Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI-продуцент липополисахарида, обладающего митогенной активностью Советский патент 1988 года по МПК C12P19/04 C12P19/04 C12R1/19 

оо о

05

сд ю

сх

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма, который может быть использован в мик робиологической промьшлеиности для производства реактивов при проведе НИИ иммунологических реакций.

Цель изобретения - штамм бактерий, способный продуцировать липо- полисахарид, яв.ляюш;ийся митогенным фактором в иммунологической реакции бласттрансформации лимфоцитов.

Штамм Е. coli ИМВ-2417, обладающий этими свойствами, выделен из кишечника здорового человека общепринятым методом с помощью элективной питательной среды Эндо и отобран в результате селекции из многих штам мов Е. coli по признаку наибольшей митогенной активности.

Депонирован в коллекции Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича МЗ СССР и имеет регистрационный номер 137.

Штамм имеет следующие культураль-

но-морфологические и физиолого-биохи мические признаки.

Морфологические признаки. Клетки - мелкие палочки 1,1-1,5 х 2,0- 6,0 ммк. Спор.не образуют, грамотри- цательные, подвижные, перитрихи.

Культуральные признаки. Хорошо растет на обычных питательных средах. На.мясо-пептонном агаре колонии KpyrJibie, гладкие, с блестящей поверхностью. На мясо-пептонном бульоне дает обильный рост, образуя помутнение и осадок. Растет в аэробных условиях при 30-37 С, рН 6,5-8,0,

Биохимические признаки. Разлагает с образованием кислоты галактозу, клюкозу, арабинозу, мальтозу, маннит сорбит, не ферментирует сахарозу. Б качестве единственного источника углерода может использовать ацета т. Нитраты восстанавливает до нитритов, образует индол.

Штамм Е. coli 137 при культивировании на синтетической среде, содержащей ферментолизат кукурузной муки, продуцирует липополисахарид, обладающий митогенной активностью.

Безвредность. Штамм относится к невирулентным для теплокровных организмов культурам. ЛД j этого штамма для белых мышей составляет: при внут рибрюшинном введении 1,52 ,57x микробных клеток, на животное;

5

0

5

0

5

0

5

0

5

при введении через рот 5,55-10 ±1,93 -Ю микр.кл./животное;, при интрана-зальном введении ЛД для мышей не определяется - максимально возможная для введения доза 5,0 х10 микр.кл./животное вызывает гибель лишь 1 из 1,0 зараженных животных. Морфологических изменений в органах и тканях зараженных животных не выявлено.

Штамм Е. coli 137 не патогенен для теплокровных организмов.

Выращивание микробной массы штамма Е. coli 137 и полу,чение липополи- сахарида производят следующим образом.

Для получения инокулята используют 24-часовую культуру, выращенную на мясо-пептонном агаре при 37°С в колбах объемом 500 мл со 100 мл жидкой синтетической среды следующего состава, %: пептон 1,5, глюкоза 1,0, дрожжевой экстракт 0,5. NajHP04 2Н20 0,8, NaCl 0,3, MgSO -7H20 0,02.

Полученным посевным материалом засевают ферментеры со средой аналогичного состава в объеме 2% от количества засеваемой среды. При этом ферментер на 50% объема заполняется средой. Выращивание осуществляют при в течение 18ч. В конце инкубации бактериальные клетки определяют центрифугированием при 5500 об/мин. Промывают 3 раза ацетоном при центрифугировании (10 мин, 2500 об/мин) и высушивают на воздухе. Липополисахарид получают по методу Вестфаля.

Пример. Штамм Е. coli 137, хранящийся в столбике мясо-пептонно- го агара (МПА) под маслом, высевают на косяк с МАА и .выращивают в термостате при 37°С в течение 24 ч. Затем культуру смывают с косяков жидкой питательной средой указанного состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержаш;ие 100 мл аналогичной питательной среды. Выращивают 24 ч при , после чего инокулят в объеме 2.% от объема среды в ферментере за- севали в ферментер АНКУМ-2 емкостью 3 л, заполненный на 50% (1,5 л) средой того же состава. Интенсивность аэрации в ферментере - 1,5 л/л.мин. при 100 об/мин мешалки, длительность выращивания бактерий 18 ч при 37°С. Культуральную жидкость затем центрифугируют при 5500 об/мин в течение 30 мин. Биомассу промывают 3 раза

ацетоном при центрифугировании (10 мин, 2500 об/мин) и высушивают на воздухе.

Извлечение липополисахарида проводят по методу Вестфаля, 10 г сухих бактериальных клеток экстрагируют 300 мл фенолводной смесью при 65 С в течение 20 мин при интенсивном

перемешивании. Смесь охлаждают до и центрифугирзтот при 2500 об/мин в течение 50 минут. Водный слой сливают в отдельный сосуд, а к феноль- ному слою и Нерастворимому осадку добавляют один объем воды и обрабатывают повторно. Объединенные экстраты диализуют против проточной, а затем дистиллированной воды до полного удаления фенола и лиофилизируют.

Липополисахарид используют в качестве митогена в реакции бласт- ной трансформации лимфоцитов периферической крови с помощью микрометода П. Г. Нараэова и В. И. Пуриня.

Культуральная среда общим объемом 3 мл содержит 0,3 мл цельной крови, 0,3 мл сыворотки IV группы (предварительно проинактивированной при 56 С в течение 30 мин), 100 мкг/мл липополисахарида и среду 199. Пробы культивируют в течение 5 сут. Учет реакции бласттрансформации лимфоцитов проводят морфологическим методом в фиксированных и окрашенных по

10

66528

Романовскому-Гимза мазках. В каждом препарате анализируют 200 клеток. В качестве бластных учитывают переходные формы - крупные клетки со средним диаметром 14 нм, увеличенным ядром, базофильной цитоплазмой, собственные бласты - крупные клетки неправильной формы диаметром 20- 24 нм, с эксцентричным ядром, ваку- олизированной цитоплазмой, клетки в стадии митоза. Помимо процентного выражения результатов реакции бласт- трансформации лимфоцитов вычисляют индексы стимуляции (отношение количества бластов в опыте к количеству бластов в контроле). При этом индекс стимуляции лимфоцитов составляет 3,7i 0,3 имп/мин, процент бластных форм 20,8±1,9, что указывает на способность липополисахарида вызывать бласттрансфо рмацию лимфоцитов.

15

20

Таким образом, предлагаемый штамм Е. coli 137 является новым штаммом, продуцирующим Липополисахарид с мито- генной активностью.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ГИСК № 137 - продуцент липополиса- харида, обладающего митогенной активностью.

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма, который может быть использован в микробиологической промьшшенности для производства реактивов при проведении иммунологических реакций. Цель изобретения - штамм бактерий, способней продуцировать, липополисахарид, являющийся митогенным фактором в иммунологической реакции бласттранс-. формации лимфоцитов. Штамм Е. coli 137, обладающий этими свойствами, выделен из кишечника здорового человека. а S (Л