Способ получения аминокислотных последовательностей, кодирующих наноантитела, нейтрализующие токсин А Clostridioides difficile Российский патент 2025 года по МПК C07K16/12 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии, конкретно к способам получения мономерных и гомодимерных форм наноантител, специфично связывающих и нейтрализующих CROPs домен токсина A Clostridioides difficile (TcdA). Изобретение может быть применено напрямую для получения рекомбинантных аминокислотных последовательностей, кодирующих полноразмерные наноантитела, нейтрализующие токсин A Clostridioides difficile и/или части этих антител, и/или использовано для получения лекарственных препаратов и любых других производных заявленного изобретения для монотерапии или вспомогательной терапии и/или профилактики токсинемии TcdA, а также в медицине для симптоматической иммунотерапии заболеваний, вызванных С. difficile, в том числе для иммунотерапии рецидивирующей инфекции С. difficile, в комплексной терапии с антибиотиками и/или в монотерапии.

Уровень техники

Clostridioides difficile - грамположительная анаэробная бактерия, образующая споры, устойчивые к внешним условиям. Передача осуществляется спорами фекально-оральным и контактно-бытовым (в случае контаминации патогенами инвентаря медицинских учреждений) путем.

Инфекция С. difficile является ведущей причиной диареи, ассоциированной с терапией антибиотиками, и псевдомембранозного колита во всем мире. Энтероколит относится к тяжелым формам клинического проявления инфекции С. difficile, характеризуется высокой летальностью. Инфекция С. difficile часто принимает рецидивирующую форму. Уровень смертности, ассоциированной с инфекцией С. difficile, составляют 6-30 %. У 15-30 % пациентов, которые были успешно вылечены от первичной инфекции С. difficile, случается рецидив. После первого эпизода рецидива риск возникновения повторных рецидивов увеличивается до 35-65 %. Согласно данным Центра по контролю и профилактике заболеваний в США, количество ежегодных случаев нозокомиальной инфекции С. difficile приближается к 500 000, а количество смертей в год составляет 15 000-29 000.

Клинические проявления инфекции С. difficile могут варьироваться от легкой самокупирующейся диареи до псевдомембранозного колита и фульминантного колита, приводящего к токсическому мегаколону, сопряженному с рисками перфорации стенки толстой кишки, развития сепсиса, полиорганной недостаточности.

Экзотоксины A (TcdA) и В (TcdB) С. difficile - основные факторы вирулентности С. difficile. Оба токсина являются провоспалительными, цитотоксическими и энтеротоксичными для тканей толстой кишки. Ввиду ключевой роли TcdA и TcdB С. difficile в клиническом проявлении инфекции С. difficile эти токсины считаются важной терапевтической мишенью. Токсигенное воздействие TcdA и TcdB на клетки кишечника осуществляется посредством многоступенчатого механизма, который начинается со связывания токсинов с их специфическими клеточными мишенями на поверхности цитоплазматической мембраны. С-концевой домен TcdA и TcdB, образованный короткими гомологичными участками, называемыми комбинированными повторяющимися олигопептидами (CROPs), играет ключевую роль в связывании с клеточными рецепторами, за счет которого токсины проникают в клетку. Поэтому CROPs домены TcdA и TcdB являются важной мишенью для создания терапевтических антител.

На сегодняшний день в клинической практике используется только один иммунобиологический препарат, одобренный для профилактики рецидивирующей инфекции С. difficile - безлотоксумаб. Безлотоксумаб представляет собой полностью гуманизированное моноклональное антитело IgG1, специфичное к CROPs домену TcdB. Препятствием для широкого использования безлотоксумаба в терапии рецидивирующей инфекции С. difficille является высокая стоимость данного препарата - средняя оптовая цена составляет 4 560 долларов США за флакон.

В качестве альтернативы моноклональным антителам для антитоксинной иммунотерапии инфекции С. difficile в последние годы рассматривают наноантитела, которые выделяют из IgG представителей семейства Camelidae. Антигенсвязывающий паратоп этих антител состоит только из одного вариабельного домена тяжелой цепи (VHH). Сохраняя многие свойства моноклональных антител, в том числе высокую антигенсвязывающую активность, наноантитела обладают рядом преимуществ. Отсутствие посттрансляционных модификаций позволяет экспрессировать наноантитела в бактериях и дрожжах, что делает их производство значительно более низкозатратным и доступным по сравнению с производством моноклональных антител. Вариабельные домены тяжелых цепей наноантител имеют исключительно длинные и гибкие пальцевидные выступы петель так называемой определяющей комплементарность области 3 (CDR3). Образуемый ими выпуклый паратоп может простираться в структурные карманы или активные центры белковых антигенов, недоступные для моноклональных антител.

