ШТАММ БАКТЕРИЙ BRUCELLA ABORTUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K39/10 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Brucella abortus, используемый для определения иммуногенной активности вакцин против бруцеллеза сельскохозяйственных животных.

Эффективность специфической профилактики бруцеллеза животных и человека зависит от качества применяемых для профилактики заболевания противобруцеллезных вакцин и, в первую очередь, их специфической эффективности. Показателем специфической эффективности противобруцеллезных вакцин является иммуногенная активность или иммуногенность препаратов, определяемая в тесте активной защиты иммунизированных лабораторных животных (морские свинки, линейные мыши) от заражения культурами бруцелл вирулентных штаммов. Иммунными считают тех животных, у которых при бактериологическом исследовании лимфатических узлов и органов не выделяются бруцеллы вирулентного штамма, либо их выделяют значительно меньше, чем у зараженных невакцинированных (контрольных) животных.

Известен штамм Brucella abortus 54М/ВГНКИ, используемый для определения иммуногенной активности вакцин против бруцеллеза сельскохозяйственных животных.

Для штамма характерны основные свойства, присущие штаммам бруцелл, но он обладает отличительной особенностью - высокой вирулентностью для животных и человека (1).

Однако штамм Brucella abortus 54 М/ВГНКИ имеет ряд существенных недостатков.

Во-первых, он является опасным для людей и животных. В связи с этим, проверка иммуногенной активности каждой серии препаратов с использованием данного штамма заменена выборочным контролем только 2-3 серий вакцин в условиях специализированных учреждений, имеющих разрешение на работу с микроорганизмами второй группы, что не всегда обеспечивает высокую достоверность получаемых результатов и объективную оценку эффективности препаратов.

Во-вторых, иммуногенность живых противобруцеллезных вакцин проверяют до наступления стерильного иммунитета, то есть в отдельных органах и тканях иммунизированных животных к моменту заражения культурой вирулентного штамма циркулируют бруцеллы аттенуированного вакцинного штамма. В связи с этим, на последнем этапе определения иммуногенности (бактериологическом исследовании) в обязательном порядке проводят дифференциацию бруцелл вирулентной культуры от вакцинного штамма, что требует больших затрат времени и небезопасно для человека. Кроме того, не представляется возможным определение уровня инфицированности органов заразившихся животных (количества бруцелл вирулентного штамма на 1 г или 1 мг органа).

Целью настоящего изобретения является получение нового штамма бруцелл, предназначенного для определения иммуногенной активности вакцин против бруцеллеза сельскохозяйственных животных, непатогенного для человека и животных, способного стабильно репродуцироваться на питательных средах, содержащих ингибитор роста бруцелл для вакцинных штаммов и посторонней микрофлоры.

Штамм Brucella abortus получен в результате целенаправленной селекции по культуральным, морфологическим, биохимическим, агглютинабельным, антигенным и иммуногенным свойствам из вакцинного штамма Brucella abortus 104М.

Штамм Brucella abortus депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и имеет регистрационный номер KB 13/100 ДЕП.

Штамм Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

Бруцеллы штамма - короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами, расположенные изолированно, попарно реже в виде коротких цепочек, без спор и капсулы. Размер 1,0-1,2 мкм, шириной 0,5-0,6 мкм.

Культуральные свойства.

Культура штамма хорошо растет в аэробных условиях на плотных и жидких питательных средах: мясо-пептонном печеночном глюкозо-глицериновом агаре (МППГГА), печеночно-мартеновском агаре (ПМА), печеночно-мартеновском arape с переваром Хоттингера (ПМАХ), картофельном агаре с переваром Хоттингера (КАХ), мясо-пептонном печеночном глюкозо-глицериновом бульоне (МППГГБ), печеночном глюкозо-глицериновом бульоне (ПГГБ), а также на этих и других средах, предназначенных для культивирования бруцелл с добавлением 0,001% бис-трифенилангидрокарбинола оксалата.

На МППГГА, МПХА и других плотных питательных средах, предназначенных для культивирования бруцелл (4-5 сутки инкубирования при (37-38^oC) растет в виде круглых, выпуклых, гладких, с четко контурированным краем, прозрачных колоний с диаметром 2,0-2,5 мм. При окрашивании раствором кристаллического фиолетового 1/2000 (по Уайт-Вилсону) 100% колоний окрашивается как S-форма: светло-желтый центр и темно-фиолетовый тонкий ободок. При культивировании на плотных средах, содержащих бис-трифенилангидрокарбинола оксалат колонии зеленого цвета.

