLS M11-A5 (C.difficile).

Нанесение прививочного материала на планшет

- 5 мкл прививочной суспензии в соотношении 1:10, приготовленной, как описано выше, использовали для внесения в каждую лунку (конечное содержание прививочного материала 5×10⁴ КОЕ/мл).

- Прививочный материал вносили в лунки планшета, от лунки 12 до лунки 1.

Инкубация

- Планшеты инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов (E.faecium) или - анаэробно - в течение 48 часов (C.difficile).

- Для проверки прививочного материала 10 мкл из пробы контроля роста разбавляли 10 мл стерильного физиологического раствора (1:1000) и 100 мкл высевали на планшете CBA и инкубировали при 37°C в течение 24 часов (E.faecium) или - анаэробно - в течение 48 часов (C.difficile). Пятьдесят колоний были эквивалентны 5×10⁴ КОЕ/мл.

Считывание результатов

MIC принимали за наименьшую концентрацию лекарственного средства, которое, по существу, ингибировало рост этого организма.

FIC (частичную ингибирующую концентрацию) рассчитывали для каждого лекарственного средства посредством деления MIC в присутствии второго лекарственного средства на MIC в его отсутствие. Для каждой комбинации получали две фракции, которые суммировали, получая FICI (индекс частичной ингибирующей концентрации): синергизм определялся величиной <=0,5, индифферентность определялась величиной от >0,5 до <4, а антагонизм определялся значением >=4,0.

Результаты

Полученные результаты свидетельствуют о синергизме действия H1L1 с ванкомицином и гентамицином.

Выводы

Полученные результаты свидетельствуют о синергизме действия (i) H1L1 с ванкомицином, а также (ii) H1L1 с гентамицином в отношении штаммов C.difficile 14000287 и C.difficile NCTC 11204. Показан синергизм действия ванкомицина и H1L1 на ванкомицин-резистентной Enterococcus faecium.

Рост Clostridium difficile в присутствии различных короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) и концентраций антитела H1L1

Приготовление SCFA

Были использованы три вида SCFA - ацетат, пропионат и бутират. Каждый готовили в концентрации 1 M следующим образом:

Ацетат натрия FW 82,03 - 82,03 г в 1 литре dH₂O.

Бутират натрия FW 110,09 - 110,09 г в 1 литре dH₂O.

Пропионат натрия FW 96,06 - 96,06 г в 1 литре dH₂O.

Эти три раствора комбинировали в соотношении 70:20:10 соответственно. Следовательно, в конечном растворе концентрации составляли: ацетат натрия 0,7 M, бутират натрия 0,2 M и пропионат натрия 0,1 M. Конечная концентрация полного SCFA составляла 1 M.

Из этого сток-раствора получали концентрации 5, 10, 20, 30, 40 и 50 мM полного SCFA, используя обогащенную среду клостридий (RCM, DIFCO).

Приготовление среды

Обогащенную среду клостридий (RCM) готовили согласно инструкциям производителей: 38 г в 1 литре dH₂O.

Кривая роста

День перед опытом

Культуры извлекали из анаэробных условий непосредственно перед использованием. Длительность пребывания в аэробных условиях не превышала 30 минут.

Суспензию C.difficile, инкубированных в течение ночи, готовили путем инокуляции 10 мл среды RCM колониями организма, которые 48 часов культивировали на планшете с кровяным агаром old Columbia. Суспензию инкубировали в течение 24 часов при 37°C в анаэробных условиях.

В день опыта

Контрольный планшет

В лунки плоскодонного 96-луночного титрационного микропланшета вносили контрольные растворы (200 мкл), как обозначено ниже в Таблице 4. На каждый контроль использовали по 3 лунки.

Тестирование на планшете

В лунки плоскодонного 96-луночного титрационного микропланшета (ряды отмечены A-H, столбцы отмечены 1-12) тестируемые растворы (100 мкл) вносили, как описано ниже. Два тестируемых раствора SCFA плюс H1L1 дают общий объем в 200 мкл. На каждый тест использовали по 2 лунки. Лунки в ряду A содержали 50 мM SCFA; в ряду B - 40 мM SCFA; в ряду C - 30 мM SCFA; в ряду D - 20 мM SCFA; в ряду E - 10 мM SCFA; в ряду F - 0,5 мM SCFA. Лунки в колонках 1 и 2 содержали 16 мкг/мл H1L1; в колонках 3 и 4 - 8 мкг/мл H1L1; в колонках 5 и 6 - 4 мкг/мл H1L1; в колонках 7 и 8 - 2 мкг/мл H1L1; в колонках 9 и 10 - 1 мкг/мл H1L1; в колонках 11 и 12 - 0,5 мкг/мл H1L1. Ряд G был пустым. 200 мкл RCM вносили во все лунки ряда H в качестве контроля роста на планшете.

Приготовление прививочного материала

Культуру извлекали из анаэробных условий непосредственно перед использованием. Длительность воздействия аэробных условий не превышала 30 минут.