В настоящее время в мире не существует разрешенных к применению лекарственных препаратов для терапии инфекции С. difficille и профилактики ее рецидивирующих форм на основе однодоменных антител.

В изобретении, согласно патенту RU №2377251 (WO 2006003426) описано применение антитела к ацетил-СоА-ацетилтрансферазе или его антиген-связывающего фрагмента в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызванной Clostridium difficile и Enterococcus faecalis. Раскрыт комбинированный препарат для лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, содержащий (i) антитело к ацетил- СоА-ацетилтрансферазе или его антиген-связывающий фрагмент; и (ii) по меньшей мере, один антибиотик из группы, состоящей из гентамицина, ванкомицина и метронидазола. Описан способ лечения инфекции, вызванной Clostridium difficile, включающий в себя введение терапевтически эффективного количества антитела к ацетил-СоА- ацетилтрансферазе нуждающемуся в этом пациенту. Изобретение позволяет проводить профилактику и лечить инфекцию, вызываемую бактериями Clostridium difficile и Enterococcus faecalis.

Известно решение (патент RU №2630663, WO 2011130650), в котором описаны выделенные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связывают токсин В и/или А С. difficile. Также представлены композиции и наборы, содержащие такие антитела. Представлены гибридомные клеточные линии, депонированные под номерами доступа АТСС РТА-9693, АТСС РТА-9692, АТСС РТА-9694, АТСС РТА-9888, где гибридома продуцирует моноклональное антитело, которое специфично связывает токсин С. difficile. Изобретение расширяет арсенал средств для ингибирования или нейтрализации токсичности, вызванной токсином С. difficile.

Известно решение (патент RU №2628305, WO 2013130981), в котором изобретение относится к получению полностью человеческих антител, которые связываются либо с токсином А, либо с токсином В Clostridium difficile, или как с токсином А, так и с токсином В. Также описаны композиции, содержащие указанные антитела, и способы их применения. Антитела по настоящему изобретению пригодны для нейтрализации токсинов С. difficile, таким образом, обеспечивая средство лечения заболевания и симптомов, связанных с инфекцией С. difficile, в том числе средство для лечения диареи или псевдомембранозного колита, вызванного С. difficile. Антитела также могут ограничивать тяжесть и/или продолжительность основного заболевания или могут ограничивать количество, продолжительность и/или тяжесть рецидивов или обострений заболевания, объясняемого присутствием С. difficile. Антитела по настоящему изобретению также могут быть пригодны для диагностики инфицирования С. difficile.

Изобретение согласно патенту US 20180208643 A1 включает отдельное моноклональное антитело, которое связывает и нейтрализует токсин А С. difficile или часть антитела с заданными свойствами. Заявляются различные последовательности легких и тяжелых цепей антител. Частью антитела связывающей токсин А могут быть Fab, Fab'2, ScFv, Fd, Fv или dAb фрагменты антител. Само антитело может быть представлено последовательностью человека, гуманизированным или химерным антителом, изотипа IgG1 или IgG3.

Изобретение согласно патенту US 9994630 B2 представляет собой моноклональное антитело или часть антитела, связывающего токсин А С. difficile, состоящее из вариабельных регионов тяжелой и легкой цепей. Частью антитела связывающей токсин А могут быть Fab, Fab'2, ScFv, Fd, Fv или dAb фрагменты антител. Антитело или его часть способная связать антиген может быть гуманизированным или химерным и принадлежать к IgG или IgA классу. При этом заявляется, что введение антительного продукта внутривенно млекопитающим в дозе от 8мг/кг до 13мг/кг за 24 часа до введения более чем 100нг токсина А С. difficile обеспечивает выживаемость животных более 80% в течение 7 последующих дней. Введение антител может быть внутривенным, подкожным, внутримышечным или внутрикожным. Заявляется токсин нейтрализующая активность антител или их фрагментов на уровне нейтрализации 40% токсина А в концентрации 150нг/мл в условиях in vitro. Терапевтический эффект может быть достигнут как при индивидуальном применении, так и в сочетании с антибиотиками ванкомицином, метронидазолом или фидаксомицином.

