ПИТАТЕЛЬНАЯ ДВУХФАЗНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ТРИХОМОНАД Российский патент 2006 года по МПК C12N1/10 C12R1/90 

Изобретение относится к области медицины, а именно микробиологии, и может быть использовано, в частности, для культуральной диагностики трихомоноза.

В связи с недостаточно высокой чувствительностью, субъективизмом при микроскопической постановке диагноза «трихомоноз» и в соответствии с многочисленными Приказами и Инструкциями идентификацию Trichomonas vaginalis проводят культуральным методом, являющимся, по мнению большинства исследователей, «золотым стандартом»: высокочувствительным и специфическим. В значительной степени эффективность его зависит от качества используемых питательных сред. В состав применяемых сред входят мясопептонный бульон (МПБ), препараты печени, минеральные соли, сахара, сыворотка крови человека или животных, соляно-кислый цистеин и другие ингредиенты (Методические рекомендации по приготовлению новых питательных сред для культуральной диагностики трихомоноза утверждены Министерством здравоохранения СССР 18.04.77 г. №10-8/23).

Так, например, начиная с 40-х годов прошлого века широкое распространение получила среда Джонсона-Трасселя (CPLM), которая в модификации ЦНИИКВИ представляет собой жидкую среду зеленоватого цвета, обладающую высокими ростовыми качествами, однако она нестандартна (готовится в лабораторных условиях), имеет ограниченный срок годности.

В 70 - 80-х годах в отделе микробиологии ЦНИИКВИ разрабатывались оригинальные питательные среды для культуральной диагностики трихомоноза, которые с успехом использовались на протяжении ряда лет. Вместе с тем, все они страдают теми же недостатками, что и среда Джонсона-Трасселя, и в последние годы практически не применяются в практике. В состав этих сред входят: смесь гидролизата казеина и гидролизина или аминопептида, отходов фармацевтической промышленности при изготовлении лизоцима, ферментативных гидролизатов биомассы, микроорганизмов, а также экстракта кормовых дожжей. Эти и другие модификации описаны в Приказе №936 и Пособии «Лабораторная диагностика мочеполового трихомониаза» (Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. - Москва: Медицинская книга, Н.Новгород: Издательство НГМА, 2003. С.44-67, 161-182, 242-254).

К середине 90-х годов сложилась парадоксальная ситуация: при эпидемии инфекций передаваемых половым путем (ИППП), и в том числе трихомоноза, в России фактически отсутствовал производственный выпуск стандартных питательных сред для культуральной диагностики этого заболевания. В практике использовались среды, приготовленные в лабораториях, что, естественно, сказывалось на их качестве.

В то же время имеется настоятельная необходимость шире использовать культуральную диагностику трихомоноза, необходимую при постановке диагноза, особенно при сомнительных результатах микроскопии, а также при хроническом рецидивирующем инфекционном процессе, обследовании детей, беременных женщин и ряде других случаев.

Использование питательной среды с высокими ростовыми показателями, стандартного состава и простотой приготовления несомненно приведет к адекватной диагностике такого широко распространенного, отягощенного разнообразными осложнениями заболевания, как мочеполовой трихомоноз.

Наиболее близкой по составу к предлагаемой среде является среда следующего состава: питательная среда 199 - 10 мл, солевой раствор - 100 мл, дрожжевой автолизат - 10 мл, сыворотка крупного рогатого скота или лошади - 30 мл, 20%-ный раствор мальтозы - 10 мл, пенициллин - 160000 ЕД и стрептомицин - 160000 ЕД (Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. - Москва: Медицинская книга, Н.Новгород: Издательство НГМА, 2003. C.180-181).

Однако применение этой среды не исключает необходимость последующей микроскопии с целью установления наличия трихомонад в исследуемом материале. Целью представленного изобретения является повышение чувствительности среды для выделения трихомонад.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая питательная двухфазная среда содержит твердую фазу, представленную коагулированной сывороткой, в количестве 5 мл и жидкую фазу, содержащую питательную среду 199, в количестве 5 мл с раствором натриевой соли бензил-пенициллина 10000-30000 ЕД /мл и раствором стрептомицина 10000-30000 мкг/мл - 1 мл соответственно.

Предлагаемая среда была апробирована на кафедре общей и биоорганической химии Астраханской государственной медицинской академии на 50 образцах материала от больных в течение 2003 г.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример №1.

Для приготовления среды используют компоненты в следующих количествах, мл:

Твердая фаза:

Коагулированная сыворотка «косячком» в пробирке - 5

Жидкая фаза:

Среда 199 - 5

Р-р натриевой соли бензил-пенициллина 10000 ЕД /мл - 1

Р-р стрептомицина 10000 мкг/мл - 1

Антибиотики разводят каждый в 1 мл 0,9% стерильного раствора хлорида натрия и асептически вносят в среду 199.

