ШТАММ БАКТЕРИИ Kocuria rosea - ПРОДУЦЕНТ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ KroI Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12N9/14 C12R1/265 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, используемого для выделения новой сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GC(m5C)GGC-3'/3'-CGG(m5C)CG-5', где m5C - 5-метилцитозин.

Эндонуклеаза, обладающая данной специфичностью, может быть использована для сайт-специфического гидролиза ДНК, содержащей 5-метилцитозиновые основания.

К настоящему времени известны несколько сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.

Известен штамм Glacial ice bacterium I, продуцирующий эндонуклеазу GlaI, которая узнает и расщепляет метилированную нуклеотидную последовательность 5'-G(m5C)GC-3', где m5C - 5-метилцитозин [1].

Известны штаммы Bacillus simplex 23 [2], Bacillus subtilis 230 [3] и Glacial ice bacterium 24 [4], продуцирующие сайт-специфические эндонуклеазы BlsI, BisI и GluI, которые узнают и расщепляют метилированную нуклеотидную последовательность 5'-GCNGC-3', при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозиновых оснований.

Недостатком известных штаммов является то, что продуцируемые ими эндонуклеазы рестрикции не способны узнавать и расщеплять обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GC(m5C)GGC-3/'3'-CGG(m5C)CG-5', где m5C - 5-метилцитозин.

В настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющиеся продуцентами сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих метилированную последовательность ДНК 5'-GC(m5C)GGC-3'/3'-CGG(m5C)CG-5'.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом - является штамм Micrococcus roseus NO [5] (новое видовое название Kocuria rosea), продуцирующий эндонуклеазу рестрикции MroNI, которая узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5'.

Недостатком известного штамма является то, что продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза не может расщеплять узнаваемую последовательность при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.

Технической задачей изобретения является получение бактериального штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GC(m5C)GGC-3'/3'-CGG(m5C)CG-5'.

Поставленная техническая задача решается путем получения штамма Kocuria rosea 307 - продуцента сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей метилированную последовательность нуклеотидов:

5'-G↓C(m5C) G GС-3'

3'-СG G (m5C)C↑G-5'

где m5C - 5-метилцитозин. Стрелками указаны позиции расщепления ДНК.

Предлагаемый штамм выделен из природного материала (почвы) в результате целенаправленного систематического поиска.

Полученный штамм Kocuria rosea 307 депонирован в Коллекции культур микроорганизмов НПО "СибЭнзим" под регистрационным номером 7М98, а продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза названа KroI.

Штамм Kocuria rosea 307 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Клетки кокковидные, размером порядка 1-2 мкм в диаметре. Спор не образуют. Грамположительные.

Физиолого-биохимические признаки. Облигатно аэробные. Каталазоположительные. Растут при температуре от 10 до 40°С, при рН от 6 до 9.

Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [6], а также с помощью анализа первичной структуры фрагмента гена 16S РНК по программе BLAST [7] как вид бактерии Kocuria rosea (старое видовое название Micrococcus roseus). Продуцируемая заявляемым штаммом сайт-специфическая эндонуклеаза названа согласно номенклатуре [8].

Хранение штамма осуществляется в лиофильно высушенном состоянии или в растворе 30% глицерина при температуре -60°С.

Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г\л): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, NaCl 5. Культивирование проводят при 28°С с аэрацией до достижения стационарной стадии роста.

Выход фермента составляет 200 ед./г сырой биомассы.

Полученная сайт-специфическая эндонуклеаза (рестриктаза) характеризуется следующими с свойствами:

1. Узнает и расщепляет метилированную последовательность нуклеотидов 5'-GC(m5C) G GC-3'/3'-CGG(m5C)CG-5', где m5C - 5-метилцитозин.

2. Расщепляет связи перед первым цитозином в обеих цепях узнаваемой последовательности.

3. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, если хотя бы один из центральных цитозинов не метилирован.

4. Оптимальная температура действия 37°С.

5. Оптимальное значение рН для действия фермента 8,0-9,0.

6. Гидролиз ДНК максимально эффективен при концентрации ионов NaCl 0-10 мМ.

7. Для проявления активности KroI требуются ионы Mg²⁺, оптимальная концентрация - 2-5 мМ.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от всех известных в настоящее время штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз является то, что первый продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5', при условии метилирования в узнаваемой последовательности двух центральных цитозинов. Таким образом, сайт-специфическая эндонуклеаза KroI представляет собой новый, не имеющий аналогов фермент.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов, в указанной позиции никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Выращивание штамма и выделение фермента

Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносят на агаризованную среду ЛБ в чашку Петри и инкубируют в течение ночи при 28°С. Свежевыращенные колонии переносят стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду ЛБ и культивируют на качалках при 28°С при перемешивании 150 об/мин до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С на центрифуге "Beckman" (США) в роторе JA-10. Выход биомассы составляет 5 г/л среды.

Дезинтеграцию клеток, выделение и очистку фермента проводят по известной методике [8].

