КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ N-α-(2,4,6-ТРИИЗОПРОПИЛФЕНИЛСУЛЬФОНИЛ)-3-ГИДРОКСИАМИДИНО-(L)-ФЕНИЛАЛАНИН-4-ЭТОКСИКАРБОНИЛПИПЕРАЗИДА И/ИЛИ ЕГО СОЛЕЙ Российский патент 2010 года по МПК C07D295/185 A61K31/4965 A61P9/12 A61P35/00 

Описание патента на изобретение RU2388754C2

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым кристаллическим модификациям N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и/или его солей, которые могут быть использованы в качестве фармацевтических средств, а также к содержащим эти новые кристаллические модификации фармацевтическим составам и фармацевтическим применениям.

Новые по настоящему изобретению кристаллические модификации, образующиеся из соединения, известного под химическим названием N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид, являются эффективными ингибиторами серинпротеазы урокиназы и поэтому особенно пригодны для лечения ассоциированных с урокиназой заболеваний, как, например, злокачественных опухолей и метастазирования, в частности, путем орального применения. Свободная основная форма обозначается как WX-671.

Уровень техники

Плазминогенный активатор урокиназного типа (uPA) играет ключевую роль в раковой инвазии и метастазировании (Schmitt et аl., J. Obst. Gyn. 21 (1995), 151-165). uPA экспрессируется в раковых клетках различного типа (Kwaan, Cancer Metastasis Rev. 11 (1992), 291-311) и присоединяется к ассоциированному с раком uPA-рецептору (uPAR), где происходит активация плагминогена в плазмин. Плазмин в состоянии расщеплять различные компоненты внеклеточной матрицы (ЕСМ), например фибронектин, ламинин и коллаген IV-го типа. Он также активирует некоторые другие разрушающие ЕСМ ферменты, в частности матричные металлопротеиназы. Высокое содержание ассоциированного с раком uPA коррелируют с повышенным риском метастазирования для больных раком (Harbeck et al., Cancer Research 62 (2002), 4617-4622). Поэтому ингибирование протеолитической активности uPA является хорошим исходным пунктом для антиметастатической терапии.

Некоторые активные и селективные ингибиторы урокиназы уже охарактеризованы. Так, например, uPA-ингибиторы бензамидинового типа представлены в ЕР 1098651, uPA-ингибиторы арилгуанидинового типа в WO 01/96286 и в WO 02/14349. Общим признаком этих синтетических ингибиторов является основной остаток, состоящий из амидино- или/и гуанидиногруппы.

Международная заявка WO 03/072559 представляет WX-671 в качестве промежуточного продукта при синтезе ингибитора урокиназы N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-амидинино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид. WO 03/072559 представляет также способ производства соединения WX-671 в виде свободного основания в форме его солей с кислотами. Конкретные соли, в частности кислая сульфатная и сульфатная формы, не упоминаются. Также не приводится описание способов кристаллизации. Изложенным способом получают свободное основание WX-671 в виде аморфного продукта, который склонен к нестабильности и гигроскопичен, а также проявляет плохие свойства в отношении фильтрации и высыхания. По этой причине для производства в больших масштабах он не подходит и должен быть защищен от тепла и влаги.

WO 2004/011449 представляет также способ получения производных фенилаланина, которые могут быть также в форме солей, например солей минеральных кислот или солей органических кислот. В числе полученных соединений называется WX-671. Но здесь нет указания на то, что эти соединения можно получать и в стабильной кристаллической форме.

РСТ/ЕР 2004/005682 заявляет гидроксиаминные и гидроксигуанидиновые соединения в качестве ингибиторов урокиназы. Заявленные лекарственные средства включают в качестве действующего вещества среди других WX-671, а также действующие вещества в виде солей, например в виде гидрохлорида или кислого сульфата или же солей органических кислот. Для заявляемых здесь лекарственных средств подтверждена лучшая биодоступность при оральном применении. Но и эта публикация не раскрывает ни одну сульфатную соль соединения - ингибитора урокиназы.

Целью настоящего изобретения было получение кристаллических модификаций N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и/или его солей, которые обладают преимуществами по отношению к известным из уровня техники соединениям.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к кристаллическим модификациям N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и/или его солей.

В соответствии с настоящим изобретением выявлены новые кристаллические модификации вышеназванного ингибитора урокиназы, которые по отношению к аморфной форме этого соединения проявляют важные преимущества. Соответствующие изобретению кристаллические модификации обладают значительными преимуществами в отношении обращения с ними, хранения и комбинации с другими соединениями.

Неожиданно оказалось, что соединение N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид и/или его соли можно перевести в кристаллическое состояние, что до сих пор было невозможно, а поэтому оно по своим свойствам превосходит известные из уровня техники аморфные соединения. Например, соответствующие изобретению кристаллические модификации обладают очень слабой гигроскопичностью. Они, кроме того, очень устойчивы к распаду и пригодны поэтому и для более продолжительного хранения. Кроме того, соответствующие изобретению кристаллические модификации проявляют улучшенные свойства в отношении фильтрации и высыхания. Более того, кристаллические модификации N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и его солей идеальны для включения в лекарственные препараты.

Используемое здесь сокращение WX-671 означает свободное основание N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида. WX-671.1 означает кислый сульфат названного соединения, а WX-671.2 означает сульфат названного соединения.

Как уже сказано выше, соответствующие изобретению модификации WX-671 и его солей являются в основном кристаллическими. Ранее было невозможно произвести подобные гидроксиамидные соединения в кристаллической форме. И известные уже в уровне техники соединения не обладали способностью к кристаллизации.

