ГЕН MMP8opt МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ 8 Российский патент 2010 года по МПК C12N15/57 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к генно-инженерным конструкциям для экспрессии трансгенов в клетках млекопитающих с целью их применения в клеточной инженерии и в генной терапии, а именно к модификации последовательности гена для трансфекции клеток печени in vivo с целью экспрессии в них металлопротеиназы 8.

Металлопротеиназы представляют собой ферменты, расщепляющие белки, которые находят широкое применение в пищевой и легкой промышленности, в сельском хозяйстве, а также в медицине. В частности, матриксные металлопротеиназы обладают способностью расщеплять коллаген - основной компонент внеклеточного матрикса, и расщепление коллагена под действием этих ферментов приводит к уменьшению степени фиброза и к улучшению кровоснабжения клеток печени (Siller-Lopez F, et al. Gastroenterology 2004; 126: 1122-1133; IredaleJP, Gastroenterology. 2004 126(4): 1199-201). Для продуцирования ММР8 используют ДНК, содержащую природный ген металлопротеиназы 8 человека (Garcia-Bañuelos J, et al. Gene Theraphy. 2002 Jan; 9(2): 127-34).

Технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлось создание гена металлопротеиназы 8, при включении которого в состав эукариотического вектора обеспечивался бы более высокий уровень экспрессии названного белка в клетках, трансфицированных названным вектором.

Технический результат достигался созданием гена MMP8opt путем модификации природной последовательности гена ММР 8 таким образом, чтобы триплет нуклеотидов, кодирующий каждую из аминокислот белковой последовательности ММР 8, встречался в генах человека наиболее часто.

На фиг.1. показана последовательность нуклеотидов гена MMP8opt, а также последовательность аминокислот кодируемого белкового продукта - матриксной металлопротеиназы 8 человека.

На фиг.2 показан предназначенный для клонирования участок ДНК вектора рВА, а на фиг.3 - функциональная карта плазмиды pC4W-MMP8opt

Синтез гена и плазмиды осуществляли с помощью стандартной технологии и оборудования, применяемых для решения подобных задач в генной инженерии (Watson, J.D., Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M. - Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 1992). Дизайн оптимизированной последовательности нуклеотидов, кодирующей матриксную металлопротеиназу человека ММР 8, производили, основываясь на вырожденности генетического кода. Для каждой аминокислоты белковой последовательности ММР 8 выбирали кодирующий ее триплет нуклеотидов, наиболее часто встречающийся в генах человека. При этом использовали частоты встречаемости кодонов, приведенные на вэб-сайте http://del.mediaglyphs.org/mg/bf/nucs_aa.html. Полученная таким образом последовательность нуклеотидов представлена на фиг.1.

Плазмиду pC4W-MMP8opt, несущую оптимизированный ген MMP8opt, получали методом генно-инженерного конструирования в 6 стадий.

На первой стадии изготавливали вектор для клонирования рВА. Для этого химически синтезированные пары олигонуклеотидов

VEC-89 (AAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCAC) и

VEC-90 (CCATGGTGGCTTTACCAACAGTACCGGAATGCCA),

VEC-91 (CATGGAGATCTCGTCTCTGGCCATCCCGGG) и

VEC-92 (CGGAACCCGGGATGGCCAGAGACGAGATCTC),

VEC-93 (TTCCGGATGTCTTCGATATCTGCAGGATCCT) и

VEC-94(CTAGAGGATCCTGCAGATATCGAAGACATC),

отжигали, смешивали и клонировали в расщепленный рестриктазами HindIII и XbaI вектор pBluescriptII-SK⁺. В результате вектор рВА имеет предназначенный для клонирования участок ДНК, представленный на фиг.2.

На второй стадии:

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами NcoI и ВаmHI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

ММР-101 (CATGTTCTCCCTGAAAACCCTGCCCTTCCTGC) и

MMP-102(GCAGCAGCAGGAAGGGCAGGGTTTTCAGGGAGAA),

ММР-103 (TGCTGCTGCACGTGCAGATCTCCAAGGCCTTC) и

ММР-104 (CACGGGGAAGGCCTTGGAGATCTGCACGTGCA),

ММР-105m (CCCGTGTCCTCCAAGGAGAAGAACACCAAGACCGTGCAATGTCTTCG) и

MMP-106m(GATCCGAAGACATTGCACGGTCTTGGTGTTCTTCTCCTTGGAGGA)

с получением промежуточной плазмиды pBD-MMP8-N1-D2;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и ВаmHI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов ММР-107 m