Изобретение согласно патенту WO 2006071877 A2 включает выделенное или рекомбинантное антитело с увеличенной резистентностью к протеолизу к одной или более протеазам желудочно-кишечного тракта, представляющую собой тяжелую и легкую цепи IgG иммуноглобулина или антиген-связывающего фрагмента, имеющих указанную последовательность. Само антитело может быть представлено последовательностью человека, гуманизированным или химерным антителом, изотипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Препарат антитела заявлен совместно с фармацевтически приемлемым носителем, в виде суспензии, жидкости, капсул, таблеток, геля, липосом, прелипосом, порошка, частиц, спрея, для высвобождения действующего вещества в ротовой полости или кишечнике. Медицинская цель применения антительного препарата терапия или профилактика развития желудочнокишечной инфекции или заболевания, вызванного самим патогеном или его токсином, этиологическим фактором в которых выступает микроорганизм рода Clostridium. Изобретение также раскрывает метод получения вышеуказанных антительных препаратов методами генетический инженерии с использованием соответствующих последовательностей нуклеиновой кислоты.

Изобретение согласно патенту WO 2014169344 A1 включает антитело млекопитающих или птиц для терапии или профилактики по крайней мере одного симптома заболевания вызванного Clostridium difficile. Антитело должно связывать либо токсин В Clostridium difficile и/или по крайней мере один какой-либо антиген бактерии в вегетативной или споровой форме. Антитело может быть поликлональным, полученным, в частности, из гипериммунного молозива коров. Антительный препарат должен предотвращать развитие какого-либо из приведенных симптомов: диареи, боли в животе, лихорадки, потери аппетита, развития псевдомембранозного колита, токсического мегаколона, колонизации кишечника С. difficile, потери веса, цитотоксичности, повреждении желудочно-кишечного тракта, распространения спор С. difficile и С. difficile-опосредованной смерти. Антительный препарат может вводиться за 24 часа и позже до заражения С. difficile или за 7 дней и позже до повышения риска заражения С. difficile (больница, интернат, санаторий).

В изобретении по патенту WO 2011036539 A1 заявляется метод терапии инфекций кишечника, заключающийся в применении антитела или смеси антител против патогена, а также смеси протиотика или пробиотиков направленных против патогена. Патогеном может выступать любой патоген из предложенного списка: Aeromonas hydrophilia, Bacillus cereus, Vibrio parahemolyticus, Vibrio cholerae 01, Vibrio cholera non-01, Vibrio vulnificus, Salmonella enteric, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella entertidis, Salmonella cholerasuis, Salmonella typhimurium, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari, Campylobacter fetus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Plesiomonas shigelloides, Listeria monocytogenes, кишечные вирусы (ротавирус, Norwalk-like вирусы, кишечнные аденовирусы, коронавирусы и другие необолочечные энтеровирусы), паразиты, грибы (Cryptosporidium и Cyclospora), микобактерии (Mycobacterium avium avium, Mycobacterium avium paratuberculosis, Mycobacterium avium комплекс), Helicobacter pylori, Giardia lamblia, Dientamoeba fragilis, Blastocystis hominis и Entamoeba histolytica. Антителом или антителами могут быть поликлональные, моноклональные антитела, Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, dAb, CDR фрагменты, однодоменные антитела scFv, химерные антитела, гуманизированью или с полной последовательностью человека. Антительный компонент может быть направлен на токсины А, В, бинарный токсин или какой-либо другой секретируемый токсин, компонент фимбрий, пилей, гликокаликса, спор, капсул, секретируемых белковых ферментов (коллагеназ, гиалуронидаз, коагулаз, иммуноглобулин А протеаз), липидов мембран вегетативных форм, спор или фракций спор. Пробиотиком может выступать любая бактерия из представленного списка: Lactobacilli, Bifidobacteria, Е. coli, Eubacteria, Saccharomyces, Enterococci, Bacteroides и непатогенная Clostridia. Заболеванием поддающимся терапии может быть любое из представленного списка: синдром раздраженной кишки, дивертикулез кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, псевдомембранозный колит, идиопатический илеит, нарушения моторики кишечника, запор, метеоризм, халитоз, рефлюкс - синдром.

