СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ БЕСКЛЕТОЧНОГО СУПЕРНАТАНТА BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM 791 В ОТНОШЕНИИ KLEBSIELLA PNEUMONIAE И ESCHERICHIA COLI Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A61K35/66 A61K35/745 

Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и медицине и может использоваться в научно-исследовательских и производственных бактериологических лабораториях с целью получения бесклеточных супернатантов бифидобактерий с высокой антимикробной активностью в качестве сырья для производства местных (топических, наружных) лечебно-профилактических средств и метабиотиков с антимикробным действием против представителей грамнегативных бактерий рода клебсиелл и эшерихий.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рост и распространение возбудителей инфекционных заболеваний, характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью, является одной из основных проблем современной прикладной биологии, медицины и ветеринарии [6, 21]. Это связано прежде всего с чрезмерным назначением антимикробных средств, нарушением сроков приема препаратов, а также низким уровнем информированности населения о сложившейся ситуации, что приводит к самостоятельному бесконтрольному применению этиотропных антимикробных препаратов, как в здравоохранении, так и в ветеринарии [7, 20, 22]. Представители семейства Enterobacteriaceae (эшерихии и клебсиеллы), являются одними из наиболее частых возбудителей нозокомиальных и внебольничных инфекций. По данным анализа онлайн-платформы резистентности к антимикробным препаратам AMRmap, энтеробактерии обладают высокими значениями формирования устойчивости к различным антибиотикам [Зацаринная Е.А., Колупаева Н.В., Колупаева Л.В. Антибиотикоустойчивость энтеробактерий, выделенных из поверхностных водных объектов разных природно-климатических зон. Acta biomedica scientifica. 2022; 7(3): 142-149. doi: 10.29413/ABS.2022-7.3.15].

Поиск альтернативных методов и средств борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний на современном этапе крайне актуально. В настоящее время в медицинской, микробиологической и ветеринарной практике проводится поиск и широкое использование бактерий-антагонистов и бактерий-продуцентов антимикробных веществ, в том числе на основе штаммов бифидобактерий.

В научной литературе известно наличие антимикробной (антагонистической) активности бифидобактерий против различных видов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Антимикробная активность бифидобактерий и продуктов их вторичного метаболизма является важным конкурентным фактором, препятствующим вторжению и персистенции патогенных и условна-патогенных бактерий. Описаны разнообразные неспецифические механизмы антагонистического действия бифидобактерий в отношении грампозитивной и грамнегативной микрофлоры [1, 2, 48]. Такие как, ингибирующее действие молекул органических кислот, вызывающих локальное снижение рН в биотопе кишечника, конкуренция за питательные вещества, сайты адгезии; продукция специфических антимикробных субстанций (bacteriocin-like inhibitory substances, BLIS); стимуляция врожденного и адаптивного иммунитета хозяина.

Однако важной проблемой, является снижение антагонистической (антимикробной) активности штаммов бифидобактерий, возникающая при применении бифидосодержащих пробиотических препаратов. В связи с этим необходимо проводить исследования, направленные на поиск не только новых штаммов бифидобактерий и создания препаратов на основе метаболитов (метаболических пробиотиков с антимикробным действием) [1], но и способов повышения антимикробной (антагонистической) активности пробиотических штаммов и их метаболитов.

В настоящее время применяются различные способы повышения антимикробной активности пробиотических штаммов. Известен способ повышения антимикробной активности у пробиотических микроорганизмов, основанный на выращивании антагонистически активных штаммов бифидо- и лактобактерий с использованием пищевых волокон (виноградных выжимок) в качестве стимуляторов их роста. Основой данного способа является внесение в питательную среду дополнительного компонента - виноградной выжимки, которая усиливает антимикробные свойств пробиотических бактерий (Макарова Н.В., Игнатова Д.Ф. Еремеева Н.Б. Использование отходов переработки винограда в качестве источника комплекса биологически активных веществ // Вестник ВГУИТ. 2020. Т. 82. № 4. С. 207-212. doi:10.20914/2310-1202- 2020-4-207-212). Однако, внесение в среду предлагаемого компонента, предполагает предварительное получение виноградной выжимки, что требует дополнительных временных и ресурсных затрат на осуществление способа. Недостатком данного способа является также, что в данном способе используются клетки пробиотических бактерий, а не их супернатант (метаболиты), заведомо содержащий более высокий уровень антимикробных веществ. Кроме того, виноградная выжимка может обладать собственными антимикробными свойствами, в том числе против штаммов бифидо- и лактобацилл.