Пример 2

Сайт-специфический гидролиз метилированной плазмидной ДНК эндонуклеазой KroI

Расщепление ДНК проводят в оптимальных условиях (37°С, реакционный буфер - 10 мМ Tris-HCl, pH 8.0, 3 мМ MgCl₂, 10 мМ NaCl, 1 мМ DTT) в течение 60 мин. Продукты расщепления плазмидной ДНК разделяют путем электрофореза в 1% агарозном геле.

В качестве субстратов для выявления специфичности расщепления используют различные метилированные и неметилировнные плазмидные и фаговые ДНК: фагов лямбда и Т7, плазмид pBR322, pHspAI1 (содержит метилированные последовательности 5'-G(5mC)GC-3'/5'-G(5mC)GC-3' [1]), и pFsp4HI3 (содержит метилированные последовательности 5'-G(5mC)NGC-3'/5'-G(5mC)NGC-3' [4]). Отдельно с помощью SssI метилазы проводили метилирование всех 5'-СG-3'-динуклеотидов в плазмиде pBR322 и проводили гидролиз такой метилированной плазмиды эндонуклеазой KroI.

На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления ДНК фагов λ и Т7, а также плазмид pBR322, pHspAI1 и pFsp4HI3 эндонуклеазой KroI.

Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.1:

1 - ДНК фага лямбда, обработанная рестриктазой AspA2I;

2 - ДНК фага лямбда, обработанная рестриктазой AspA2I и метилированная M.SssI;

3 - ДНК фага лямбда, обработанная рестриктазой AspA2I и эндонуклеазой KroI;

4 - ДНК фага лямбда, обработанная рестриктазой AspA2I, метилазой M.SssI и эндонуклеазой MroNI;

5 - ДНК фага лямбда, обработанная эндонуклеазами AspA2I и MroNI;

6 - ДНК фага лямбда, обработанная рестриктазой AspA2I, метилазой M.SssI и эндонуклеазой KroI;

7 - ДНК рFsр4HI3;

8 - ДНК pFsp4HI3, обработанная эндонуклеазой KroI;

9 - ДНК рНsрАI1;

10 - ДНК pHspAI1, обработанная эндонуклеазой KroI;

М - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производство НПО СибЭнзим);

11 - ДНК pBR322;

12 - ДНК pBR322, обработанная метилазой M.SssI;

13 - ДНК pBR322, обработанная эндонуклеазой KroI;

14 - ДНК pBR322, обработанная эндонуклеазой MroNI;

15 - ДНК pBR322, обработанная метилазой M.SssI и эндонуклеазой KroI.

Как видно из фиг.1, KroI не расщепляет ДНК фага лямбда, плазмид pHspAI1 и pFsp4HI3, а также плазмиды pBR322, если она не метилирована метилазой M.SssI. Во всех этих ДНК-субстратах отсутствует метилированная последовательность 5'-GС(m5С)GGС-3'/3'-СGG(m5С)СG-5', необходимая для узнавания эндонуклеазой KroI. Однако после обработки ДНК фага лямбда и плазмиды pBR322 метилазой SssI эндонуклеаза KroI расщепляет метилированную ДНК. Картина гидролиза ДНК фага лямбда рестриктазами AspA2I и MroNI совпадает с картиной гидролиза эндонуклеазой KroI метилированных продуктов расщепления ДНК фага лямбда рестриктазой AspA2I. Аналогично картина гидролиза плазмиды pBR322 рестриктазой MroNI совпадает с картиной гидролиза эндонуклеазой KroI, метилированной ДНК pBR322.

Эти два примера совпадения картин гидролиза метилированной и неметилированной ДНК эндонуклеазами MroNI и KroI соответственно подтверждают, что эти две эндонуклеазы узнают одну и ту же последовательность ДНК 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5', причем MroNI может расщеплять эту последовательность только в отсутствие CG-метилирования сайта узнавания, a KroI, наоборот, только при наличии CG-метилирования узнаваемой последовательности. Таким образом, сайт-специфическая эндонуклеаза KroI способна узнавать и расщеплять метилированную последовательность ДНК 5'-GC(m5C)GGC-3'/3'-CGG(m5C)CG-5'.

Пример 3

Определение позиции гидролиза ДНК эндонуклеазой KroI

Для подтверждения правильности определения узнаваемой последовательности и определения позиции гидролиза ДНК в сайте узнавания проводили гидролиз синтетических олигонуклеотидных дуплексов, образованных из олигонуклеотидов следующей структуры:

307-1 5'-CCATAGGATGCCTCTATGGCCGGCCACGGACCGTATC-3'

307-2 5'-GATACGGTCCGTGGCCGGCCATAGAGGCATCCTATGG-3'

307-3 5'-CCATAGGATGCCTCTATGGC(m5C)GGCCACGGACCGTATC-3'

307-4 5'-GATACGGTCCGTGGC(m5C)GGCCATAGAGGCATCCTATGG-3'

Олигонуклеотиды 307-1 и 307-3 комплементарны олигонуклелеотидам 307-2 и 307-4. Дуплексы 307-1/307-2 и 307-3/307-4 имеют сходную последовательность и отличаются друг от друга только наличием или отсутствием 5-метилцитозинов в последовательности 5'-GCCGGC-3'/3'-CGOCCG-5'.