На МППГГБ и других жидких питательных средах, предназначенных для культивирования бруцелл на 4-5 сутки инкубирования при 37-38^oC, рост бактерий характеризуется легкой опалесценцией среды и тонким пристеночным кольцом голубоватого цвета.

Биохимические свойства.

Культура штамма растет на дифференциальных питательных средах (на основе МППГГА и других плотных питательных сред), содержащих: фуксин в концентрации 1 : 50000; бис-трифенилангидрокарбинола оксалат в концентрации 1:100000 (маркер); 5 мкг/см³ стрептомицина сульфат и не растет на средах, содержащих: тионин в концентрации 1 : 50000; пенициллин 5 ЕД/см³; эритритол 1 мг/см³.

Не продуцирует H₂S.

Лизируется фагом Тб.

Агглютинабельные свойства.

Культура штамма агглютинируется S-антибруцеллезной сывороткой и не агглютинируется R-антибруцеллезной сывороткой. Штамм обладает типоспецифической агглютинабельностью: агглютинируется А монорецепторной сывороткой до ее титра и не агглютинируется М сывороткой в разведении 1:10.

Антигенные свойства.

При введении морским свинкам в дозе 1•10⁹ микробных клеток и кроликам в дозе 7•10⁹ микробных клеток у животных вырабатываются только S-антитела: агглютинины от 100 до 1000 МЕ/см³ и комплементсвязывающие антитела в титрах от 1:20 до 1:160.

Сыворотка крови животных в разведении 1:10 не дает положительной реакции с R-бруцеллезными антигенами.

Патогенность.

Штамм Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 безвреден. При введении мышам 250 млн. микробных клеток и морским свинкам 2 млрд. микробных клеток не вызывает патологоанатомических изменений, характерных для бруцеллеза. Бруцеллы штамма не мигрируют от вакцинированных животных к интактным.

При совместном содержании в течение 90 дней интактных морских свинок с животными, которым вводят культуру штамма Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 в дозе 2 млрд. микробных клеток, при последующем бактериологическом исследовании из лимфатических узлов и внутренних органов невакцинированных животных (10 объектов) бруцеллы штамма KB 13/100 не выделяются.

Вирулентность
При внутрибрюшинном введении культуры штамма мышам линии C₅₇Блек/6 и убое животных с последующим бактериологическим исследованием селезенки ИД₅₀ штамма KB 13/100 составляет 250-1000 микробных клеток (p=0,05).

Стабильность основных свойств штамма при пассировании.

Штамм стабилен в отношении основных свойств на протяжении 10 пассажей на плотных и жидких питательных средах и 5 пассажей на морских свинках (срок наблюдения).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Определяют возможность использования контрольного штамма Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 для контроля иммуногенной активности живой противобруцеллезной вакцины из штамма B. abortus 19 (эталонная серия N6, с заведомо известной высокой иммуногенностью для сельскохозяйственных животных, многократно проверенной в опыте на линейных мышах.

Мышей линии C₅₇Блек/6 самок 5-6-недельного возраста иммунизируют вакциной из штамма 19 в дозах 100, 1000, 10000 и 100000 микробных клеток. Вакцину вводят под кожу в объеме 0,2 см³. Через 15 дней после иммунизации животным вводят культуру штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 в дозах от 25, 125, 625, 3125, 15625, 78125 и 390625 микробных клеток (по шесть иммунизированных мышей на одну дозу). Одновременно культуру штамма вводят 24 невакцинированным мышам в дозах 25, 125, 625, 3125 микробных клеток.

Спустя 10-12 дней мышей убивают и проводят бактериологическое исследование селезенки. Селезенку растирают в гомогенизаторе и высевают на мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар, содержащий 0,001% бис-трифенил-ангидрокарбинола оксалата. Посевы инкубируют при 37-38^oC в течение 4-5 суток и учитывают наличие колоний бруцелл контрольного штамма. Результаты бактериологического исследования приведены в таблице 1.