Под соответствующими изобретению кристаллическими модификациями N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и его солей здесь понимают в первую очередь кислую сульфатную соль (WX-671.1) и сульфатную соль (WX-671.2), а также свободное основание (WX-671).

Под соответствующими изобретению кристаллическими модификациями можно понимать смеси свободного основания и соли, а также смеси солей. Предпочтительно под соответствующей изобретению модификацией следует понимать находящиеся в кристаллической форме или свободное основание, или сульфатную соль, или кислую сульфатную соль. Особенно предпочтительно под соответствующей изобретению кристаллической модификацией понимать монокристаллы соответствующей кристаллической модификации.

Соответствующие изобретению модификации изучались с помощью рентгеновской диффрактометрии и проявляют главным образом представленные в таблице 3.1 (для сульфатной соли WX-671.2), таблице 7.1 (для кислой сульфатной соли WX-671.1) и таблице 11.1 (для свободного основания) пики. Соответствующие изобретению кристаллические модификации проявляют в основном изображенные на фиг.5 (для сульфатной соли WX-671.2), фиг.13 (для кислой сульфатной соли WX-671.1) и фиг.19 (для свободного основания) пики.

Как показано ниже в примерах, дополнительно к анализам рентгеновской диффрактометрии проводили также термоаналитические исследования (дифференциально сканирующая калориметрия, DSC, и термогравиметрия, TGA). При этом установлено, что кристаллическое соединение кислой сульфатной соли WX-671.1 разлагается при температуре около 175°C-195°C, точнее около 185°С (при скорости нагрева 2 К·мин-1).

Соответствующая изобретению кристаллическая модификация WX-671.2 обнаруживает преимущественно N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид и сульфат-анионы в мольном соотношении 2:1, причем это соотношение может изменяться в интервале от 1,5 до 2,5:1. Предпочтительно соотношение примерно от 1,25 до 2,25:1, особенно предпочтительно от 1,1 до 2,1:1 и наиболее предпочтительно примерно 2:1.

Кристаллическая модификация WX-671.2 обнаруживает обычно структурные единицы, состоящие из 2 молекул N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и одного сульфатного аниона, причем в каждой из этих единиц 2 молекулы N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида могут находиться в одинаковой конформации или же, преимущественно, и в различных конформациях.

Дополнительно кристаллическая модификация WX-671.2 присутствует преимущественно в виде гидрата, в частности тригидрата, т.е. на каждый 1 моль соли приходится примерно 3 моля воды. И это соотношение, естественно, может быть подвержено небольшим колебаниям, т.е. на каждый 1 моль соли может в среднем приходиться от 2,5 до 3,5 молей воды, предпочтительно от 2,25 до 3,25, особенно предпочтительно от 2,2 до 3,2, наиболее предпочтительно от 2,1 до 3,1.

Сульфатная соль N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида проявила себя, независимо от кристалличности, термодинамически стабильным соединением. Поэтому настоящее изобретение заявляет также новое соединение сульфатная соль N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида. И некристаллическая сульфатная соль WX-671.2 пригодна таким же образом, как ниже изложено относительно кристаллических модификаций, для производства лекарственных средств.

В кристаллической модификации WX-671.1 N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид и кислые сульфатные анионы находятся преимущественно в мольном соотношении от 0,5 до 1,5:1, особенно предпочтительно от 0,8 до 1,2:1, еще предпочтительнее от 0,9 до 1,1:1 и еще более предпочтительнее примерно 1:1.

Кристаллическая модификация WX-671.1 может также быть в виде гидрата.

Кристаллическая модификация WX-671.1 (свободное основание) находится преимущественно не в виде гидрата. Гидратная форма, однако, возможна.

Соответствующие изобретению кристаллические модификации при необходимости могут быть применены вместе с пригодными для этого фармацевтическими вспомогательными веществами и носителями для производства лекарственных средств. При этом возможно применение их в комбинации с другими действующими веществами, например другими ингибиторами урокиназы, в частности антителами и/или пептидами, а также с хемотерапевтиками и цитостатиками или/и другими цитостатическими и цитотоксическими действующими веществами.

Соответствующие изобретению кристаллические модификации могут быть представлены поэтому в виде соответствующей лекарственной формы, например в виде таблеток, драже, капсул, пастилок, порошка, сиропа, суспензии, раствора и т.п. В особенности предпочтительна лекарственная форма для орального применения.

Соответствующие изобретению кристаллические модификации пригодны для лечения болезней, которые ассоциированы с патологической сверхэкспрессией uPA или/и рецептора плазминогенного активатора урокиназного типа uPAR. Они, например, в состоянии ингибировать с высокой эффективностью рост злокачественных опухолей, а также метастазирование опухолей. Примерами этого являются такие раковые заболевания, как, например, рак груди, рак легких, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак шейки матки, рак яичника, рак почек, рак простаты и саркома мягких тканей, в особенности с ассоциированными с высокой степенью метастазирования раковыми опухолями.

Соответствующие изобретению модификации могут использоваться в отдельности или в комбинации с другими физиологически активными веществами, например с радиотерапевтиками или с цитотоксичными или/и цитостатическими средствами, как, например, cis-платин, доксорубицин, 5-флюорурацил, производные таксола, или/и прочими хемотерапевтическими агентами, например представителями из группы алкилирующих агентов, антиметаболиков, антибиотиков, эпидофиллотоксинов и барвинковых алкалоидов. Возможно также комбинирование с лучевой терапией или/и хирургическими вмешательствами.