Известен способ повышения антагонистической активности некоторых штаммов-антагонистов (Enterococcus faecalis, Escherichia coli M-17, Bacillus subtilis) (Семенов А.В. Способ повышения антагонистической активности бактерий, Вестник ОГУ №6, С. 100 - 103). Указанный способ позволяет повысить антагонистическую бактерий-антагонистов, путем активации штамма-антагониста компонентами исследуемой культуры S. aureus, по отношению к которой добиваются повышение антагонизма. При этом в данном способе используется фрагменты клеточных стенок и экзометаболиты индикаторного штамма стафилококка. Основным недостатком данного способа является то, что он не позволяет повысить антагонистическую активность пробиотических штаммов бифидобактерий. Способ характеризуются высокой трудоемкостью, многостадийностью и большой продолжительностью осуществления способа.

Известен способ получения и композиция для повышения эффективности пробиотических микроорганизмов (Патент RU 2740140 C1) заключающийся в культивировании бифидобактерий в среде с пониженной концентрацией лимитирующего энергетического углеводного субстрата при его дробной подаче, при температуре от 36 до 38°C, при рН культуральной жидкости в интервале от 5,0 до 7,0, и прекращении процесса культивирования, когда суспензия содержит не менее 2·10⁹ КОЕ бифидобактерий в мл и не менее 70% клеток агломерируют в микроколонии, при последующем удалении среды культивирования и ее замене среды культивирования на забуференный физиологический раствор, смешении и сорбировании на частицах активированного угля с размером не более 100 мкм в количестве от 10 до 40%, добавлении сахарозо-желатиновой защитной среды до 100% и лиофильном высушивании.

Основным недостатком данного способа является то, что он направлен на защиту пробиотических микроорганизмов от стрессового воздействия и гибели в экстремальных условиях желудка и верхних отделов кишечника, либо при длительном хранении и не позволяет повысить антимикробную (антагонистической) активность штаммов бифидобактерий. В данном способе используются клетки пробиотических бактерий, а не их супернатант (метаболиты), заведомо содержащий более высокий уровень антимикробных веществ. Также указанный способ характеризуются высокой трудоемкостью, многостадийностью и большой временной продолжительностью.

Близким аналогом к заявляемому способу по совокупности существенных признаков является способ получения биологического стимулятора, обладающего пробиотическим и иммуномодулирующим действием [В.А. Несчисляев, Л. П. Чистохина Способ получения биологического стимулятора / Патент РФ 2224018].

Данный способ основан на приготовлении бактериальной взвеси лакто- и бифидобактерий, полученной путем глубинного культивирования, её ультрафильтрацию с последующей стабилизацией фильтрата путем термической обработки при 80-110⁰С в течение 15-30 мин. Однако данный способ направлен на стимуляцию биологических свойств пробиотических штаммов лакто- и бифидобактерий под действием полученного биологического стимулятора и назначение данного способа не связано с повышением антимикробной активности супернатанта бифидобактерий в отношении грамнегативных бактерий (эшерихий и клебсиелл).

При этом усиление антимикробных свойств супернатанта бифидобактерий не очевидно, поскольку термическая обработка сохраняет биостимулирующие свойства продукта, не исключая снижения антимикробных свойств супернатанта бифидобактерий.

Наиболее близким по назначению и совокупности существенных признаков является методика, использованная при изучении влияния экзометаболитов Bifidobacterium bifidum на пролиферативную активность условно-патогенных микроорганизмов (Регулирующее влияние экзометаболитов Bifidobacterium bifidum на пролиферативную активность условно-патогенных микроорганизмов / А.А. Марков, Т.Х. Тимохина, Н.Б. Перунова, Я.И. Паромова // Вестн. Смоленской государственной медицинской академии. - 2018. - № 1 (17). - С. 5662). Данная методика основана на получении экзометаболитов Bifidobacterium bifidum 791, выделенных из препарата «Бифидумбактерин» (ЗАО «Экополис», г. Ковров) при культивировании на бульоне Шедлера. Для получения супернатанта бульонные культуры Bifidobacterium bifidum 791 центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин и отделяли от клеток, стерилизовали через мембранные фильтры (Millipore, 0,22 мкм), взятая нами за прототип.