Данные таблицы 1 говорят, что скорость элиминации бруцелл контрольного вакцинного штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 возрастает с увеличением дозы вакцины и уменьшается с увеличением его дозы, тем самым подтверждая возможность его использования для количественной оценки иммуногенной активности противобруцеллезных вакцин по показателям ИмД₅₀ (50%-ной иммунизирующей дозе) и индексу иммунитета (отношению 50%-ной инфицирующей дозы для иммунизированных мышей к таковой для контроля).

Исходя из представленных в таблице 1 результатов рассчитывают по Керберу ИмД₅₀ вакцины и индекс иммунитета.

Для группы мышей, которым вводят контрольный штамм B. abortus ВГНКИ N КВ13/100 в дозе 15625 микробных клеток ИмД₅₀ вакцины из штамма 19, равняется 10^2,50(316) микробных клеток. ИД₅₀ для мышей, иммунизированных в дозе 100 микробных клеток, равняется 10^4,09 микробных клеток, а для контрольных - 10^2,11. Индекс иммунитета 10^1,98.

Пример 2.

В опыте на мышах определяют иммуногенную активность вакцины из штамма B. abortus 19 по скорости элиминации бруцелл штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100, рассчитывая показатель ИмД₅₀, как это отражено в Примере 1.

Мышей линии C₅₇Блек/6 самок 5-6-недельного возраста иммунизируют вакциной из штамма 19 (эталонная серия 6 с заведомо известной иммуногенностью: 90% для морских свинок и 70-80% для крупного рогатого скота) в дозах 100, 1000, 10000 и 100000 микробных клеток (по шесть мышей на каждую дозу). Вакцину вводят под кожу в объеме 0,2 см³. Через 15 дней после иммунизации животным вводят культуру контрольного штамма B. abortus KB 13/100 в дозе 15625 микробных клеток. Одновременно культуру контрольного штамма вводят 6 невакцинированным мышам. Далее как в Примере 1. Опыт повторяют пять раз. Результаты определения иммуногенной активности вакцины приведены в таблице 2.

По результатам проведенных исследований значения ИмД₅₀ для вакцины из штамма 19, определенные в разных опытах, достоверно (р=0,05) не различаются и находятся в пределах 10^1,73-10^3,18 микробных клеток. Полученные результаты подтверждают высокую воспроизводимость определения иммуногенной активности вакцин с использованием штамма Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100.

Пример 3.

Устанавливают чувствительность определения иммуногенной активности вакцин с использованием штамма Brucella abortus ВГНКИ N KB 13/100 и его корреляцию с известным способом определения иммуногенной активности противобруцеллезных вакцин по устойчивости к заражению культурой бруцелл известным штаммом B. abortus 54М/ВГНКИ.

Иммуногенную активность трех противобруцеллезных вакцин с заведомо разной иммуногенностью определяют аналогично, как в Примере 2 и в тесте активной защиты от заражения культурой вирулентного штамма B. abortus 54М/ВГНКИ на равном поголовье мышей. Рассчитывают по Керберу ИмД₅₀ для трех вакцин.

Результаты приведены в таблице 3.

В результате проведенных исследований установлена высокая чувствительность предлагаемого способа и высокая степень корреляции с известным способом.

Пример 4.

Определяют иммуногенную активность живой вакцины из штамма B. abortus 19 в опыте на морских свинках.

В опыт берут 15 морских свинок массой 350-400 г. Животных иммунизируют вакциной из штамма B. abortus 19 в дозе 1•10⁹ микробных клеток. Вакцину вводят в объеме 1 см³ под кожу в область паха. Через 90 дней всем иммунизированным и 15 контрольным (невакцинированным) животным вводят культуру контрольного штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 в дозе 1,5•10⁵ микробных клеток в объеме 1 см³ под кожу в область паха. Спустя 30-32 дня животных убивают и проводят бактериологическое исследование лимфатических узлов, печени, селезенки и костного мозга (всего 10 объектов). Патматериал высевают пипетками Пастера в пробирку с мясо-пептонным печеночным глюкозо-глицериновым бульоном, которым засевают две пробирки с МППГГА, содержащим бис-трифенилангидрокарбинол оксалат в концентрации 0,01%. Посевы инкубируют при 37-38^oC в течение 5-7 дней. Учитывают наличие культур бруцелл контрольного штамма. Иммунными считают животных, из органов и лимфатических узлов которых не выделена культура контрольного штамма. Показателем иммуногенности служит отношение количества освободившихся от бруцелл контрольного штамма морских свинок к количеству животных в группе, выраженное в процентах. В качестве дополнительного показателя используют индекс инфицированности - отношение количества лимфоузлов и внутренних органов, из которых выделена культура контрольного штамма, к общему количеству исследованных объектов, умноженное на 100.