Кроме того, соответствующие изобретению кристаллические модификации эффективны по отношению к ассоциированным с uPA заболеваниям. Примерами таких заболеваний могут быть легочное повышенное кровяное давление и/или сердечные заболевания (например, WO 02/00248), желудочно-кишечные заболевания, как, например, воспалительные кишечные заболевания, предраковая аденома толстой кишки, воспалительные заболевания, в том числе остеопороз, холестеатомия, кожные и глазные заболевания, как, например, возрастная дегенерация макулы (AMD), а также вирусные и бактериальные инфекции, причем особо подчеркиваются названные в ЕР-А-0691350, ЕР-А-1182207 и US 5712291 заболевания.

Следующим объектом настоящего изобретения является лекарственное средство, которое содержит соответствующую изобретению кристаллическую модификацию. Такое лекарственное средство может при необходимости дополнительно содержать фармацевтически совместимые носители и/или вспомогательные вещества. Указанные лекарственные средства для человека или животных можно применять наружно, орально, ректально или парентерально, например внутривенно, подкожно, внутримышечно, внутриперитонально, или же подъязычно, назально и/или ингалятивно. Пригодны для применения лекарственные формы в виде, например, таблеток, драже, капсул, пастил, гранул, порошка, суппозиториев, растворов, сиропа, эмульсий, суспензий, липосом, ингаляционных спреев или трансдермальных систем, как, например, пластырей. Особо предпочтительным лекарственным средством является пригодное для орального применения, в том числе и в медленно действующей форме (Slow-Release-Retard).

Кроме того, изобретение касается применения соответствующих ему кристаллических модификаций для производства фармацевтического средства для лечения болезней, которые ассоциированы с патологической сверхэкспрессией урокиназы и/или с рецептором урокиназы. Такое лекарственное средство с соответствующим изобретению действующим веществом особенно пригодно для лечения и/или профилактики раковых опухолей, а также для лечения или профилактики метастазирования, для лечения первичных и вторичных раковых опухолей.

Благодаря настоящему изобретению появляется возможность ингибирования урокиназы у живых существ, в частности у человека, путем использования эффективной дозы соответствующей изобретению модификации. Величина необходимой дозы зависит от вида и тяжести лечимой болезни. Например, дневная доза находится в интервале 0,01-100 мг/кг действующего вещества в расчете на 1 кг веса тела, более предпочтительно 0,1-50 мг/кг, еще более предпочтительно 0,5-40 мг/кг, намного предпочтительнее 1-30 мг/кг, самое предпочтительное 5-25 мг/кг.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения в основном кристаллической модификации одной из солей N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида, включающий следующие этапы:

(a) получение соединения N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид или одной из его солей;

(b) растворение или/и суспензирование этого соединения или же его соли, полученных на этапе (а) в пригодном для образования кристаллической модификации растворителе;

(c) отделение кристаллической модификации.

Неожиданно выявилось, что кристаллические модификации WX-671, WX-671.1 и WX-671.2 можно легко перевести в кристаллическую форму. Предпочтительно в качестве исходного материала применять соль N-α- (2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида, особенно предпочтительно кислую сульфатная соль.

Могут быть, однако, использованы в качестве исходных соединений для образования кристаллических модификаций и другие солевые соединения, например безилатная соль, гидрохлоридная соль, мезилатная соль, татратная соль и другие.

В качестве растворителя для этапа (b) преимущественно могут быть использованы различные органические растворители. Пригодны, в частности, вода и различные спирты, например метанол, этанол, пропанол, бутанол и их изоформы, как например, изопропанол, изобутанол и т.п. Другими пригодными растворителями являются тетрагидрофуран (THF) и ацетонитрил. Особенно предпочтительны в качестве растворителей, в частности, ацетон и ацетонитрил.

Можно, однако, в качестве растворителя использовать и воду. В частности, для перекристаллизации (см. этап (d)) преимущественно применяется вода.

Если при производстве кристаллической модификации какой-либо нужной соли N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида в качестве исходного материала применяется свободное основание, для ее получения на этапе (b) добавляются соответствующие соли или кислоты N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида.

Соответствующий изобретению способ может также включать дополнительный этап (d) перекристаллизации кристаллического соединения из этапа (с). Особенно это относится к производству WX-671.2 из WX-671.1. При этом обычно получаемая на этапе (с) кристаллическая модификация вновь перекристаллизовывается в пригодном для этого растворителе или в смеси растворителей. Вышеназванные растворители могут использоваться и в этом случае. Особенно предпочтительной является вода или же перекристаллизация с образованием нужной кристаллической модификации обычно осуществляется в присутствии достаточного количества воды. Вода особенно предпочтительна, если, как например, в случае с WX-671.2, образуется гидрат (в случае с WX-671.2 тригидрат).

Подробнее изобретение разъясняется с использованием нижеследующих чертежей и примеров.

Описание чертежей

Фиг.1 показывает Ortep-диаграмму (50%) со схемой обозначений для молекулы А (WX-671.2).

Фиг.2 показывает Ortep-диаграмму (50%) со схемой обозначений для молекулы В (WX-671.2).

Фиг.3 показывает независимые молекулы внутри элементарной ячейки структурной единицы из двух молекул WX-671.2 и сульфат-аниона.