Согласно изобретению по патенту WO 2013132054 A1 заявляется композиция, состоящая из секретируемого компонента и иммуноглобулина для предотвращения инфекции, вызванной кишечным патогеном. Патогеном является токсин-секретирующая спорообразующая бактерия Clostridium difficile. Инфекция может развиться после проведения антибиотикотерапии предсуществующей инфекции Clostridium difficile. Секреторным компонентом является полимерный рецептор к иммуноглобулину plgR, который может быть получен в линии клеток млекопитающего или выделен из человека. Иммуноглобулином является IgA антитело (как мономерное, так и димерное), содержащее J цепь. Антитело может быть выделено из крови человека, может быть моноклональным или смесью двух и более моноклональных антител IgA. Антитело должно быть получено против токсина А в частности или самой бактерии Clostridium в общем. Препарат предназначается для перорального или ректального введения вплоть до 48 часов перед прекращением антибиотикотерапии или сразу после прекращения антибиотикотерапии.

Изобретение, представленное в патенте US 10513552 B2, подразумевает использование поликлональных антител в эффективном количестве для терапии и профилактики воспалительных заболеваний кишечника, включая те, которые вызваны инфекцией Clostridium difficile. Предложен оригинальный способ получения антител. Антитела в данном случае получают путем иммунизации яйценоских куриц антигеном, созданным на основе токсина А, или токсина В, или спор Clostridium difficile. Далее у таких кур собирают яйца из которых уже выделяют и очищают поликлональные антитела. В качестве способа применения антител, указано, что антитела вводятся до тех пор, пока тяжесть симптомов кишечной инфекции Clostridium difficile на снизится, в частности антитела вводятся ежедневно на период не менее 7 и не более 21 дней. Препарат антител может вводится перорально. Метод терапии не подразумевает параллельного приема кортикостероидов или других иммуносупрессивных агентов.

Изобретение WO 2012055030 A1 относится к токсин-специфическим антителам Clostridium difficile, композициям и их применениям. Антитела против токсина (нуклеотидные последовательности антител раскрыты в изобретении) могут быть специфичными как для TcdA, так и для TcdB. Изобретение также включает способы лечения инфекции Clostridium difficile, способы улавливания токсинов Clostridium difficile и способы обнаружения Clostridium difficile.

В изобретении WO 2014085749 A2 предоставлены композиции и способы лечения или профилактики инфекции Clostridium difficile у субъекта. Композиции содержат антитела к токсину В Clostridium difficile. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, содержащая вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает три определяющих комплементарность области (CDR), CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислоту последовательности от примерно 80% до примерно 100% гомологичны аминокислотным последовательностям, указанным в раскрываемых нуклеотидных последовательностях 102,103,104, соответственно, и в которых вариабельная область легкой цепи включает три CDR, CDR1, CDR2 и CDR3. имеющие аминокислотные последовательности от примерно 80% до примерно 100% гомологичные аминокислотным последовательностям, указанным в раскрываемых нуклеотидных последовательностях 102,103,104 соответственно. Способы предусматривают введение антител субъекту в количестве, эффективном для уменьшения или устранения или предотвращения рецидива бактериальной инфекции Clostridium difficile.

В изобретении WO 2014144292 A2 указаны моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты (нуклеотидные последовательности раскрываются в изобретении), которые связываются с токсином А или токсином В Clostridium difficile (C.difficile), и способы их использования для обнаружения или лечения инфекций, вызванных С.difficile, и / или заболеваний, связанных с С. difficile.

Изолированное моноклональное антитело, которое связывается с эпитопом в С-концевом домене рецептора токсина A Clostridium difficile, где эпитоп содержит аминокислотную последовательность XiTGWQTI, где X; представляет собой А или V или аминокислотную последовательность X2TGWQTIX3G X4YYF, где Х2 представляет собой А или V, ХЗ представляет собой N или D и Х4 представляет собой К или V.

В изобретении US 9873732 B2 заявлена композиция поликлональных антител, полученная из яиц иммунизированных кур, используют для лечения инфекций, вызванных С. difficile. Соответствующие группы кур иммунизируют токсином А или токсином В Clostridium difficile или препаратом спор Clostridium difficile. Поликлональные антитела выделяют из яиц, собранных от иммунизированных кур, и полученный порошок вводят в терапевтически эффективном количестве индивидуумам, инфицированным или подозреваемым в инфицировании С. difficile.