(GATCCGAAGACATTGCAGGACTACCTGGAGAAGTTCTACCAGCTGCCCAG) и ММР-108 m

(TGGTTGCTGGGCAGCTGGTAGAACTTCTCCAGGTAGTCCTGCAATGTCTTCG),

ММР-109 (CAACCAGTACCAGTCCACCAGGAAGAACGGCACCAAC) и

ММР-110 (GATCACGTTGGTGCCGTTCTTCCTGGTGGACTGGTAC),

ММР-111 (GTGATCGTGGAGAAGCTGAAGGAGATGCAGCGGTTCTTC) и

ММР-112 (GGCCGAAGAACCGCTGCATCTCCTTCAGCTTCTCCAC) с получением промежуточной плазмиды pBD-MMP8-D2-B3;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и BbsI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

ММР-113 (GGCCTGAACGTGACCGGCAAGCCCAACGAGGAGACCCTGGACATGA) и

ММР-114 (TCTTCATCATGTCCAGGGTCTCCTCGTTGGGCTTGCCGGTCACGTTCA),

MMP-115 (TGAAGAAGCCTCGCTGCGGCGTGCCCGACAGCGGCGGCTTCATGCT) и

ММР-116 (GGGGTCAGCATGAAGCCGCCGCTGTCGGGCACGCCGCAGCGAGGCT),

MMP-117 (GACCCCAGGCAACCCCAAGTGGGAGCGCACCAACCTGACCTACAGAAT) и

ММР-118 (CCGGATTCTGTAGGTCAGGTTGGTGCGCTCCCACTTGGGGTTGCCT)

с получением промежуточной плазмиды рВА-ММР8-В3-А4;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и BbsI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

ММР-119 (CCGGAACTACACCCCACAGCTGTCCGAGGCCGAGGTG) и

MMP-120(TCTCTCCACCTCGGCCTCGGACAGCTGTGGGGTGTAGTT),

ММР-121 (GAGAGAGCCATCAAGGACGCCTTCGAGCTGTGGA) и

ММР-122 (CCACGCTCCACAGCTCGAAGGCGTCCTTGATGGC),

MMP-123 (GCGTGGCCTCCCCTCTGATCTTCACCAGGATCTCCCAGGGCGA) и

ММР-124 (GGCCTCGCCCTGGGAGATCCTGGTGAAGATCAGAGGGGAGG) с получением промежуточной плазмиды рВА-ММР8-А4-В5;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и BbsI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

ММР-125 (GGCCGACATCAACATCGCCTTCTACCAGAG) и

ММР-126 (TGGTCTCTCTGGTAGAAGGCGATGTTGATGTC),

ММР-127 (AGACCACGGCGACAACTCCCCCTTCGACGG) и

ММР-128 (TTGGGGCCGTCGAAGGGGGAGTTGTCGCCG),

ММР-129 (CCCCAACGGCATCCTGGCCCACGCCTTCCAGC) и

ММР-130 (CCGGGCTGGAAGGCGTGGGCCAGGATGCCG) с получением промежуточной плазмиды рВА-ММР8-В5-А6;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и BbsI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

ММР-131 (CCGGCCAGGGCATCGGCGGCGACGCCCACTTCGACGCC) и

ММР-132 (CTCCTCGGCGTCGAAGTGGGCGTCGCCGCCGATGCCCTGG),

ММР-133 (GAGGAGACCTGGACCAACACCTCCGCCAACTACAACCTGT) и

ММР-134 (CCAGGAACAGGTTGTAGTTGGCGGAGGTGTTGGTCCAGGT),

MMP-135 (TCCTGGTGGCCGCCCACGAGTTCGGCCACTCCCTGGGCCT) и

MMP-136 (GGCCAGGCCCAGGGAGTGGCCGAACTCGTGGGCGGCCA)

с получением промежуточной плазмиды рВА-ММР8-А6-В7;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и BbsI, клонировали химически синтезированную пару олигонуклеотидов

MMP-137 (GGCCCACTCCTCTGACCCTGGCGCCCTGATGTACCCCAACTACGC) и

MMP-138 (CTGAAGGCGTAGTTGGGGTACATCAGGGCGCCAGGGTCAGAGGAGTG),

MMP-139 (CTTCAGGGAGACCAGCAACTACTCCCTGCCTCAGGACGACATCGA) и

MMP-140 (ATGCCGTCGATGTCGTCCTGAGGCAGGGAGTAGTTGCTGGTCTCC),

MMP-141 (CGGCATCCAGGCCATCTACGGCCTGTCCAGCAACCCCATCCAGCCCA) и

MMP-142 (CCGGTGGGCTGGATGGGGTTGCTGGACAGGCCGTAGATGGCCTGG) с получением промежуточной плазмиды рВА-ММР8-В7-А8;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами HindIII и BbsI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

