СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛОТНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ САMPYLOBACTER JEJUNI И CAMPYLOBACTER COLI Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной микробиологии, а именно к применению способа культивирования бактерий Campylobacter jejuni и Campylobacter coli на плотной агаровой питательной среде при посеве материала от больных людей и животных, а также объектов окружающей среды.

Установлено, что естественным резервуаром кампилобактеров являются дикие и домашние животные, у которых кампилобактерии вызывают диарею, аборты, бесплодие (А.Б.Дайтер, Т.Я.Ценева, В.Н.Семенович. Зооантропонозные инфекции в животноводческих комплексах северо-западного региона // Болезни с природной очаговостью. Ленинград, 1983, с.39-50).

Обнаружение кампилобактерий в испражнениях больных людей и животных осуществляется с помощью ряда плотных агаровых питательных сред, состоящих из основы (кампилобакагар, железо-эритрит кровяной агар, триптозосоевый агар и др.) и добавок, способствующих угнетению роста сопутствующей микрофлоры (наборы различных антибиотиков) или создающих благоприятные условия для их роста в агаровой среде.

В бактериологии известен способ культивирования кампилобактерий с использованием в качестве добавки в плотные питательные среды активированного древесного угля (Н.А.Чайка, Л.Б.Хазенсон, Ж.П.Бутцлер. Кампилобактериоз. М.: Медицина, 1998). Однако известный способ имеет недостаток - трудность выявления выросших мелких колоний на черном фоне агаровых сред, что не дает получить технический результат - упрощение способа (сложность визуального учета результатов посева). Наиболее близким к заявляемому, учитывая биологическую природу добавки, вносимой в питательную основу, является способ культивирования кампилобактерий на плотных агаровых питательных средах с добавлением цельной или лизированной крови животных (Е.А.Кирьянов. Кампилобактериоз животных. Приморский сельскохозяйственный институт, г.Уссурийск, 1992. 23 с.; Hutchinson D.N, Bolton F., J. Clin. Pathol., 1983, v.36, p.1350-1352; Bolton F., Coates D., J. Appl. Bacteriol., 1983, v.54, p.115-125).

Однако недостатками данного способа являются:

- трудность визуального выявления на красном фоне среды мелких, (не более 1 мм) плоских колоний Campylobacter jejuni и Campylobacter coli;

- необходимость в содержании животных;

- забор крови с соблюдением мер асептики;

- дополнительная стадия приготовления среды - лизирование крови;

- ограниченный срок хранения крови;

- получение и транспортировка крови от сторонних организаций.

Указанные недостатки не дают возможность получить технический результат - упрощение способа. Сходство предлагаемого способа с известным состоит в том, что они оба относятся к бактериологии и основаны на использовании плотных агаровых питательных сред с добавлением стимулирующих добавок.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - упрощение способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата - упрощения способа культивирования кампилобактерий и выявления колоний на поверхности плотной агаровой питательной среды. Решение задачи заключается в том, что на 1 литр плотной агаровой питательной среды, имеющей t 45°C, берут 100 мл стерилизованной текучим паром при t 100°C в течение 30 мин и остуженной до t 45°С четырехсуточной бульонной культуры бактерий Escherichia coli штамм М17, выращенной при t 37°С с посевной дозой 100 мкл 1 млрд взвеси суточной агаровой культуры в физиологическом растворе 0,15М рН 7,2-7,4.

Использование плотной агаровой питательной среды с данной добавкой обеспечивает усиленный рост и визуализацию выросших колоний выделяемого вида бактерий на поверхности среды. Температурным режимом культивирования бактерий Campylobacter jejuni и Campylobacter coli является температура 37°С.

Предлагаемый способ апробирован на плотной агаровой питательной среде с добавлением Escherichia coli штамм М17: железо-эритрит агар, питательная среда для культивирования кампилобактерий (кампилобакагар) и триптозосоевый агар в лаборатории микробиологической диагностики инфекций краевой НИИ инфекционной патологии ГОУ ВПО АГМА Росздрава в течение 2006-2007 гг.