В изобретении WO 2016127104 A2 описаны новые связывающие агенты на основе антител, полученные из иммуноглобулинов человека и верблюдовых. Эти связывающие агенты распознают и специфично связываются с токсином А и / или токсином В Clostridium difficile и в некоторых случаях проявляют активность по нейтрализации токсинов. Эти связывающие агенты можно использовать для лечения или профилактики первичной и рецидивирующей воспалительных заболеваний кишечника. Связывающие агенты включают мономеры пептида VHH верблюда, связанные группы мономеров пептида VHH, мономеры пептида VHH, присоединенные к доменам Fc антител, и мономеры пептида VHH, присоединенные к антителам IgG.

Изобретение WO 2013087857 A2 относится к антигенсвязывающим полипептидам, которые содержат области CDR1, CDR2 и CDR3 домена VHH антитела тяжелой цепи верблюда. Полипептиды специфически связываются в области аминокислот 1-800 токсина Clostridium difficile, проявляющего гликозилтрансферазную активность. Антигенсвязывающие полипептиды особенно подходят для терапевтического лечения заболевания, вызванного токсином Clostridium difficile, проявляющего гликозилтрансферазную активность, и для диагностики такого заболевания. Изобретение также относится к применению таких антигенсвязывающих полипептидов в способах обнаружения токсина Clostridium difficile, проявляющего гликозилтрансферазную активность в биологическом образце. Изобретение также относится к способам очистки и / или концентрирования токсина Clostridium difficile, проявляющего гликозилтрансферазную активность, в которых используются антигенсвязывающие полипептиды.

Изобретение WO 2016156475 A1 касается полипептидов, содержащих вариабельный домен цепи иммуноглобулина, который связывается с токсином В и токсином A Clostridium difficile. Они получены из антител ламы, выделенных с использованием библиотеки фагового дисплея. Были внесены модификации и проанализировано их влияние на активность и стабильность протеаз. В некоторых вариантах реализации были получены димерные и тетрамерные конструкции, конструкции с четырехглавой головкой.

В изобретении WO 2019094095 A1 предоставлены многокомпонентные гетеромультимерные связывающие белковые молекулы, которые содержат вариабельные домены только тяжелых цепей (VHH), которые специфически связывают и нейтрализуют целевые болезнетворные агенты, например, токсиновые белки, такие как токсин А и / или токсин В С. difficile, или С. botulinum токсин А и / или токсин В. Композиции, способы и наборы, содержащие такие мультимерные связывающие белковые молекулы и полинуклеотиды, предназначены для лечения субъекта, который подвергался воздействию таких болезнетворных агентов или который подвергается риску воздействия.

В изобретении WO 2020247500 A1 описаны новые связывающие агенты на основе антител, полученные из VHH верблюда и человеческих иммуноглобулинов. Эти связывающие агенты распознают и специфично связываются с токсином А и / или токсином В Clostridium difficile и в некоторых случаях проявляют активность по нейтрализации токсинов. Эти связывающие агенты можно использовать для лечения или профилактики первичных и рецидивирующих колитов. Связывающие агенты включают мономеры гуманизированного пептида VHH, связанные группы мономеров гуманизированного пептида VHH, мономеры гуманизированного пептида VHH, присоединенные к доменам Fc антитела, и мономеры гуманизированного пептида VHH, присоединенные к антителам IgG.

Изобретение WO 2019012406 A1 относится к токсин-специфическим антителам Clostridium difficile, композициям и их применениям. Антитела к токсину могут быть специфичными для TcdA. Изобретение также включает способы лечения инфекции Clostridium difficile, способы улавливания токсинов Clostridium difficile и способы обнаружения токсинов Clostridium difficile.

Изобретение WO 2013038156 A1 описывает получение и отбор антител способных нейтрализовать основные экзотоксины Clostridium difficile TcdA и TcdB. Приведены антиген-связывающие свойства как самих моноклональных полноразмерных антител, так и их смесей. Моноклональные антитела специфичные к TcdA и TcdB с высокой аффинностью обладают способностью снижать тяжесть и/или длительность диарреи, заболеваемости и/или смертности у пациентов с высоким риском развития инфекции Clostridium difficile или с подтвержденным диагнозом.