Фиг.4 показывает имитационную рентгенодифрактограмму кристаллизации WX-671.2.

Фиг.5 показывает экспериментальную рентгенодифрактограмму кристаллизации WX-671.2.

Фиг.6а показывает наложение имитационной и экспериментальной рентгенодиффракторамм соответственно фиг.4 и 5 для WX-671.2.

Фиг.6b показывает DSC- и TGA-термограмму WX-671.2 после размешивания в воде.

Фиг.7 содержит данные по кристаллизации и доводке структуры WX-671.2.

Фиг.8 содержит данные по длине связей [Å] и углам [º] для WX-671.2.

Фиг.9 показывает данные по углам кручения [°] для WX-671.2.

Фиг.10 показывает DSC- и TGA-термограмму WX-671.1 (модификация А).

Фиг.11 показывает DSC- и TGA-термограмму пробы (мезофаза В) WX-671.1.

Фиг.12 показывает DSC- и TGA-термограмму мезофазы С у WX-671.1.

Фиг.13 показывает рентгенодиффрактограмму модификации А у WX-671.1.

Фиг.14 показывает рентгенодиффрактограмму мезофазы В у WX-671.1.

Фиг.15 показывает рентгенодиффрактограмму мезофазы С у WX-671.1.

Фиг.16 показывает DSC- и TGA-термограмму аморфного исходного вещества свободного основания WX-671.

Фиг.17 показывает DSC- и TGA-термограмму кристаллизованной в морозильной камере из ацетонитрила пробы свободного основания WX-671.

Фиг.18 показывает микроскопический снимок свободного основания WX-671 после кристаллизации в морозильной камере из ацетонитрила.

Фиг.19 показывает рентгенодиффрактограмму свободного основания WX-671 после кристаллизации в морозильной камере из ацетонитрила.

Фиг.20 показывает сорбционную изотерму водяного пара на свободном основании WX-671 при 22°С.

Осуществление изобретения

ПРИМЕРЫ

Пример

Получение различных солей N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида

Соли получают путем растворения 6,0 г WX-671 в 50 мл ацетона. Применяемые кислоты без разбавления добавляют при 25%-ном избытке и в течение 2 часов перемешивают при комнатной температуре.

Условия кристаллизации

Таблица 1.1 Кислоты Эквиваленты Условия кристаллизации Сушка НСl 1,25 моль экв. Осветленный раствор Глубокий вакуум H2SO 1,25 моль экв. Кристаллизация из раствора ацетона Глубокий вакуум MsOH 1,25 моль экв. Кристаллизация из раствора ацетона Глубокий вакуум BsOH 1,25 моль экв. Осветленный раствор Глубокий вакуум Винная кислота 1,2 5 моль экв. Осветленный раствор Глубокий вакуум MsOH: метансульфоновая кислота; BsOH: бензолсульфоновая кислота

На втором этапе соли в течение 7 суток суспензируют в соответствующем растворе, фильтруют и высушивают при комнатной температуре.

Изучение кристалличности

Способ: рентгенодиффрактометрия (XRD)

Таблица 1.2 Соединения XRD Микроскопия Свободное основание В основном кристаллическое Мелкие частицы Безулат В основном аморфное Агломераты Гидрохлорид Полностью аморфное Мелкие частицы Мезулат Жидкокристаллическое Агломераты Гидрогенсульфат Жидкокристаллическое Агломераты Тартрат Полностью аморфное Стекло

Изучение гигроскопичности

Способ: хранение в течение 1 недели при относительной влажности 85%; термогравиметрический анализ (TGA)

Таблица 1.3 Соединения TGA Свободное основание 1,5% (полугидрат) Безулат (адсорбированный) Гидрохлорид (адсорбированный) Мезулат (адсорбированный) Гидрогенсульфат (адсорбированный) Тартрат (адсорбированный)

Пример 2

Монокристалльный рентгеноструктурный анализ WX-671.2 (сульфатная соль)

Новую форму сульфата N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида получают путем суспензирования кислой сульфатной соли (WX-671.1) соединения WX-671 в воде и отделения образующегося кристаллического соединения.

Кристаллический WX-671.2 получают двумя разными способами.

а) Примерно 50 мг WX-671.1 суспендируют в примерно 0,5 мл воды. Суспензию оставляют при комнатной температуре. Через 6 суток суспензию фильтруют и остаток высушивают при комнатной температуре на воздухе.

b) Примерно 0,2 г WX-671.1 суспендируют примерно в 2 мл воды. Суспензию взбалтывают при температуре 25°С. Через 3 суток остаток отфильтровывают и кристаллы WX-671.2 высушивают при комнатной температуре на воздухе.

Произведенный таким образом кристаллический материал (WX-671.2) подвергают рентгеноструктурному анализу. При этом получают также монокристаллы.

Определение структуры кристаллов проводят с использованием диффрактометра Bruker-Nonius, оборудованного плоскостным детектором Proteum-CCD, вращающимся анодом FR591 с CuКα-излучением, зеркалом Montel в качестве монохроматора и низкотемпературным прибором «Криофлекс» (Т=90К). Полносферное отображение информации omega и phi сканирований. Применяемые программы: «Сбор данных» Proteum V.I.37 (Bruker-Nonius 2002), «Уплотнение данных» Saint+Version 6.22 (Bruker-Nonius 2001), «Коррекция абсорбции» SADABS V.2.03 (2002). Определение структуры кристаллов проводилось с помощью прямых методов в соответствии с SHELXTL Version 6.10 (Sheldrick, Гёттингенский университет) и отображалось с помощью ХР-программы.