Пример

Источником Escherichia coli штамм М17 служит Колибактерин сухой (1 фл. лиофилизата живых бактерий кишечной палочки М17, 5 доз) производства: Микроген НПО ФГУП (НПО «Биомед»). Содержимое флакона разводят 5 мл стерильного физиологического раствора 0,15М рН 7,2-7,4. После полного растворения порошка бактериологической петлей делают посев на поверхность мясопептонного агара в чашку Петри, а затем инкубируют при t 37°С в течение суток. Из суточной культуры готовят 1 млрд взвесь на физиологическом растворе 0,15М рН 7,2-7,4 по оптическому стандарту мутности, которой в объеме по 100 мкл засевают флаконы со 100 мл мясопептонного бульона. Инкубацию посевов осуществляют при t 37°С в течение четырех суток, по окончании которой следует стерилизация содержимого флаконов текучим паром при t 100°С в течение 30 мин. В приготовленную согласно инструкции и остуженную до t 45°С питательную среду в объеме 1 литр (железо-эритрит кровяной агар, питательная среда для культивирования кампилобактерий (кампилобакагар), триптозосоевый агар) добавляют антибиотики для подавления роста сопутствующей микрофлоры и 100 мл мясопептонного бульона, содержащего стерилизованную культуру Escherichia coli штамм M17.

Температура мясопептонного бульона, так же как и питательной основы, должна быть 45°С. Полученную смесь перемешивают и разливают в чашки Петри.

Для определения эффективности способа культивирования бактерий Campylobacter jejuni и Campylobacter coli проводят сравнение с использованием общеизвестных сред: железо-эритрит кровяной агар, питательная среда для культивирования кампилобактерий (кампилобакагар), триптозосоевый агар с добавлением в каждую на 1 литр:

лошадиная лизированная кровь 50,0 мл активированный древесный уголь 4,0 г

Производят посев чистых культур Campylobacter jejuni и Campylobacter coli в количестве 10, 100 и 1000 микробных тел по оптическому стандарту мутности в объеме 100 мкл. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в микроаэрофильных условиях в течение 48 час. Во всех чашках с 10 м.т. роста кампилобактерий нет. При посеве 100 м.т. количество выросших колоний составляет 6-14, а при посевной дозе 1000 м.т. число колоний от 20 до 150 в отдельных чашках в зависимости от добавки. Диаметр колоний кампилобактерий с использованием активированного угля и лизированной крови около 1 мм. Они имеют круглую форму, плоские, полупрозрачные, выявление их затруднено на черном или красном фоне агаровой среды. Колонии кампилобактерий, выросшие на агаровой среде с добавлением E.coli штамм M17, так же как и в сравниваемых средах, имеют типичные для кампилобактерий морфологические, тинкториальные и биохимические свойства. Количество колоний одинаково, однако на чашках с предлагаемой нами добавкой диаметр колоний кампилобактерий составляет 1,5 мм, что позволяет регистрировать их невооруженным глазом на поверхности среды. Форма каплеобразных колоний круглая, поверхность гладкая, блестящая.

Таким образом, авторами представлен способ, в котором используют 4-суточную культуру E.coli штамм M17, выращенную в 100 мл мясопептонного бульона при 37°С и стерилизованную текучим паром при 100°С в течение 30 мин, в качестве добавки в питательные среды, никем ранее не предложенную с целью стимуляции роста бактерий Campylobacter jejuni и Campylobacter coli.

Предлагаемый способ обеспечивает простоту выполнения технического решения - упрощение способа приготовления питательной среды для выделения бактерий Campylobacter jejuni и Campylobacter coli и визуального учета выросших колоний на поверхности среды.

Предложенный способ культивирования бактерий Campylobacter jejuni и Campylobacter coli может быть рекомендован для использования в практических и научно-исследовательских лабораториях бактериологического профиля.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования бактерий рода Campylobacter jejuni и Campylobacter coli. Способ предусматривает посев бактерий Escherichia coli штамм М-17 на мясопептонный бульон с последующим инкубированием при t 37°С в течение 4-суток, прогрев 4-суточной культуры Escherichia coli штамм М-17 текучим паром в течение 30 минут. Затем прогретую культуру Escherichia coli штамм М-17 охлаждают до температуры 45°С и добавляют к 100 мл мясопептонного бульона, после чего мясопептонный бульон, содержащий 4-суточную культуру Escherichia coli штамм М-17, выращенную при t 37°С в мясопептонном бульоне, добавляют к 1 литру плотной агаровой питательной среды. Изобретение позволяет упросить визуальный учет Campylobacter jejuni и Campylobacter coli бактерий и упросить способ получения питательной среды.

Способ получения плотной питательной среды для культивирования бактерий Campylobacter jejuni и Campylobacter coli, предусматривающий добавление к 1 л плотной агаровой питательной среды 100 мл мясопептонного бульона, содержащего прогретую в течение 30 мин текучим паром и остуженную до 45°С 4-суточную культуру бактерий Escherichia coli штамм М-17, выращенную при 37°C в мясопептонном бульоне.