Определение места гидролиза ДНК рестриктазой KroI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазой рестрикции MroNI неметилированного олигонуклеотидного дуплекса 307-1/307-2, образованного из олигонуклеотидов 307-1 и 307-2, и эндонуклеазой KroI метилированного дуплекса 307-3/307-4, образованного из олигонуклеотидов 307-3 и 307-4. В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ЕхоIII из E.coli.

Дуплексы 307-1/307-2 и 307-3/307-4 отличаются друг от друга только наличием или отсутствием метильной группы в первом цитозине последовательности 5'-GCCGGC-3' в обеих цепях дуплекса.

На фиг.2 изображен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления радиоактивно меченных дуплексов 307-1*/307-2 (знаком «*» указан меченый олигонуклеотид) и 307-3*/307-4 в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7-молярную мочевину. Как видно из фиг.2, фрагменты ДНК образованные гидролизом MroNI и KroI соответствующих дуплексов имеют одинаковую длину, что говорит об идентичности позиций гидролиза этих ферментов узнаваемой последоватльности.

Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.2:

1 - дуплекс 307-1*/307-2;

2 - дуплекс 307-3*/307-4;

3 - дуплекс 307-1*/307-2, обработанный рестриктазой MroNI;

4 - дуплекс 307-3*/307-4, обработанный рестриктазой KroI;

5 - дуплекс 307-3*/307-4, обработанный экзонуклеазой ЕхоIII.

На основе полученных результатов можно сделать вывод, что в палиндромной последовательности 5'-GC(m5C)GGC-3' эндонуклеаза KroI расщепляет ДНК перед первым цитозином узнаваемой последовательности с образованием четырехнуклеотидных 5'-выступающих концов. Выход сайт-специфической эндонуклеазы KroI определяют по электрофоретической картине расщепления метилированной CG-метилазой SssI ДНК плазмиды pBR322. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК данной плазмиды в течение 1 часа при температуре 37°С в 20 мкл реакционной смеси. Выход фермента составляет 200 ед./г сырой биомассы, концентрация 1000 ед./мл.

Фермент хранится при - 20°С в буфере, содержащем 50% глицерин, 0,2 М NaCl, 10 мМ трисНСl (рН 7,5), 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА.

Таким образом, получен новый штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу KroI, узнающую и расщепляющую обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5', в которых два центральных цитозина метилированы в положении С5, с образованием четырехнуклеотидных 5'-выступающих концов. Данная сайт-специфическая эндонуклеаза может быть использована для выявления и анализа метилированной ДНК.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. // Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5'-GCGC-3'. // Биотехнология. -2006. - №4. - С.31-35.

2. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательности ДНК 5'-G(5mC)NGC-3' и расщепляет ее с образованием 3'-выступающих концов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - №1. - С.28-33.

3. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis Т30 узнает метилированную последовательность ДНК 5'G(m5C)^NGC-3'. // Биотехнология. - 2005. - №3. - С.22-26.

4. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфичесчкая эндонклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5'-G(5mC)NG(5mC)-3'/3'-(5mC)GN(5mC)G-5'. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - №2. - С.13-17.

5. Roberts R.J., Vinezc Т., Posfai J., Macelis D. REBASE-restriction enzymes and methylases. - 2003. - Nucl. Acids Res. - V.31 - P.418-420.

6. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж.Хоулта и др.: 9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. - М., 1997.

7. Madden T.L., Tatusov R.L. & Zhang J. Applications of network BLAST server. // Meth. Enzymol. - 1996. - V.266 - P.131-141.

8. Smith H.O., Nathans D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. // J.Mol. Biol. - 1973. - Vol.81. - P.419-423.

9. Bickle T.A., Pirrotta V. and Imber R.A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. - 1977. - V.4 - P.561-2572.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и касается штамма бактерий, продуцирующего новую сайт-специфическую эндонуклеазу KroI. Предложен штамм бактерий Kocuria rosea 307, выделенный из почвы и обеспечивающий получение сайт-специфической эндонуклеазы KroI. Эндонуклеаза KroI узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5', в которых два центральных цитозина метилированы в положении С5 с образованием четырехнуклеотидных 5'-выступающих концов. Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г\л): пептон 10, дрожжевой экстракт 5, NaCl 5, вода дистиллированная остальное. Культивирование проводят при 28°С с аэрацией до достижения стационарной стадии роста. Выход фермента составляет 200 ед./г сырой биомассы, концентрация 1000 ед./мл. 2 ил.

Штамм бактерий Kocuria rosea 307, депонированный под №7М98 в коллекции культур микроорганизмов НПО «СибЭнзим» - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GCCGGC-3'/3'-CGGCCG-5', в которых два центральных цитозина метилированы в положении С5, с образованием четырехнуклеотидных 5'-выступающих концов.