Суспензию, культивируемую в течение ночи и находящуюся в поздней логарифмической фазе, использовали для внесения в лунки титрационного микропланшета. 20 мкл (приблизительно 10% прививочный материал) добавляли во все лунки, исключая лунки для отрицательного контроля среды на контрольном планшете.

Планшеты инкубировали при 37°C в анаэробных условиях в течение 24 часов.

Показания оптической плотности (OD₆₀₀ нм) снимали в нулевой момент времени и через 24 часа. Определяли среднее показание OD₆₀₀ нм.

Результаты

Контроль - см. Таблицу 5.

Выводы -

1. Не обнаружили как такового эффекта при концентрациях SCFA 10, 20, 30, и 40 мM, однако было отмечено некоторое уменьшение при 50 мM SCFA.

2. Не обнаружили эффекта при концентрациях H1L1 0,5, 1, 2 4 и 8 мкг/мл, однако было отмечено некоторое ингибирование при 16 мкг/мл H1L1.

Тестирование - см. Таблицу 6.

Выводы -

Отсутствие эффекта при концентрациях H1L1 1, 2 и 4 мкг/мг и 5 мM SCFA (данные не показаны). Наличие синергизма действия при концентрации 8 мкг/мл H1L1 и при 10-50 мM SCFA, с оптической плотностью, понижающейся к 24 часу до уровня 0,296-0,330. Эффект наиболее выражен при концентрации H1L1 16 мкг/мл и 50 мM SCFA.

Таблица 1

Концентрации лекарственного средства на этой стадии будут составлять половину концентрации, которая внесена в лунки (50 мкл + 50 мкл = разведение 1:2).

A, B и т.д. = ванкомицин или гентамицин

1, 2, 3 и т.д. = + H1L1.

  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 Только среда B B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 Только среда C C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 Только среда D D1 D3 D4 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 Только среда E E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 Только среда F F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 Только среда G G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 Только среда H H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 Только среда

Таблица 2 Штаммы Агент MIC (мкг/мл) каждого агента FIC (мкг/мл) FICI Результат Отдельно В соче-тании Clostridium difficile NCR 1104 (бульон Brucella) Ванкомицин 1 0,125 0,125 0,125 Синергизм H1L1 512 0,25 0,0004     Enterococcus faecium Ванкомицин 128 16 0,12 0,37 Синергизм H1L1 512 128 0,25    

Таблица 3 Штаммы Агент MIC (мкг/мл) каждого агента FIC (мкг/мл) FICI Результат Отдельно В сочетании C.difficile 14000287 (бульон Brucella) Гентамицин 8 2 0,25 0,266 Синергизм H1L1 512 8 0,0156     C.difficile NCTC 11204 (RCM) Гентамицин 16 4 0,25 0,375 Синергизм H1L1 512 64 0,125    

Таблица 4   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A RCM без прививочного материала RCM + прививочный материал             B RCM + 50 мM SCFA RCM + 40 мM SCFA RCM + 30 мM SCFA RCM + 20 мM SCFA C RCM + 10 мM SCFA RCM + 5 мM SCFA             D RCM + 16 мкг/мл H1L1 RCM + 8 мкг/мл H1L1 RCM + 4 мкг/мл H1L1 RCM + 2 мкг/мл H1L1 E RCM + 1 мкг/мл H1L1 RCM + 0,5 мкг/мл H1L1             F                         G                         H                        

Таблица 5 № эксперимента H1L1
(мкг/мл) SCFA
(мM) Значение оптической плотности к 24 часу 1 - - 0,452 2 - 5 0,460 3 - 10 0,429 4 - 20 0,452 5 - 30 0,480 6 - 40 0,440 7 - 50 0,370 8 0,5 - 0,450 9 1 - 0,440 10 2 - 0,440 11 4 - 0,440 12 8 - 0,420 13 16 - 0,334

Таблица 6 № эксперимента H1L1
(мкг/мл) SCFA
(мM) Значение оптической плотности к 24 часу 1 8 10 0,310 2 16 10 0,308 3 8 20 0,296 4 16 20 0,228 5 8 30 0,305 6 16 30 0,308 7 8 40 0,310 8 16 40 0,303 9 8 50 0,330 10 16 50 0,281

Изобретение относится к биотехнологии. Описано применение антитела к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе или его антиген-связывающего фрагмента в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной Clostridium difficile и Enterococcus faecalis, faecium. Раскрыт комбинированный препарат для лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, содержащий (i) антитело к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе или его антиген-связывающий фрагмент; и (ii) по меньшей мере, один антибиотик из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола. Представлен ингибитор ацетил-СоА-ацетилтрансферазы, представляющий собой антитело или его антиген-связывающий фрагмент, содержащий, по меньшей мере, один из компонентов группы, состоящей из (i) определяющих комплементарность областей (CDR) 1-3 VH-цепи; и (ii) определяющих комплементарность областей (CDR) 3 VL-цепи. Описан способ лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества антитела к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе нуждающемуся в этом пациенту. Изобретение позволяет проводить профилактику и лечить инфекцию, вызываемую бактериями Clostridium difficile и Enterococcus faecalis, faecium. 8 н. и 35 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Применение антитела к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе или его антигенсвязывающего фрагмента в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной Clostridium difficile, где ацетил-СоА-ацетилтрансфераза имеет последовательность SEQ ID NO:43.

