ШТАММ БАКТЕРИИ Paracoccus carotinifaciens 3K - ПРОДУЦЕНТ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ PcsI. Российский патент 2009 года по МПК C12N1/21 C12N9/14 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, используемого для выделения новой сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК W(m5C) G NNNN^{^}NNN(m5C) GW, где W - любой из нуклеотидов А или Т, m5C - 5-метилцитозин.

Эндонуклеаза, обладающая данной специфичностью, может быть использована для сайт-специфического гидролиза ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания.

К настоящему времени известны несколько сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.

Известен штамм Glacial ice bacterium I, продуцирующий эндонуклеазу GlaI, которая узнает и расщепляет метилированную нуклеотидную последовательность 5'-G(m5C)↓GC-3', где m5C - С5-метилцитозин [1].

Известны штаммы Bacillus simplex 23 [2], Bacillus subtilis 230 [3] и Glacial ice bacterium [4], продуцирующие сайт-специфическую эндонуклеазу BlsI, которая узнает и расщепляет метилированную нуклеотидную последовательность 5'-GCNGC-3', при наличии в сайте узнавания С5-метилцитозиновых оснований.

Однако в настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющихся продуцентами сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих метилированную или неметилированную последовательность ДНК 5'-WCG NNNNNNNCGW-3'.

Технической задачей изобретения является получение бактериального штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК, содержащей четыре С5-метилцитозиновых оснований в сайте узнавания 5'-WCGNNNNNNNCGW-3', с образованием однонуклеотидных 3'-выступающих концов.

Поставленная техническая задача достигается получением штамма Paracoccus carotinifaciens 3К - продуцента сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей метилированную последовательность нуклеотидов:

5'-W(m5C) G NNN N↓NNN(m5C) G W-3'

3'-W G(m5C)NNN↑NNNN G (m5C) W-5',

где m5C - С5-метилцитозин (стрелками указаны позиции расщепления ДНК).

Предлагаемый штамм выделен из природного материала (почвы) в результате целенаправленного систематического поиска.

Полученный штамм Paracoccus carotinifaciens 3К депонирован в Коллекции культур микроорганизмов НПО "СибЭнзим" под регистрационным номером 6М74, а продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза названа PcsI.

Штамм Paracoccus carotinifaciens 3К характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. На агаризованной среде Луриа-Бертрани (ЛБ) образует оранжево-красные, гладкие, блестящие, полупрозрачные, выпуклые, круглые колонии 1-2 мм в диаметре. В жидкой питательной среде со встряхиванием образует гомогенную муть. Клетки палочковидные, размером 0,3-0,7 мкм в диаметре и 1-4 мкм в длину. Спор не образуют. Грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки. Облигатно аэробные. Каталазоположитльные. Растут при температуре от 4 до 33°С, при pH от 6 до 9.

Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [5], а также с помощью анализа первичной последовательности фрагмента 16S РНК по программе BLAST [6] как вид бактерии Paracoccus carotinifaciens. Продуцируемая заявляемым штаммом сайт-специфическая эндонуклеаза PcsI названа по номенклатуре [7].

Хранение штамма осуществляют в лиофильно высушенном состоянии или в растворе 30% глицерина при температуре -60°С.

Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г/л): пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5. Культивирование проводят при 28°С с аэрацией до достижения стационарной стадии роста.

Выход целевого фермента составляет 30 ед./г сырой биомассы с концентрацией 300 ед./мл.

Полученная сайт-специфическая эндонуклеаза PcsI характеризуется следующими с свойствами:

1. Узнает и расщепляет метилированную последовательность нуклеотидов W(m5C) G NNNN^{^}NNN(m5C) GW, где W - любой из нуклеотидов А или Т, m5C - 5-метилцитозин.

2. Расщепляет связи после центрального нуклеотида в обеих цепях узнаваемой последовательности.

3. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, содержащую меньше четырех С5-метилцитозиновых оснований.

4. Оптимальная температура действия 37°С.

5. Оптимальное значение pH для действия фермента 7,5-8,5.

6. Оптимальная концентрация соли при расщеплении ДНК 100-150 мМ NaCl.

7. Для проявления активности PcsI требуются ионы Mg²⁺, оптимальная концентрация - 5-10 мМ.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от всех известных в настоящее время штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз является то, что первый продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5'-W(m5C)GNNNN^NNN(m5C)GW-3', при условии метилирования в узнаваемой последовательности всех четырех цитозинов. Таким образом, сайт-специфическая эндонуклеаза PcsI представляет собой новый, не имеющий аналогов фермент.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов в указанной позиции никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Выращивание штамма и выделение фермента.

Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносят на агаризованную среду ЛБ в чашку Петри и инкубируют в течение ночи при 28°С. Свежевыращенные колонии переносят стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду ЛБ и культивируют на качалках при 28°С при перемешивании - 150 об/мин, до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С. Выход биомассы составляет 5 г/л среды. Дезинтеграцию клеток, выделение и очистку фермента проводят по известной методике [8].

Пример 2.

Сайт-специфический гидролиз С5-метилированной плазмидной ДНК эндонуклеазой PcsI.

Расщепление ДНК проводят в оптимальных условиях (37°С, реакционный буфер - 10 мМ TrisHCl, pH 8.0, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT) в течение 60 мин. Продукты расщепления плазмидной ДНК разделяют путем электрофореза в 1% агарозном геле.

В качестве субстратов для выявления специфичности расщепления используют различные метилированные и неметилировнные плазмидные и фаговые ДНК: фагов лямбда и Т7, pHspAI (содержит метилированные последовательности 5'-G(5mC)GC-3'/5'-G(5mC)GC-3' [1]), и pFsp4HI3 (содержит метилированные последовательности 5'-G(5mC)NGC-3'/5'-G(5mC)NGC-3' [4]) и предварительно полученной плазмиды pMHgaI (содержит метилированные последовательности 5'-GA(5mC)GC-3'/5'-G(5mC)GTC-3').

Плазмида pMHgaI была получена путем встраивания в плазмиду pUC19 ПЦР-фрагмента (2283 п.н.) геномной ДНК Haemophilus gallinarum по сайтам гидролиза эндонуклеазами рестрикции HindIII и SalI. Данный ПЦР-фрагмент был получен с использованием следующих праймеров (Р1 и Р2):

P1: 5'-CATTAAGCTTGACGCTCGAGGCGTCTGTATGTAATTAGATTTAATCATTAATTTCATGAT-3'

P2: 5'-CCTAAAGTCGACACAAAGCAACTTCAATTAATAGCTGAAT-3'

Полученный в результате полимеразной цепной реакции фрагмент ДНК содержит два гена ДНК-метилтрансфераз: Ml.HgaI и M2.HgaI [9]. Фермент M1.HgaI метилирует первый цитозин в положении С5 в нуклеотидной последовательности 5'-GCGTC-3'; M2.HgaI метилирует первый цитозин в положении С5 в нуклеотидной последовательности 5'-GACGC-3' [9]. Данная плазмида была клонирована в клетках E.coli штамма ER2267. Таким образом, плазмида pMHgaI содержит метилированные последовательности 5'-GA(5mC)GC-3'/5'-G(5mC)GTC-3'.

Метилирование этой последовательности в плазмиде pMHgaI приводит к образованию единственного сайта узнавания для эндонуклеазы PcsI, расположенного в позиции 2692. Первичная структура фрагмента ДНК, содержащего сайт узнавания PcsI приведена ниже:

Стрелкой указана позиция 2692.

На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления ДНК фагов λ и Т7, а также плазмид pMHgaI, pHspAI и pFsp4HI3 эндонуклеазой PcsI.

Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.2:

1 - ДНК фага лямбда;

2 - ДНК фага лямбда, обработанная эндонуклеазой PcsI;

3 - ДНК фага Т7;

4 - ДНК фага Т7, обработанная эндонуклеазой PcsI;

5 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производство НПО СибЭнзим).

6 - ДНК pMHgaI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;

7 - ДНК pMHgaI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой PcsI;

8 - ДНК pHspAI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;

9 - ДНК pHspAI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции Dril, обработанная эндонуклеазой PcsI;

10 - ДНК pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;

11 - ДНК pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой PcsI.

Как видно из фиг.1, эндонуклеаза PcsI не расщепляет ДНК фагов лямбда и Т7, а также ДНК плазмид pHspAI и pFsp4HI3, в которых отсутствует метилированная последовательность 5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'/5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'.

ДНК плазмиды pMHgaI длиной 4969 п.н., линеаризованной рестриктазой DriI, данный фермент расщепляет в единственном месте. Электрофоретическая подвижность образуемых в результате данного расщепления фрагментов ДНК соответствует теоретически рассчитанным для гидролиза по последовательности 5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3'/5'-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3': 1260 п.н. и 3709 п.н.

Пример 3.

Определение места гидролиза ДНК эндонуклеазой PcsI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазами рестрикции PcsI и BstKTI олигонуклеотидного дуплекса 13/14, образованного из олигонуклеотидов 13 и 14, имеющих следующую первичную структуру олигонуклеотидов:

13: 5' gcgggatat(5mc)gagatctc(5mc)gtcgctac(5mc)gccagtca 3'

14: 5' tgactgg(5mc)gctagcga(5mc)gGagatcT(5mc)gatatcccgc 3'

В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ExoIII.