Однако данный способ не свидетельствует о стабильности полученного супернатанта и его эффективности под действием различных стрессовых факторов, в том числе и температуры, а также культур антимикробной активности в отношении клебсиелл и кишечных палочек. Существенным недостатком методики является то, что антимикробная активность супернатанта бифидобактерий, полученного по описанному способу, связана с физиологическим состоянием микробной популяции штамма B. bifidum 791 и может изменяться в зависимости от влияния различных биотических и абиотических факторов.

Техническая задача - разработка способа повышения антимикробной активности бесклеточного супернатанта Bifidobacterium bifidum 791 в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ СПОСОБА

Технический результат, на достижение которого направлено патентуемое изобретение, способ повышения антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении штаммов K. pneumonia и E. coli.

Способ осуществляется следующим образом:

Получают бульонную культуру B. bifidum 791.

Приготовление бульона Шедлера производят по прилагаемой инструкции к коммерческой питательной среде (производитель HIMEDIA, Индия, кат. номер № M292-500G). Питательная среда (в количестве 28,4 г) растворяется в 1000 мл дистиллированной водой, перемешивается и доводится до кипения. Питательную среду (бульон Шедлера) стерилизуют методом автоклавирования при температуре 121⁰С (1,1 атм) в течение 15 мин, охлаждают до температуры культивирования, разливают в стерильные пробирки по 9 мл (10 пробирок).

Далее готовят рабочий раствор инокулята бифидобактерий. Для этого берут 1 флакон сухого лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» штамм B. bifidum 791 (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров), содержащего 5 доз препарата (в одной дозе содержание микробных клеток 1×10⁷), соответственно во флаконе концентрация микробных клеток 5×10⁷, которые разводят в 10 мл бульона Шедлера. Приготовленный рабочий раствор инокулята бифидобактерий по 1 мл вносят стеклянной пипеткой на дно пробирки с 9 мл бульоном Шедлера в каждую из 10 пробирок (конечная концентрация B. bifidum в растворе составляет 5×10⁵). Пробирки инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.

Далее получают бесклеточный супернатант B. bifidum 791.

Полученные бульонные культуры бифидобактерий центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную культуральную жидкость забирают стеклянной пипеткой и пропускают ее через мембранные бактериальные фильтры «Millipore» (США), таким образом получают бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученный бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещают в стерильные стеклянные флаконы объемом 250 мл.

После чего производят прогревание бесклеточного супернатанта B. bifidum 791. Стерильные стеклянные флаконы, содержащие бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещают на водяную баню при температуре 60 - 70°С и выдерживают в течение 20 минут. Охлаждают при комнатной температуре.

Новым в предлагаемом способе повышения антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении исследуемых штаммов грамнегативных бактерий (клебсиелл и эшерихий), является то, что в нем, в сравнении с прототипом, происходит обработка бесклеточного супернатанта на водяной бане при температуре 60 - 70°С в течение 20 минут, что приводит к повышению антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении штаммов K. pneumoniae и E. coli. Это отличает предлагаемое техническое решение от прототипа.

Теоретической предпосылкой для изучения влияния температуры на антимикробные свойства бесклеточного супернатанта бифидобактерий послужило то, что в биотехнологическом производстве пробиотических продуктов, бифидобактерии находятся под воздействием нагревания, охлаждения, осмотического шока, аэробной среды и др. [4], что, в свою очередь, вызывает необходимость исследовать стрессовые условия в технологическом процессе создания препарата. В настоящее время наиболее изученным является адаптивный ответ бифидобактерий на тепловое воздействие, который проявляется в увеличении белков теплового шока, экспрессии SOS-генов, а также в изменении клеточного деления [5]. Кроме того, для приготовления композиционных препаратов (мягких лекарственных форм) необходимо пастеризация. Однако, в литературе отсутствуют данные о влиянии температуры на изменение антимикробной активности бесклеточного супернатанта бифидобактерий.

В работе был использован штамм B. bifidum 791, полученный из лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров). В качестве представителей энтеробактерий были использованы два наиболее часто встречающихся и клинически-значимых вида энтеробактерий: K. pneumoniae (n=12) и E. coli (n=12).