2. Применение по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфичен в отношении эпитопа, представленного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:47.

3. Применение по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющей последовательности SEQ ID NO:2-4 соответственно.

4. Применение по п.2, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющей последовательности SEQ ID NO:2-4 соответственно.

5. Применение по п.3, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VH-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:1.

6. Применение по п.4, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VH-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:1.

7. Применение по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющей последовательности SEQ ID NO:17-19.

8. Применение по п.2, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющей последовательности SEQ ID NO:17-19.

9. Применение по п.3, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющей последовательности SEQ ID NO:17-19.

10. Применение по п.4, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющей последовательности SEQ ID NO:17-19.

11. Применение по п.5, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющей последовательности SEQ ID NO:17-19.

12. Применение по п.6, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VL-цепи, имеющей последовательности SEQ ID NO:17-19.

13. Применение по п.7, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VL-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:

14. Применение по п.8, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VL-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:16.

15. Применение по п.9, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VL-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:16.

16. Применение по п.10, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VL-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:16.

17. Применение по п.11, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VL-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:16.

18. Применение по п.12, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VL-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:16.

19. Применение по п.1, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет последовательность SEQ ID NO:41.

20. Применение по любому из предшествующих пунктов, где лекарственное средство дополнительно содержит, по меньшей мере, один антибиотик из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола.

21. Комбинированный препарат для лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, содержащий
(i) антитело к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе или его антигенсвязывающий фрагмент, где ацетил-СоА-ацетилтрансфераза имеет последовательность SEQ ID NO:43; и
(ii) по меньшей мере один антибиотик из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола.

22. Ингибитор ацетил-СоА-ацетилтрансферазы, представляющий собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий по меньшей мере один из [компонентов] группы, состоящей из
(i) определяющих комплементарность областей (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющих последовательности SEQ ID NO:2-4 соответственно; и
(ii) определяющей комплементарность области (CDR) 3 VL-цепи, имеющей последовательность SEQ ID NO:19; и
где ацетил-СоА-ацетилтрансфераза имеет последовательность SEQ ID NO:43.

23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22, где указанная VH-цепь имеет последовательность SEQ ID NO:1.

24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22 или 23, где указанная VL-цепь имеет последовательность SEQ ID NO: 16.

25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22, где указанное антитело имеет последовательность SEQ ID NO:41.

26. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.25, представляющие собой антитело к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе или его антигенсвязывающий фрагмент.

27. Молекула нуклеиновой кислоты по п.26, имеющая последовательность SEQ ID NO:46.

28. Применение антитела к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе или его антигенсвязывающего фрагмента и ванкомицина в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения инфекции, вызванной бактериями Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis, где ацетил-СоА-ацетилтрансфераза имеет последовательность SEQ ID NO:43.

29. Применение по п.28, где указанные бактерии Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis являются ванкомицин-резистентными.

30. Применение по п.28, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является специфичным в отношении эпитопа, представленного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:47.

31. Применение по п.29, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является специфичным в отношении эпитопа, представленного пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:47.

32. Применение по любому из пп.28-31, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 1-3 VH-цепи, имеющие последовательности SEQ ID NO:2-4 соответственно.

33. Применение по п.32, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VH-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:1.

34. Применение по любому из пп.28-31 или 33, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 3 VL-цепи, имеющую последовательность SEQ ID NO:19.

35. Применение по п.32, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет определяющие комплементарность области (CDR) 3 VL-цепи, имеющей последовательность SEQ ID NO:19.

36. Применение по п.34, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VL-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:16.

37. Применение по п.35, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент VL-цепи имеет последовательность SEQ ID NO:16.

38. Применение по п.28 или 29, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет последовательность SEQ ID NO:41.

39. Комбинированный препарат для лечения инфекции, вызванной Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis, содержащий:
(i) антитело к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе или его антигенсвязывающий фрагмент; и (ii) ванкомицин,
где ацетил-СоА-ацетилтрансфераза имеет последовательность SEQ ID NO:43.

40. Способ лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества антитела к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе нуждающемуся в этом пациенту, где ацетил-СоА-ацетилтрансфераза имеет последовательность SEQ ID NO:43.

41. Способ по п.40, дополнительно включающий в себя введение терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного антибиотика из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола.

42. Способ лечения инфекции, вызванной Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества
(i) антитела к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе или его антигенсвязывающего фрагмента и
(ii) ванкомицина
нуждающемуся в этом пациенту, где ацетил-СоА-ацетилтрансфераза имеет последовательность SEQ ID NO:43.

43. Способ по п.42, где указанные Enterococcus faecium или Enterococcus faecalis являются ванкомицин-резистентными.