В результате проведенных бактериологических исследований устанавливают, что вакцина из штамма B. abortus 19 защищает 86,7% иммунизированных животных. Индекс инфицированности составляет 3,33.

Пример 5.

Определяют иммуногенную активность противобруцеллезных вакцин по скорости элиминации бруцелл штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 и с заражением вакцинированных морских свинок культурой известного контрольного штамма B. abortus 54 М/ВГНКИ, в опыте на морских свинках.

Определяют иммуногенную активность живых вакцин из штаммов B. abortus 19 и 82 и экспериментальных адъювант-вакцин N1, N2, N3 из убитых бруцелл.

Морских свинок (по 26 - 30 голов в группе) иммунизируют вакцинами в принятых дозах. Спустя 90 дней после иммунизации половину животных из каждой группы заражают стандартной культурой известного контрольного штамма B. abortus 54М/ВГНКИ в дозе 100 микробных клеток (20 ИД₅₀) и оставшимся свинкам вводят культуру предложенного контрольного штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 в дозе 1,5•10⁵ микробных клеток. Культуры контрольных штаммов вводят под кожу в область паха в объеме 1 см³. Через 30-35 дней животных убивают и проводят бактериологическое исследование лимфатических узлов и внутренних органов (по Примеру 4). Патматериал от морских свинок, зараженных штаммом B. abortus 54М/ВГНКИ, высевают в пробирки с МППГГБ и МППГГА. Выделенные культуры дифференцируют по чувствительности к пенициллину.

Результаты исследований приведены в таблице 4.

В результате проведенных исследований установлена высокая чувствительность определения иммуногенности вакцин по скорости элиминации бруцелл штамма B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 и корреляция получаемых результатов с таковыми при заражении подопытных животных культурой вирулентного штамма B. abortus 54М/ВГНКИ.

Таким образом, предлагаемый контрольный штамм B. abortus ВГНКИ N KB 13/100 позволяет обезопасить контроль эффективности препаратов, увеличить количество проверяемых серий, значительно повысить качество вакцин и за счет этого существенно повысить эффективность специфической профилактики бруцеллеза.

Изобретение предназначено для контроля биопрепаратов против бруццеллеза сельскохозяйственных животных. Новый штамм Brucella abortus способен стабильно репродуцироваться на питательных средах, содержащих ингибитор роста бруцелл вакцинных штаммов и посторонней микрофлоры. В качестве ингибитора роста используют бис-трифенилангидрокарбинол оксалат в концентрации 0,001%. Штамм непатогенен для животных и человека. Штамм Brucella abortus депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и имеет регистрационный номер КВ 13/100-ДЕП. Иммуногенную активность противобруцеллезных вакцин определяют по скорости элиминации из организма имммунизированных животных бруцелл контрольного штамма B. abortus ВГНКИ КВ 13/100-ДЕП. Иммунизируют лабораторных животных (мышей, морских свинок) противобруцеллезной вакциной. Затем иммунизированным животным вводят культуру контрольного штамма B. abortus ВГНКИ КВ 13/100. Животных забивают. Проводят бактериологические исследования лимфатических узлов и внутренних органов. Для этого высевают патматериал на питательные среды с бис-трифенилангидрокарбинол оксалатом в концентрации 0,01%. Иммунными считают животных, из организма которых полностью элиминировались бруцеллы контрольного штамма за определенный период времени. Использование контрольного вакцинного штамма Brucella abortus ВГНКИ КВ 13/100 позволяет обезопасить контроль эффективности биопрепаратов, увеличить количество проверяемых серий, значительно повысить качество вакцин и за счет этого существенно повысить эффективность специфической профилактики бруцеллеза. 4 табл.

Штамм бактерий Brucella abortus ВГНКИ КВ 13/100, используемый для определения иммуногенной активности вакцин против бруцеллеза сельскохозяйственных животных.