Посев исследуемого материала осуществляют на поверхность коагулированной сыворотки штрихом бактериологической петлей. Затем на сыворотку наслаивают среду 199 с антибиотиками.

Инкубацию посевов осуществляют при 37°С до 7 суток при отсутствии роста в течение первых дней. При наличии трихомонад в исследуемом материале на границе раздела сред отмечается их обильный рост. Бесприборная визуализация роста трихомонад возможна еще и потому, что среда 199 содержит цветной индикатор, который в случае роста клеток и как следствие этого изменения рН раствора изменяет цвет с красного на желтый.

Пример №2.

Среду готовят в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующих количествах, мл:

Твердая фаза:

Коагулированная сыворотка «косячком» в пробирке - 5

Жидкая фаза:

Среда 199 - 5

Р-р натриевой соли бензил-пенициллина 20000 ЕД /мл - 1

Р-р стрептомицина 20000 мкг/мл - 1

Антибиотики стерильно разводят каждый в 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия и асептически вносят в среду 199.

При наличии трихомонад в исследуемом материале на границе раздела сред отмечается их обильный рост при изменении цвета жидкой фазы.

Пример №3.

Среду готовят в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующих количествах, мл:

Твердая фаза:

Коагулированной сыворотки «косячком» в пробирке - 5

Жидкая фаза:

Среда 199 - 5

Р-р натриевой соли бензил-пенициллина 30000 ЕД /мл - 1

Р-р стрептомицина 30000 мкг/мл - 1

Антибиотики разводят каждый в 1 мл 0,9% стерильного раствора хлорида натрия и асептически вносят в среду 199.

При наличии трихомонад в исследуемом материале на границе раздела сред отмечается их обильный рост и изменение цвета жидкой фазы.

При посеве на предлагаемую среду материала от больных рост сопутствующей бактериальной флоры подавляется.

В таблице 1 даны результаты испытания трех вариантов предлагаемой среды.

Преимуществом предлагаемой среды является ускорение роста трихомонад по сравнению с ростом на среде Био-Рад в связи с тем, что среда 199 содержит питательные компоненты, необходимые для роста эукариотических клеток, к которым и относятся трихомонады. В таблице 2 даны результаты чувствительности известной и предлагаемой сред при посеве трихомонад.

Кроме того, наличие роста трихомонад при посеве их на предлагаемую среду считывается визуально в результате изменения цвета рН-индикатора, в связи с чем отпадает необходимость в последующей микроскопии, что ускоряет процесс постановки диагноза и делает анализ менее трудоемким и дорогостоящим.

Таким образом, использование новой среды значительно повышает чувствительность бактериологического исследования, направленного на выявление трихомонад в материале от больных и обследуемых лиц.

Изобретение может быть рекомендовано к применению в практическом здравоохранении в венерологических, урологических и андрологических учреждениях, а также в научной работе лабораторий соответствующего профиля.

Таблица 1
Ингибирующее влияние на сопутствующую микрофлору и стимулирующее влияние на рост трихомонад компонентов испытуемой средыСодержание ингредиентов в средеНаличие визуального роста трихомонад через 24 ч инкубацииНаличие роста сопутствующей микрофлоры через 24 ч инкубацииМинимальноеСлабый ростЕдиничные колонии бактерий на поверхности твердой фазыОптимальноеОбильный ростОтсутствие ростаМаксимальноеУмеренный ростОтсутствие роста

Таблица 2
Результаты посевов трихомонад на испытуемую среду и среду Био-РадПосевная доза, число клеток в 1 млРезультаты посевов на сравниваемые среды (количество часов, после которых рост трихомонад фиксируется визуально) Предлагаемая средаСреда Био-Рад10048965002448

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии, и может быть использовано для культуральной диагностики трихомоноза. Питательная среда содержит твердую и жидкую фазы. Твердая фаза представлена коагулированной сывороткой. Жидкая фаза содержит питательную среду 199, раствор натриевой соли бензил-пенициллина и раствор стрептомицина. Изобретение позволяет повысить чувствительность питательной среды для выделения трихомонад. 2 табл.

Питательная двухфазная среда для выделения трихомонад, содержащая твердую фазу, представленную коагулированной сывороткой в количестве 5 мл, и жидкую фазу, содержащую питательную среду 199, в количестве 5 мл с раствором натриевой соли бензил-пенициллина 10000-30000 ЕД/мл и раствором стрептомицина 10000-30000 мкг/мл - 1 мл соответственно.