ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli ГИСК № 281, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОДУЦИРОВАТЬ ТЕРМОЛАБИЛЬНЫЙ ЛТ-ЭНТЕРОТОКСИН Российский патент 2007 года по МПК C12N1/00 A61K39/108 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтеротоксина) и анатоксина Escherichia coli при производстве вакцин.

Техническим результатом является штамм Escherichia coli ГИСК №281, выделен от больного с урологической инфекцией в Республиканском онкологическом диспансере г.Уфы, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича и имеет регистрационный номер 281.

Штамм Escherichia coli ГИСК №281 характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

При выращивании на обычных питательных средах при температуре 37°С штамм на поверхности плотной питательной среды растет с образованием характерных полупрозрачных изолированных колоний в течение суток. При выращивании в бульоне Хоттингера (рН 7,2-7,4), при температуре 37°С в течение 24 часов вызывает равномерное помутнение и выпадением осадка.

Способы определения активности ЛТ-энтеротоксина:

Субплантарное введение мышам весом 15-16 г 0,05 мл центрифугата 20 часовой бульонной культуры вызывает отек лапки более 100 мг. Аксенова Е.В. 1980 г.

Интраназальное введение 0,05 мл 20-часовой бульонной культуры вызывает острую токсическую пневмонию у белых мышей-самцов весом 15-16 г (гибель в течение 4 часов). Войно-Ясенецкая Н.К. 1957 г.

Внутримышечное введение 300 млн микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром 2,5 см.

В опыте петля тонкой кишки кролика при введении 80 млн м.т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результат (V/L=1,2).

Гретый при 56°С в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывая некроза кожи кролика. Гретая при 100°С 20-часовая культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (V/L=0,3).

Условия хранения культуры после лиофильной сушки в ампуле или выращенной при 37°С на 0,3%-ном МПА (рН 7,2-7,4), залитым стерильным вазелиновым маслом, при температуре 4°С.

Среды для размножения - бульон Хоттингера (рН 7,2), мясопептонной агар, содержащий 5% эритроцитов кролика, при температуре 37°С в течение 24 часов.

Генетические особенности: Hly+, Ent+, MS+, MR+, LTh+.

Устойчив к пенициллину, ампициллину, олеандомицину, цефтазидину, цефазолину, ристомицину, линкомицину, фузидину, клиндамицину.

Пример 1.

0,1 мл 1 млрд суспензии суточной агаровой культуры в физиологическом растворе сеют в стерильный бульон Хотингера (5 мл рН-7,2) инкубируют в термостате при 37°С в течение 20 часов, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 7 минут. Полученную надосадочную жидкость (центрифугат) в объеме 0,05 мл вводят субплантарно в заднюю левую лапку мышей-самцов весом 15-16 г. Через 24 часа животных умерщвляют эфиром и ампутированные по голено-стопному суставу лапки взвешивают на торсионных весах, при этом центрифугат штамма Escherichia coli ГИСК №281 давал разницу между левой и правой лапками не менее 100 мг, остальные 20 штаммов, способные продуцировать ЛТ-энтеротоксин от 65 до 90 мг. Контроли - нативный стерильный бульон Хоттингера (рН 7,2) и гретый при 56°С центрифугат 20-часовой бульонной культуры 30-35 мг соответственно.

Результаты приведены в таблице.

Пример 2.

0,1 мл 1 млрд суспензии суточной агаровой культуры сеют в бульон Хоттингера (рН 7,2), инкубируют в термостате при 37°С в течение 20 ч и 80 млн м.т. суспезию в объеме 1 мл вводят в сегмент изолированной петли тонкого кишечника кролика. Через 16 часов животных умерщвляют воздушной эмболией и рассчитывают соотношение объема экссудата к длине сегмента (V/L). При этом 20-часовая бульонная культура штамма Escherichia coli ГИСК №281 оказалась способной давать накопление жидкости в большом количестве и показатель V/L составил 1,2. У остальных 20 штаммов, способных продуцировать ЛТ-энтеротоксин, показатель V/L колебался в пределах 0,9-1,2. При введении стерильного бульона Хоттингера и гретой при 100°С 20-часовой бульонной культуры отношение объема накопленной жидкости к длине сегмента составило 0,25 и 0,3 соответственно.

Сравнительные показатели ЛТ-энтеропродуцирующей активности Escherichia.Номер штаммаВидОтек лапок (мг)Изолированная петля тонкого кишечника (V/L)281E.coli ГИСК №2811101,2624-\-740,9331-\-760,9144-\-801,0702-\-851,01065-\-750,824-\-700,7133-\-780,9Контроль 300,25-0,3Примечание: в таблице приведены средние данные из пяти отеков.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Esherichia coli №281 депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича. Штамм обладает высокой способностью продуцировать термолабильный ЛТ-энтеротоксин и может быть использован для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтеротоксина) и анатоксина Esherichia coli при производстве вакцин. 1 табл.

Штамм бактерий Esherichia coli ГИСК №281, обладающий способностью продуцировать термолабильный ЛТ-энтеротоксин.