ММР-143 (CCGGCCCCAGCACCCCCAAGCCCTGCGACCCCAGCCTG) и

MMP-144 (GAAGGTCAGGCTGGGGTCGCAGGGCTTGGGGGTGCTGGGG),

ММР-145 (ACCTTCGACGCCATCACCACCCTGCGGGGCGAGATCCTG) и

MMP-146 (GAAGAACAGGATCTCGCCCCGCAGGGTGGTGATGGCGTC),

MMP-147m (TTCTTCAAGGACAGGTACTTCTGGAGAAGGCACCCCCAGCTGCAAGAGACGA) и MMP-148m (AGCTTCGTCTCTTGCAGCTGGGGGTGCCTTCTCCAGAAGTACCTGTCCTT) с получением промежуточной плазмиды pDA-MMP8-A8-D9;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и BamHI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

MMP-149m (GATCCGAAGACATTGCAGAGAGTGGAGATGAACTTCATCTCTCTGTTCTGGC) и

ММР-150 m (GGGAGGGCCAGAACAGAGAGATGAAGTTCATCTCCACTCTCTGCAATGTCTTCG),

ММР-151 (CCTCCCTGCCCACCGGCATCCAGGCCGCCTACGAGGACTTC) и

ММР-152 (TCTGTCGAAGTCCTCGTAGGCGGCCTGGATGCCGGTGGGCA),

MMP-153 (GACAGAGACCTGATCTTCCTGTTCAAGGGCAACCAGTACTG) и

ММР-154 (GGCCCAGTACTGGTTGCCCTTGAACAGGAAGATCAGGTC)

с получением промежуточной плазмиды pBD-MMP8-D9-B10;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и BamHI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

ММР-155 (GGCCCTGAGCGGCTACGACATCCTGCAGGGCTACC) и

ММР-156 (CTTGGGGTAGCCCTGCAGGATGTCGTAGCCGCTCAG),

ММР-157m (CCAAGGACATCTCCAACTACGGCTTCCCCAGCAGCGTGCAATGTCTTCG) и

ММР-158m (GATCCGAAGACATTGCACGCTGCTGGGGAAGCCGTAGTTGGAGATGTC)

с получением промежуточной плазмиды pBD-MMP8-B10-Dl 1;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами HindIII и BbsI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

ММР-159 m (AGCTTCGTCTCTTGCAGGCCATCGACGCCGCCGTGTTCTACAGAAGCAAGACCTA) и ММР-160 m

(AAGAAGTAGGTCTTGCTTCTGTAGAACACGGCGGCGTCGATGGCCTGCAAGAGAC GA),

ММР-161 (CTTCTTCGTGAACGACCAGTTCTGGAGATACGACAACCAGAGAC) и

ММР-162 (TGAACTGTCTCTGGTTGTCGTATCTCCAGAACTGGTCGTTCACG),

ММР-163 (AGTTCATGGAGCCCGGCTACCCCAAGAGCATCTCCGGCGCCTTCC) и

ММР-164 (CCGGGGAAGGCGCCGGAGATGCTCTTGGGGTAGCCGGGCTCCA)

с получением промежуточной плазмиды pDA-MMPS-D11-A12;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и BbsI, клонировали химически синтезированные пары олигонуклеотидов

ММР-165 (CCGGCATCGAGAGCAAGGTGGACGCCGTGTTCCAGC) и

ММР-166 (GCTCCTGCTGGAACACGGCGTCCACCTTGCTCTCGATG),

ММР-167 (AGGAGCACTTCTTCCACGTGTTCAGCGGCCCCAGATAC) и

ММР-168 (GGCGTAGTATCTGGGGCCGCTGAACACGTGGAAGAAGT),

MMP-169 (TACGCCTTCGACCTGATCGCCCAGAGAGTGACCAGAGT) и

ММР-170 (GGCCACTCTGGTCACTCTCTGGGCGATCAGGTCGAA)

с получением промежуточной плазмиды рВА-ММР8-А12-В13;

- в вектор рВА, расщепленный рестриктазами BsmBI и EcoRV, клонировали химически синтезированную пару олигонуклеотидов

ММР-171 (GGCCAGAGGCAACAAGTGGCTGAACTGCAGATACGGCTGAT) и

ММР-172 (ATCAGCCGTATCTGCAGTTCAGCCACTTGTTGCCTCT) с получением промежуточной плазмиды рВА-ММР8-В13-Е14.

Встраивание соответствующих последовательностей ДНК подтверждали секвенированием.