Путем дифференциального синтеза Фурье отсутствующие атомы локализовались и добавлялись в список атомов. «Оптимизация наименьших квадратов» на F2 по всем измеренным интенсивностям проводилась с использованием программы SHELXTL Version 6.10 (Sheldrick, Гёттингенский университет, 2000). Все неводородные атомы оптимизировались с использованием «коэффициентов анизотропного смещения».

Таблица 2.1 Определение хиральности* Истинная структура Инвертированная структура Flack-коэффициент (стандартное отклонение) 0,0298 (0,0282) 0,9694 (0.0307) Twin Basf (стандартное отклонение) 0,03 (3) 0,97 (3) wR2-значение (с Flack-коэффициентом) 0,2016 0,2219 Хиральность S(C9) R(C9) *
Н.D.Flack, Ada Cryst, 1983, A39, 876-881.
H.D.Flack, G.Bernardineili, Acta Cryst, 1999, A55, 908-915.
Н.D.Flack, G.Bernardinelli, J. Appl. Cryst, 2000, 33, 1143-1148.

Результаты рентгеноструктурного анализа представлены на фиг.1-3 и 7-9.

Пример 3

Рентгенодиффрактометрия WX-671.2 (сульфатная соль)

Рентгенодиффрактораммы получены с помощью Debye-Scherrer - диффрактометра STOE STADI-P, оборудованного позиционно-чувствительным детектором (PSD, 5°), Germanium [1 1 1] - primär - монохроматором и CuKα 1,6 кВт - керамической рентгеновской трубкой (1,5406 Å). Применяли программу: Stoe WinXpow, Version 2.03 (2003).

Таблица 3.1
Список пиков рентгенодиффрактометрии для WX-671.2
WX-671.2 Рефлексы 2 Theta Рефлексы 2 Theta 3,7 26,8 4,2 27,2 7,1 27,5 7,4 27,8 10,3 28,1 10,8 29,1 11,1 29,7 11,6 30,2 12,1 30,6 12,6 31,1 13,3 31,4 13,8 31,9 14,2 32,1 14,8 33,2 15,1 33,8 15,7 34,2 16,4 36,3 16,8 37,3 17,3 17,8 18,0 18,6 19,2 19,8 20,1 20,4 20,8 21,0 21,2 21,8 22,2 22,9 23,4 23,9 24,6 25,0 25,5 26,2 26,3 26,5

Пример 4

Перекристаллизация WX-671.1 (кислая сульфатная соль)

WX-671.1 растворяли в растворителях (изопропанол, этанол, матанол) различной полярности. Растворы фильтровали, разбавляли вчетверо и с различной скоростью удаляли растворитель.

WX-671.1 существует в своей кристаллической форме (модификация А) и двух метафазах В и С. Она разлагается при температурах выше примерно 185°С (модификация А и мезофаза В) или 156°С (мезофаза С). Для выявления кристалличности модификации А проводится рентгеноструктурный анализ. Модификация А при комнатной температуре является термодинамически стабильной формой.

Пример 5

Дифференциально сканирующая калориметрия (DSC) и термогравиметрия (TGA) WX-671.1 (кислая сульфатная соль)

В этом примере получены термограммы с помощью дифференциально сканирующей калориметрии (DSC) и термогравиметрии (TGA). Фиг.10 показывает DSC- и TGA-термограмму подвергавшейся при 25°С в течение одной недели перемешиванию в изопропаноле WX-671.1 (WX-671.1 (модификация А)). Она разлагается при температурах выше примерно 185°С (экзотермный пик в DSC- термограмме, потеря массы в TGA-термограмме в соответствующем температурном интервале). Температуры распада сильно зависят от скорости нагрева и определяли их в DSC-калориметре при скорости нагрева 2 К·мин-1. Отображенные наглядные результаты DSC регистрировались при скорости нагрева 2 К·мин-1. Разложение соответственно регистрируется при более высоких температурах.

При 150°С не регистрируется какой-либо существенной потери массы. Слабо выраженный эндотермный эффект перед пиком разложения мог быть вызван частичным расплавлением или частичным превращением.

Фиг.11 показывает DSC- термограмму одной использованной для этого скрининга пробы WX-671.1 (мезофаза В). Модификация А и мезофаза В термоаналитически идентичны. Мезофаза А была получена из изопропанола (комнатная температура/холодильная камера) и этанола (комнатная температура).

Фиг.12 показывает DSC- и TGA-термограмму действующего вещества, полученного в опыте по кристаллизации из этанола при комнатной температуре (мезофаза С). Оно разлагается при температурах выше примерно 156°С (скорость нагрева 2 К·мин-1). При нагреве до 175°С отмечали потерю массы в размере 4,5%. В DSC-термограмме эндотермный эффект перед пиком разложения отсутствует. Эта форма имеет менее упорядоченное состояние по сравнению с модификацией А и мезофазой В. Она была получена в опытах по кристаллизации из метанола (комнатная температура, холодильная камера) и этаноле (холодильная камера). У этих проб отмечали потерю массы от 4,5 до 4,8 мас.%. Стохеометрический показатель для потери массы 2 молекул воды в расчете на одну молекулу действующего вещества составляет 4,7%. В случае данной формы речь идет, однако, не о гидрате.