Изобретение WO 2016131157 A1 описывает в первую очередь возможность применения токсинов А и/или В Clostridium difficile, в качестве целей терапии, включая пассивную иммунотерапию, в частности предотвращения С. difficile-опосредованной интоксикации у людей или других животных. В изобретении также описываются полипептиды, являющиеся эпитопными фрагментами TcdA и TcdB для получения соответствующих антител. Раскрывается способ получения нейтрализующих антител против TcdA и TcdB. Также приводится описание нового сочетания антител против TcdA и TcdB для нейтрализации токсинов в терапевтическом и/или профилактическом режиме на любом этапе TcdA и/или TcdB опосредованной интоксикации вследствие инфекции С. difficile.

Однако структуры известных однодоменных и моноклональных полноразмерных антител представлены мономерными формами. Заявленные здесь наноантитела обладают, в том числе, гомодимерной формой, а также содержат иные аминокислотные последовательности, включая аминокислотные последовательности CDR1 - CDR3.

Полные аналоги изобретения не выявлены.

Описание изобретения

Изобретение включает в себя способ получения аминокислотных последовательностей мономерных и димерных форм наноантител, нейтрализующих TcdA, включающих в себя аминокислотные последовательности CDR1 - CDR3 и биотехнологический способ получения стабильных белковых препаратов мономерных и гомодимерных форм наноантител двух отобранных клонов, обладающих наиболее выраженной нейтрализующей активностью в отношении TcdA и носящих название Antil и Anti2, нейтрализующих TcdA:

• аминокислотные последовательности CDR1-CRD3 наноантител клона Anti1 в мономерной и гомодимерной формах, нейтрализующих TcdA; представлены на SEQ ID 1;

• аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 наноантител клона Anti2 в мономерной и гомодимерной формах, нейтрализующих TcdA; представлены на SEQ ID 2;

Биотехнологический способ получения мономерных и гомодимерных наноантител, специфически связывающих CROPs домен TcdA и 13 нейтрализующих токсин А С. difficile включает в себя этап создания препарата «плазмиды», фагового вектора pHEN1, несущего нуклеотидные последовательности мономерных и гомодимерных наноантител двух отобранных клонов Anti1 и Anti2, обладающих наиболее выраженной нейтрализующей активностью в отношении TcdA.

Задачей описанных здесь мономерных и гомодимерных форм наноантител, нейтрализующих TcdA, является нейтрализация токсина А С. difficile в целях предотвращения и/или устранения патогенных эффектов при интоксикации клеток кишечника TcdA, что может произойти в случае инфекции С. difficile.

В частности, гомодимерные наноантитела, нейтрализующие TcdA, обладают выраженными протективными свойствами, что было продемонстрировано в экспериментах in vitro и in vivo в модели летальной токсинемии TcdA.

Технический результат заключается в получении и использовании заявленных наноантител, нейтрализующих TcdA, и/или любых препаратов и производных на их основе для устранения и/или профилактики патогенного воздействия TcdA на организм при токсинемии, которая может быть вызвана инфекцией С. difficile.

Раскрытие изобретения

Указанный технический результат достигается аминокислотными последовательностями мономерной и гомодимерной форм наноантител Anti1 и Anti2, специфически связывающихся с CROPs доменом TcdA и нейтрализующих TcdA, включающие в себя аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 представленные на SEQ ID 1 и SEQ ID 2 (для Anti1 и Anti2 соответственно) и пригодные для способа получения биотехнологическим путем, который включает этап применения рекомбинантного фагового вектора pHEN 1 («плазмида»), несущего вставку - нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности Anti1 и Anti2, включая аминокислотные последовательности CDR1-CDR3, этап трансформации методом теплового шока клеток Е. coli штамма BL21 и экспрессии в нем целевых белковых продуктов, и этап двухступенчатой хроматографической очистки рекомбинантных белковых продуктов. Структурно-функциональные свойства заявленных мономерных и гомодимерных форм наноантител определяются их аминокислотными последовательностями и условиями их получения, за счет которых они специфически связывают CROPs домен TcdA и нейтрализуют TcdA, оказывая протективный эффект при их применении в in vitro и in vivo моделях токсинемии TcdA.

Аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 заявленных мономерных и гомодимерных форм наноантител клонов Anti1 и Anti2 представлены на SEQ ID 1 и SEQ ID 2 соответственно.