На фиг.2 изображен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления дезоксирибоолигонуклеотидного радиоактивно меченного дуплекса 13/14 в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7-молярную мочевину.

Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.2:

1 - исходный дуплекс 13*/14;

2 - дуплекс 13*/14, обработанный эндонуклеазой рестрикции BstKTI;

3 - дуплекс 13*/14, обработанный экзонуклеазой III из E.coli;

4 - дуплекс 13*/14, обработанный эндонуклеазой рестрикции PcsI;

5 - исходный дуплекс 13/14*;

6 - дуплекс 13/14*, обработанный эндонуклеазой рестрикции BstKTI;

7 - дуплекс 13/14*, обработанный экзонуклеазой III из E.coli;

8 - дуплекс 13/14*, обработанный эндонуклеазой рестрикции PcsI;

Олигонуклеотиды, меченные радиоактивным фосфором ³²Р по 5'-концу, обозначены знаком *.

Из фиг.2 видно, что продукты гидролиза ДНК дуплекса 13*/14 на дорожках 2 и 4 имеют одинаковые длины. Это означает, что на меченом олигонуклеотиде 13 позиции гидролиза ферментами BstKTI и PcsI совпадают.

В то же время на дорожках 6 и 8 фиг.3 видно, что фрагмент ДНК, который образуется при гидролизе 13/14* рестиктазой BstKTI, на один нуклеотид длиннее, по сравнению с фрагментом ДНК, образованным при гидролизе этого же дуплекса эндонуклеазой PcsI.

На основе полученных результатов можно сделать вывод, что в вырожденной палиндромной последовательности эндонуклеаза PcsI расщепляет ДНК после четвертого нуклеотида N: 5'-W(5mC)GNNNN↓NNN(5mC)GW-3'.

Выход сайт-специфической эндонуклеазы PcsI определяют по электрофоретической картине расщепления ДНК плазмиды pMHgaI, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК данной плазмиды в течение 1 часа при температуре 37°С в 20 мкл реакционной смеси. Выход фермента составляет 60 ед./г сырой биомассы, концентрация 300 ед./мл.

Фермент хранят при - 20°С в буфере, содержащем 50% глицерин, 0,08% тритон Х100, 0,2 М NaCl, 10 мМ трисНС1 (зР 7,5), 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА.

Таким образом, получен новый штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу PcsI, узнающую и расщепляющую обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК, которая содержит четыре С5-метилцитозиновых оснований в сайте узнавания 5'-WCGNNNNNNNCG-3', с образованием однонуклеотидного 3'-выступающего конца. Данная сайт-специфическая эндонуклеаза может быть использована для выявления и анализа метилированной ДНК.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. // Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5'-GCGC-3'. - Биотехнология. - 2006. - №4. - С.31-35.

2. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательности ДНК 5'-G(5mC)NGC-3' и расщепляет ее с образованием 3'-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - №1. - С.28-33.

3. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis Т30 узнает метилированную последовательность ДНК 5'G(m5C)^NGC-3' // Биотехнология. - 2005. - №3. - С.22-26.

4. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфичесчкая эндонуклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5'-G(5mC)NG(5mC)-3'/3'-(5mC)GN(5mC)G-5' // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - №2. - С.13-17.

5. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж.Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А.Заварзина. - М., 1997.

6. Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. Applications of network BLAST server. - 1996. - Meth. Enzymol. V.266 - P.131-141.

7. Smith, H.O., Nathans, D. // J. Mol. Biol. - 1973. - V.81. - P.419-423.

8. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. - 1977. - V.4 - P.561-2572.

9. Sugisaki, H., Yamamoto, K., Takanami M. The HgaI restriction-modification system contains two cytosine methylase genes responsible for modification of different DNA strands. // 1991. - J. Biol. Chem. - V.266 - P.13952-13957.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для сайт-специфического гидролиза ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания. Из почвы выделен штамм Paracoccus carotinifaciens 3К, обеспечивающий получение сайт-специфической эндонуклеазы, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК, содержащей четыре С5-метилцитозиновых оснований в сайте узнавания 5'-WCGNNNNNNNCGW-3', с образованием однонуклеотидных 3'-выступающих концов. Изобретение позволяет получить новую сайт-специфическую эндонуклеазу PcsI, которая может быть использована для выявления и анализа метилированной ДНК. 2 ил.

Штамм бактерии Paracoccus carotinifaciens 3K, депонированный в ККМ НПО «СибЭнзим» под номером 6М74, продуцент сайт-специфической эндонуклеазы PcsI.