Пример 6

Термомикроскопия WX-67L1 (кислая сульфатная соль)

По одной из проб WX-67L1 производились термомикроскопические снимки (не представлены). Наблюдали наличие агломератов, не имевших специфического габитуса. Действующее вещество разлагается с образованием пузырей при температурах выше примерно 197°С. Различия по отношению к отмеченной в DSC-калориметре температуре обусловлены различными скоростями нагрева. В растворителях образуется WX-671.1 неспецифической формы. Действующее вещество обнаруживает частично двойное преломление, что характерно для кристаллических и мезоморфных веществ.

Пример 7

Рентгенодиффрактометрия WX-671.1 (кислая сульфатная соль)

В рентгенодифрактограмме модификации А (фиг.13) видно характерное для кристаллических фаз распределение многочисленных острых пиков при более значительных 2-Theta-углах. Для подтверждения существования кристаллической фазы проводятся дополнительные исследования, например рентгеноструктурный анализ.

В рентгенодиффрактограмме мезофазы В (фиг.14) обнаружены острый пик при 2-Theta-угле около 5° и другие рефлексы меньшей интенсивности в интервале между примерно 8° и примерно 25°. Местоположение и число пиков аналогичны таковым у модификации А. Проявляющийся при малом 2-Theta-угле пик указывает на наличие дальнего порядка молекул, пики с меньшей интенсивностью доказывают наличие ближнего порядка. Из этого можно заключить, что мезофаза В представлена ни в кристаллической, ни в аморфной формах, а вероятно в качестве мезофазы.

Рентгенограмма мезофазы С (фиг.15) также демонстрирует характерное для мезоморфных соединений распределение: интенсивный пик при малом 2-Theta-угле. Рентгенограмма показывает, что мезофаза С не является кристаллической фазой и из-за имеющегося дальнего порядка молекул не может быть отнесена к аморфной фазе. Сравнение с рентгенодифрактограммой мезофазы В показывает, что мезофаза С, вероятно, представляет собой фазу с меньшей степенью порядка. Свидетельством этого являются сильнее выраженные и более интенсивные рефлексы между 2-Theta-углами примерно 8° и примерно 25°.

В результате однонедельного перемешивания в изопропаноле при комнатной температуре мезофаза В превращается в модификацию А. В результате перемешивания в воде : этаноле (1:1) она не изменяется. Под воздействием механического стресса (толчение, прессование под давлением 9 кбар) превращения ее также не происходит.

Таблица 7.1
Список пиков рентгенодифрактометрии для модификации WX-671.1 (кислая сульфатная соль)
WX-671.1 Рефлексы 2-Theta 4,3 8,6 10,1 10,3 10,6 11,0 11,2 11,3 11,6 12,0 12,3 13,8 14,8 15,9 17,5 17,7 19,3 19,7 20,2 21,0 21,4 21,7 21,9 22,6 23,3 24,0 25,8 26,9 27,4 28,0 29,7 30,8 31,3 32,2 33,3 35,5 37,1

Пример 8

Перекристаллизация WX-671 (свободное основание)

Действующее вещество WX-671 исследуется на полиморфию термоаналитически (DSC, TGA), с помощью рентгенодиффрактометрии, а также путем кристаллизации из органических растворителей. WX-671 кристаллизуется в одной из модификаций (модификация А). Действующее вещество обнаруживает очень слабую тенденцию к кристаллизации.

Модификация А является при комнатной температуре термодинамически стабильной формой. Окончательная оценка полиморфии и псевдополиморфии WX-671 возможна лишь после проведения исследования по полиморфии.

WX-671 растворяли в растворителях (тетрагидрофуран, ацетонитрил, метанол) различной полярности. Растворы фильтровали, разбавляли вчетверо и с различной скоростью кристаллизовали действующее вещество. После сушки при комнатной температуре регистрировали термограммы (DSC, TGA) и рентгенодиффрактограммы.

Использовавшееся для скрининга полиморфии исходное вещество удалось получить в преимущественно кристаллической форме. Кристаллизация удалась из ацетонитрила в морозильной камере при примерно -18°С.

Пример 9

Дифференциально сканирующая калориметрия (DSC) и термогравиметрия (TGA) WX-671 (свободное основание)

Фиг.16 показывает DSC- и TGA-термограмму аморфного исходного вещества. Так же, как и DSC- /TGA-термограммы большинства остальных исследованных проб, она демонстрирует термический эффект в интервале между 45°С и 85°С. В рамках скрининга полиморфии этот термический эффект не проявился. При этом речь могла идти о превращении стекла. На основании этого можно говорить о кристаллической форме с точкой плавления около 190°С. Это вещество разлагается в зависимости от скорости нагрева при температурах выше примерно 155°С. По этой причине точку плавления кристаллической пробы (GBA 190903-8с) определить нельзя. Термограммы аморфного и кристаллического вещества поэтому в значительной степени идентичны (фиг.16 и 17).

Пример 10

Микроскопия WX-671 (свободное основание)

Из ацетонитрила WX-671 кристаллизуется в морозильной камере в форме призм (фиг.18). Из других растворителей действующее вещество не кристаллизуется или же только в незначительной степени, из расплава оно не кристаллизуется.

Пример 11

Рентгенодиффрактометрия WX-671 (свободное основание)

Фиг.19 показывает рентгенодиффрактограмму действующего вещества после кристаллизации из ацетонитрила в морозильной камере (модификация А).