Пример 1

Заявленные наноантитела, нейтрализующие TcdA, получали биотехнологическим путем, включающим этап создания генетической конструкции, которая представляет собой фагмидный вектор pHEN1, несущий нуклеотидную последовательность, кодирующую наноантитела, специфически связывающиеся с CROPs доменом TcdA и нейтрализующие TcdA. Карта фагмидного вектора pHEN 1, содержащего вставку, кодирующую наноантитело, нейтрализующее TcdA, представлена на Фиг. 1 (бирюзовой стрелкой выделена область ДНК, кодирующая наноантитело; выделены фланкирующие данную область сайты для рестриктаз SfiI, NotI; за сайтами рестрикции обозначены гомологичные области для праймера pelB). Фагмидный вектор pHEN1, содержащий нуклеотидную последовательность наноантител, использовали для трансформации клеток Escherichia coli штамма TG1.

Последовательности наноантител, специфически распознающих целевой антиген, отбирались при помощи технологии фагового дисплея. В результате были отобраны два клона, обладающие наиболее выраженной нейтрализующей активностью, а именно AntiA1 и AntiA2.

Для получения белковых препаратов заявленных наноантител отобранные после двух раундов селекции фагмиды pHEN1, содержащие специфическую последовательность наноантител, использовали для трансформации методом теплового шока клеток Е. coli штамма BL21.

Белковые препараты наноантител выделяли из растворимой фракции белкового лизата клеток Е. coli штамма BL21 методом двухстадийной хроматографии: первая стадия - аффинная хроматография, вторая стадия - эксклюзионная хроматография.

Пример 2

На основе наноантител, обладающих наиболее выраженной нейтрализующей активностью (клоны AntiA1 и AntiA2), получали модифицированные бивалентные формы (гомодимеры). Мономеры антител в модифицированных молекулах соединяли с помощью гибкого глицинсеринового линкера (Gly4Ser)4. Конструкции получали с помощью двух раундов полимеразной цепной реакции. В первом раунде ПЦР последовательности антител амплифицировали с помощью высокоточной ДНК-полимеразы Q5 (NEB, Великобритания) с использованием праймеров VHH3-15F, VHH-20R, pHEN-F и pHEN-R (таблица 1). Во втором раунде ПЦР полученные фрагменты объединяли с помощью праймеров pHEN-F и pHEN-R (таблица 1). Полученные нуклеотидные последовательности гомодимерных наноантител клона AntiA1 и клона AntiA2 клонировали в вектор pHEN1 и трансформировали Е. Coli штамма BL21 для получения белковых продуктов антител (по примеру 1).

Пример 3

Исследования по оценке нейтрализующей активности димерных антител клонов Anti1 и Anti2 проводились на культуре клеток почки африканской зеленой мартышки - Vero Е6, - обработанной токсином TcdA С. difficile.

В качестве ростовой среды использовали среду DMEM, содержащую 10 % инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки, глутамин (584 мг/л) и антибиотики пенициллин и стрептомицин. Клетки рассевали в лунки 96-луночного планшета для культур клеток (по 104 клетки на лунку) и помещали в инкубатор (параметры культивирования: 5 % СО₂, 37°C). Через 24 часа в лунки планшета к клеткам Vero Е6 добавляли рекомбинантный токсин TcdA С. difficile в концентрации 250 пг/мл. Отрицательным контролем в данном эксперименте выступали не обработанные токсином клетки. Затем клетки возвращали в инкубатор. Результаты эксперимента оценивали визуально методом микроскопирования (инвертированный микроскоп) с увеличением х20 через 24 часа после добавления токсина.

Репрезентативные фотографии клеток линии Veto Е6, к которым добавляли рекомбинантный токсин TcdA С. difficile без или с добавлением однодоменных антител отобранных клонов Anti1 и Anti2 в димерной форме, представлены на Фиг.2 (в качестве отрицательного контроля использовали не обработанные токсином клетки, ув.20, клон антитела указан на каждой микрофотографии).

При использовании дозы токсина TcdA С. difficile 75 нг/мл, приводящей к сохранению 15 % клеток относительно не обработанных токсином контрольных клеток, клон димерного наноантитела Antil увеличивал выживаемость клеток до 86 %, а клон Anti2 - до 76 %. При дозе токсина 18,75 нг/мл оба клона димерных наноантел - Anti1 и Anti2 - показывали значения, близкие к интактным клеткам (98 % и 94 % соответственно).

Пример 4

Способность препаратов димерных форм наноантител клонов Anti1 или Anti2 защищать животных от интоксикации TcdA была изучена на модели летальной токсинемии с использованием препаратов TcdA и мышей линии BALB/c.