На третьей стадии;

- Bbsl - BsmBI фрагмент плазмиды pBD-MMP8-D2-B3 и BsmBI - XbaI фрагмент плазмиды рВА-ММР8-В3-А4 клонировали в плазмиду pBD-MMP8-Nl-D2, расщепленную рестриктазами BbsI и XbaI, с получением новой промежуточной плазмиды рВА-ММР8-Н1-А4;

- BsmBI - Bbsl фрагмент плазмиды рВА-ММР8-В5-А6 и BamHI - BsmBI фрагмент плазмиды рВА-ММР8-А4-В5 клонировали в плазмиду рВА-ММР8-А6-В7, расщепленную рестриктазами BbsI и BamHI, с получением новой промежуточной плазмиды рВА-ММР8-А4-В7;

- ВаmHI - BsmBI фрагмент плазмиды pDA-MMP8-A8-D9 клонировали в плазмиду pBD-MMP8-D9-B10, расщепленную рестриктазами Bbsl и ВаnHI, с получением новой промежуточной плазмиды

рВА-ММР8-А8-В10;

- XhoI - BbsI фрагмент плазмиды pBD-MMP8-B10-D11 клонировали в плазмиду pDA-MMP8-D11-A12, расщепленную рестриктазами XhoI и BsmBI, с получением новой промежуточной плазмиды рВА-ММР8-В10-А12;

- ВаmHI - BsmBI фрагмент плазмиды рВА-ММР8-А12-В13 и BsmBI - EcoRV фрагмент плазмиды рВА-ММ81-В13-Е14 клонировали в плазмиду рВА, расщепленную рестриктазами BglII и EcoRV, с получением новой промежуточной плазмиды рВА-ММР8-А12-Е14.

Встраивание соответствующих последовательностей ДНК подтверждали рестриктным анализом полученных плазмид.

На четвертой стадии Bbsl - ВаmHI фрагмент плазмиды рВА-ММР8-А12-Е14 клонировали в плазмиду рВА-ММР8-В10-А12, расщепленную рестриктазами BbsI и ВаmHI, с получением новой промежуточной плазмиды рВА-ММР8-В10-Е14. Встраивание соответствующих последовательностей ДНК подтверждали рестриктным анализом полученной плазмиды.

На пятой стадии:

- BbsI - BglII фрагмент плазмиды рВА-ММР8-А4-В7 клонировали в плазмиду рВА-ММР8-Н1-А4, расщепленную рестриктазами BbsI и ВаmHI, с получением новой промежуточной плазмиды рВА-ММР8-Н1-В7;

- BbsI - BsmBI фрагмент плазмиды рВА-ММР8-А8-В10 и BsmBI - ВаmHI фрагмент плазмиды рВА-ММР8-В10-Е14 клонировали в плазмиду рВА-ММР8-В7-А8, расщепленную рестриктазами BbsI и ВаmHI, с получением новой промежуточной плазмиды рВА-ММР8-В7-Е14;

Встраивание соответствующих последовательностей ДНК подтверждали рестриктным анализом полученных плазмид.

На шестой стадии HindIII - BsmBI фрагмент плазмиды рВА-ММР8-Н1-В7 и BsmBI - XbaI фрагмент плазмиды рВА-ММР8-В7-Е14 клонировали в экспрессионный вектор pC4W, расщепленный рестриктазами HindIII и XbaI, с получением конечной плазмиды pC4W-MMP8opt. Встраивание соответствующих последовательностей ДНК подтверждали рестриктным анализом и секвенированием полученной плазмиды.

Функциональная карта плазмиды pC4W-MMP8opt, несущей ген MMP8opt и предназначенной для экспрессии гена матриксной металлопротеиназы 8 в клетках млекопитающих, представлена на фиг.3.

Эффективность заявляемого изобретения иллюстрируется следующим примером.

Пример. Клетки НЕК293, высеянные в лунки 24-луночной плашки (50000 клеток на лунку) в среде DMEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки, трансфицировали плазмидой pC4W-MMP8opt, несущей оптимизированный ген матриксной металлопротеиназы 8 человека MMP8opt. Трансфекцию проводили с использованием 1 мкг ДИК и 1 мкл реагента Липофектамин 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Через 24 ч после трансфекции культуральную среду заменяли на свежую. Анализировали накопление ММР8 в культуральной среде за следующие 48 часов. Концентрацию ММР8 в культуральной среде измеряли при помощи набора "Quantikine Human MMP-8 (total) Immunoassay" компании R&D Systems (США) в соответствии с протоколом производителя. Согласно этим измерениям концентрация ММР 8 в культуральной среде составляла 8.5 мкг/мл, что в 6 раз быше чем при использовании аналогичной ДНК, содержащей немодифицированный ген.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой ген металлопротеиназы 8 с последовательностью нуклеотидов, приведенной на чертеже. Изобретение позволяет при включении данного гена в состав вектора экспрессии обеспечивать высокий уровень экспрессии металлопротеиназы 8 в клетках. 3 ил.

Оптимизированный для экспрессии в клетках млекопитающего ген металлопротеиназы 8, обладающий последовательностью нуклеотидов, приведенной на фиг.1.