Таблица 11.1
Список пиков рентгенодиффрактометрии для WX-671 (свободное основание)
Проба была кристаллизована из ацетонитрила в морозильной камере.
WX-671 Рефлексы 2 Theta 3,2 5,5 6,4 8,5 9,7 10,2 10,7 11,2 11,5 11,7 12,1 13,4 13,8 14,1 14,6 14,8 15,5 16,5 18,1 19,1 19,7 20,5 20,7 21,3 22,4 22,7 23,6 26,5

Пример 12

Гигроскопичность WX-671 (свободное основание)

Фиг.20 показывает изотерму сорбции водяного пара WX-671 при 22°С. Относительная влажность непрерывно поглощающего воду аморфного действующего вещества возрастает от 0% до 95%. При сушке поглощенная вода удаляется. В большинстве точек изотермы равновесное состояние в течение соответствующего времени выдержки достигнуто не было. Вес пробы возрастал или уменьшался. В данном опыте не проявилось свидетельств образования гидрата.

Пример 13

Устойчивость WX-671 (свободное основание)

В результате однонедельного перемешивания в диизопропиловом эфире и в этаноле/воде (1:1) при комнатной температуре действующее вещество не кристаллизуется в модификацию или кристаллизуется в очень слабой степени. Оно не превращается ни в какую другую полиморфную форму. Под воздействием механических стрессов (толчение, прессование под давлением 9 кбар) оно также не подвергается превращению, лишь в еще большей степени уменьшается кристалличность.

Похожие патенты RU2388754C2

название год авторы номер документа
СТОЙКАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА ИЗ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНИЛАЛАНИНА 2005
  • Шмаликс Вольфганг
  • Бюргле Маркус
  • Кох Клаус
RU2358736C2
СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОИЗВОДНЫХ 3-ГИДРОКСИАМИДИНОФЕНИЛАЛАНИНА ПУТЕМ ОСАЖДЕНИЯ И ПЕРЕКРИСТАЛЛИЗАЦИИ СОЛИ АРОМАТИЧЕСКОЙ СУЛЬФОНОВОЙ КИСЛОТОЙ 2005
  • Грайвинг Хельмут
RU2391336C2
СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ АНГИОГЕНЕЗА С ПОМОЩЬЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ УРОКИНАЗЫ 2012
  • Акопян Жанна Алексеевна
  • Белоглазова Ирина Борисовна
  • Калинина Наталья Игоревна
  • Плеханова Ольга Сергеевна
  • Стамбольский Дмитрий Викторович
  • Тарасова Елена Владимировна
  • Ткачук Всеволод Арсеньевич
RU2528249C2
ТВЕРДЫЕ ФОРМЫ РОМИДЕПСИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2011
  • Вролийк Николас
  • Ханко Джейсон
  • Энджерс Дэвид Алан
  • Хэйджен Эрик
  • Смоленская Валерия
  • Сталтс Джеффри Скотт
  • Нарингрекар Виджай Харишчандра
  • Пейков Виктор Цатчев
  • Фосс Виллард Родни
  • Дарлинг Нил Лоуренс
RU2607634C2
КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ СОЛИ И ПОЛИМОРФЫ АНТАГОНИСТА P2X3 2017
  • Ибрахим, Прабха
  • Хоули, Рональд Чарльз
  • Форд, Энтони, П.
  • Смит, Стивен, А.
RU2782068C2
КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА ТРИЦИКЛИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ 2019
  • Ван, Цзин
  • Цзян, Чжигань
  • Хэ, Хайин
  • Ян, Ясюнь
RU2775753C1
КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА И СПОСОБ ЕЕ ОЧИСТКИ 2011
  • Беляев Александр
  • Лермонт Дэвид Александер
  • Бродбелт Брайан
  • Альберт Екатерина
  • Андрес Патрисия
RU2604734C2
ОСНОВНОЙ КАРБОНАТ АЛЮМИНИЯ МАГНИЯ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПОВЫШЕННОЙ ЖЕЛУДОЧНОЙ КИСЛОТНОСТИ 1998
  • Губерт Сантьяго
  • Кастелло Хосеп М.
  • Ортис Хосе А.
  • Сакристан Аурелио
  • Фогет Рафаэль
RU2168464C1
КРИСТАЛЛЫ ЛОБАПЛАТИНА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ В ФАРМАЦЕВТИКЕ 2014
  • Доу Цилин
  • Суй Дунху
  • Чжан Шэнгуй
RU2648990C1
КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА НАТРИЕВОЙ СОЛИ 4-ТРЕТ-БУТИЛ-N-{ 4-ХЛОР-2-(1-ОКСИ-ПИРИДИН-4-КАРБОНИЛ)-ФЕНИЛ} -БЕНЗОЛСУЛЬФОНАМИД 2012
  • Пеннелл Андреу М.К.
  • Унгаше Соломон
RU2607515C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 388 754 C2

Реферат патента 2010 года КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ N-α-(2,4,6-ТРИИЗОПРОПИЛФЕНИЛСУЛЬФОНИЛ)-3-ГИДРОКСИАМИДИНО-(L)-ФЕНИЛАЛАНИН-4-ЭТОКСИКАРБОНИЛПИПЕРАЗИДА И/ИЛИ ЕГО СОЛЕЙ

Изобретение относится к новым кристаллическим модификациям N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и/или его солей. Такие кристаллические модификации обладают повышенной устойчивостью, в частности пониженной гигроскопичностью, по сравнению с известными аморфными формами соединения. Изобретение также относится к способу получения таких новых кристаллических модификаций, к содержащим эти новые кристаллические модификации фармацевтическим составам и их применению в качестве противоопухолевого средства. 4 н. и 22 з.п. ф-лы, 7 табл. 20 ил.