В качестве летальной дозы была использована доза 50 нг токсина TcdA на животное. Доза наноантител составляла 540 мкг на животное. Количество животных в каждой группе - 4 особи. В ходе эксперимента 200 нг токсина смешивалось с 2160 мкг димерного наноантитела клона Anti1 или Anti2 и вводилось животным интраперитонеально. Далее проводился учет количества выживших животных.

Выживаемость животных, получивших перорально полноразмерный рекомбинантный токсин TcdA С. difficile без и с димерным наноантителом клона Anti1 или Anti2, показана на Фиг.3 (на оси Y отображен процент выживших животных; на оси X отображено время наблюдения в часах; справа указана легенда цветовой индикации выживаемости животных в каждой группе).

Использование димерных наноантител клона Anti1 или Anti2 в дозе 540 мкг на животное позволило защитить 100% животных от смерти вследствие воздействия летальной дозы TcdA 50 нг на животное.

Было установлено, что препараты димерных наноантител клона Anti1 или Anti2 статистически достоверно обеспечивают защиту животных (р<0.05 согласно критерию log-rank) относительно контрольной группы животных без дополнительной терапии в модели летальной токсинемии TcdA.

Перечень отобранных однодоменных антител и аминокислотные последовательности их Cdr1,2,3 регионов

№ п/п Название клона № SEQ ID CDR1 CDR2 CDR3 1 TAP1-G7.1 (Anti1) SEQ ID 1 GSSISS IYTRAG AAQPSFGGLNNICSFDGN 2 TAP1-C4.2 (Anti2) SEQ ID 2 AFGNY IRTGGG ATAGDRWHATDAFILR

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Аминокислотные последовательности, кодирующие наноантитела,

нейтрализующие токсин А Clostridioides difficile.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2024-08-21">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023132766</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-12</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение &quot;Центр стратегического планирования и

управления медико-биологическими рисками здоровью&quot; Федерального

медико-биологического агенства</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Institution &quot;Centre

for Strategic Planning and Management of Biomedical Health

Risks&quot; of the Federal medical and biological

agency</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Аминокислотные последовательности,

кодирующие наноантитела, нейтрализующие токсин А Clostridioides

difficile</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GSSISS</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>IYTRAG</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AAQPSFGGLNNICSFDGN</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>5</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..5</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>AFGNY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>6</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..6</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>IRTGGG</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ATAGDRWHATDAFILR</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии, конкретно к наноантителам в мономерной и гомодимерной формах, специфично связывающим и нейтрализующим TcdA, способам их получения. Изобретение и/или любые препараты и производные на его основе могут быть использованы для устранения и/или профилактики патогенного воздействия TcdA на организм при токсинемии, которая может быть вызвана инфекцией С. difficile. Наноантитела по настоящему изобретению обладают выраженной токсиннейтрализующей активностью, подтвержденной в исследованиях in vitro и in vivo. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Наноантитело в мономерной и гомодимерной формах с аминокислотной последовательностью, специфически связывающейся с CROPs доменом TcdA и нейтрализующей TcdA, включающей в себя аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, представленные на SEQ ID 1, SEQ ID 2, SEQ ID 3 соответственно, и пригодные для способа получения биотехнологическим путем, который включает этап применения рекомбинантного фагового вектора pHEN1, несущего вставку - нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность наноантитела, включая аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, этап трансформации методом теплового шока клеток Е. coli штамма BL21 и экспрессии в нем целевых белковых продуктов и этап двухступенчатой хроматографической очистки рекомбинантных белковых продуктов.

2. Наноантитело в мономерной и гомодимерной формах с аминокислотной последовательностью, специфически связывающейся с CROPs доменом TcdA и нейтрализующей TcdA, включающей в себя аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, представленные на SEQ ID 4, SEQ ID 5, SEQ ID 6 соответственно, и пригодные для способа получения биотехнологическим путем, который включает этап применения рекомбинантного фагового вектора pHEN1, несущего вставку - нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность наноантитела, включая аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, этап трансформации методом теплового шока клеток Е. coli штамма BL21 и экспрессии в нем целевых белковых продуктов и этап двухступенчатой хроматографической очистки рекомбинантных белковых продуктов.

3. Применение наноантитела по п. 1 и/или наноантитела по п. 2 для нейтрализации TcdA С. difficile.