Формула изобретения RU 2 388 754 C2

1. Кристаллическая модификация N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и/или его соли, которая включает кристаллическую модификацию сульфата N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и при рентгенодифрактометрическом анализе обнаруживает в основном следующие пики:
3,7
10,3
12,1
13,8
16,4
19,2
22,2 или
кристаллическую модификацию кислого сульфата N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и при рентгенодифрактометрическом анализе обнаруживает в основном следующие пики:
4,3
10,1
20,2
21,4
24,0 или
кристаллическую модификацию N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида в виде свободного основания и при рентгенодифрактометрическом анализе обнаруживает в основном следующие пики:
3,2
6,4
10,2
19,7.

2. Кристаллическая модификация по п.1, которая включает сульфат N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида в виде монокристалла.

3. Кристаллическая модификации сульфата N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида по любому из пп.1 и 2, которая при рентгенодифрактометрическом анализе обнаруживает в основном отображенные на фиг.5 пики.

4. Кристаллическая модификация по п.1, которая включает кислый сульфат N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида в форме монокристалла.

5. Кристаллическая модификация кислого сульфата N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида по п.1 или 4, которая при рентгенодифрактометрическом анализе обнаруживает в основном отображенные на фиг.13 пики.

6. Кристаллическая модификация кислого сульфата N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида по п.1, которая разлагается при температурах выше 175-195°С (DSC, скорость нагрева 2 К·мин-1).

7. Кристаллическая модификация по п.1, которая представляет собой кристаллическую модификацию N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида в виде свободного основания в форме монокристалла.

8. Кристаллическая модификация N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида в качестве свободного основания по п.1 или 7, которая при рентгенодифрактометрическом анализе обнаруживает в основном отображенные на фиг.19 пики.

9. Кристаллическая модификация по п.1, которая содержит N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид и сульфатные анионы при мольном соотношении 1,5-2,5:1.

10. Кристаллическая модификация по п.9, которая содержит N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид и сульфатные анионы при мольном соотношении 2:1.

11. Кристаллическая модификация по п.1, которая содержит N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид и кислые сульфатные анионы при мольном соотношении от 0,5 до 1,5:1.

12. Кристаллическая модификация по п.11, которая содержит N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид и кислые сульфатные анионы при мольном соотношении 1:1.

13. Кристаллическая модификация по п.1, которая включает структурные единицы, состоящие примерно из двух молекул N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и одного сульфатного аниона.

14. Кристаллическая модификация по п.13, в которой эти две молекулы N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида в структурной единице представлены в различных конформациях.

15. Кристаллическая модификация по п.1, в которой на каждый моль соли приходится примерно три моля воды.

16. Способ производства кристаллической модификации молекулы N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и/или его соли по п.1, состоящий из этапов
(a) приготовление соединения N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазид или одной из его солей,
(b) растворение и/или суспендирование этих же соединений или соли из этапа а) в пригодном для образования кристаллической модификации растворителе,
(c) отделение кристаллической модификации.

17. Способ по п.16, включающий дополнительный этап:
(d) перекристаллизация кристаллической модификации с этапа (с) из пригодных для этой цели растворителя или смеси растворителей.

18. Способ по п.16 или 17, при котором на этапе (а) приготовляется кислый сульфат N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида.

19. Лекарственное средство, обладающее ингибирующей активностью по отношению к урокиназе и/или рецептору урокиназы, содержащее в качестве действующего вещества кристаллическую модификацию по любому из пп.1-15, при необходимости, с фармацевтически совместимым носителем или/и вспомогательным веществом.

20. Лекарственное средство по п.19, отличающееся тем, что является орально, назально, ингаляторно, ректально или/и парентерально применяемым средством.

21. Применение кристаллической модификации кислого сульфата N-α-(2,4,6-триизопропилфенилсульфонил)-3-гидроксиамидино-(L)-фенилаланин-4-этоксикарбонилпиперазида и/или его соли по п.1 для производства фармацевтического средства для борьбы с болезнями, которые ассоциированы с патологической сверхэкспрессией урокиназы и/или рецептора урокиназы.

22. Применение по п.21 для лечения и/или профилактики раковых опухолей.

23. Применение по п.21 для лечения или профилактики метастазирования.

24. Применение по п.21 для лечения первичных раковых опухолей.

25. Применение по пп.21-24 для производства орально применяемого средства.

26. Применение по п.25 для производства средства в форме таблеток, драже, капсул, гранул, порошка, суппозиториев, растворов, сиропа, эмульсий, липосом или/и суспензий.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2010 года RU2388754C2

WO 03072559 А, 04.09.2003
US 2004110831 A1, 10.06.2004
WO 2004067522 A, 12.08.2004
WO 2004011449 A, 05.02.2004
УСТРОЙСТВО для ОБРАЗОВАНИЯ 0
SU261990A1
WO 9507902, 15.09.1993
КРИСТАЛЛИЧЕСКИЙ ТРИГИДРОХЛОРИД ДЕОКСИСПЕРГУАЛИНА В β-ФОРМЕ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 1990
  • Катсусиге Икаи Макото Моригути Есихиса Умеда Икуносин Като Тетсуси Саино
RU2171811C2
WO 9505390 A1, 19.08.1993.

RU 2 388 754 C2

Авторы

Груненберг Альфонс

Ленц Джана

Даты

2010-05-10Публикация

2005-11-24Подача