На первом этапе получали бульонную культуру B. bifidum 791. Для этого готовили бульон Шедлера по прилагаемой инструкции к коммерческой питательной среде (производитель HIMEDIA, Индия, кат. номер № M292-500G). Питательную среду (в количестве 28,4 г) растворяется в 1000 мл дистиллированной водой, перемешивали, доводили до кипения и стерилизовали методом автоклавирования при температуре 121°С (1,1 атм) в течение 15 мин, затем охлаждали до температуры культивирования, разливали в стерильные пробирки по 9 мл (10 пробирок). Далее готовили рабочий раствор инокулята бифидобактерий. Для этого 1 флакон сухого лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» штамм B. bifidum 791 (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров), содержащего 5 доз препарата (в одной дозе содержание микробных клеток 1×10⁷), соответственно во флаконе концентрация микробных клеток 5×10⁷, разводили в 10 мл бульона Шедлера. Приготовленный рабочий раствор инокулята бифидобактерий по 1 мл вносили стеклянной пипеткой на дно пробирки с 9 мл бульоном Шедлера в каждую из 10 пробирок (конечная концентрация B. bifidum в растворе составляет 5×10⁵). Пробирки инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.

На следующем этапе получали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученные бульонные культуры бифидобактерий центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную культуральную жидкость забирали стеклянной пипеткой и пропускали ее через мембранные бактериальные фильтры «Millipore» (США), таким образом получали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученный бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещают в стерильные стеклянные флаконы объемом 250 мл.

Далее прогревали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Стерильные стеклянные флаконы, содержащие бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали на водяную баню при различной температуре и времени экспозиции. Исследовали влияние температуры 50, 60, 70, 80, 90 и 100°С и экспозицию в течение 10, 20 и 30 минут.

Параллельно готовили взвеси исследуемых культур культур K. pneumoniae и E. coli в физиологическом растворе хлорида натрия. Для этого штаммы K. pneumoniae и E. coli (каждые в отдельности) выращивали на агаре Мюллер-Хинтона в течение 24 часов при 37°С. Из выросших агаровых культур клебсиелл и кишечных палочек (каждой в отдельности) готовили суспензию на 0,9% растворе NaCl соответствующую концентрации 0,5 MF (1,5х10⁸ КОЕ/мл) и доводили до рабочей концентрации взвеси культур K. pneumoniae и E. coli 3х10³ КОЕ/мл путем последовательного разведения исходной концентрации в физиологическом растворе.

Далее соинкубировали взвеси культур K. pneumoniae и E. coli (каждую в отдельности) с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, прогретыми при различной температуре (50, 60, 70, 80, 90 и 100°С) с экспозицией 10, 20 и 30 минут. Для этого 0,2 мл взвеси культур K. pneumoniae и E. coli (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл прогретых при различной температуре (50, 60, 70, 80, 90 и 100°С) с экспозиции 10, 20 и 30 минут супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации делали высев штаммов K. pneumoniae и E. coli по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности колоний K. pneumoniae и E. coli. Численность колоний клебсиелл и эшерихий определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ), выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.

В качестве контроля использовали соинкубирование взвеси культур K. pneumoniae и E. coli (каждая культура в отдельности) с питательным бульоном (контроль 1) и полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, без воздействия температуры (контроль 2). Для этого 0,2 мл взвеси культур K. pneumoniae и E. coli (каждый штамм в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл питательного бульона (контроль 1) или бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 (контроль 2). Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации также делали высев исследуемых штаммов по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности колоний K. pneumoniae и E. coli. Численность колоний клебсиелл и эшерихий определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.

О наличии антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 судили по снижению количества колониеобразующих единиц в контроле 2 по сравнению с контролем 1. Об увеличении антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 под воздействием температуры, судили по снижению количества колониеобразующих единиц или их полному отсутствию в опытной пробе по сравнению с контролем 2.

Авторами экспериментально установлено, что прогревание бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 при температуре 60-70°С в течении 20 минут приводит к увеличению его антимикробной активности в отношении штаммов K. pneumoniae и E. coli.

На первом этапе было изучено влияние различных температур на антимикробную активность бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении штаммов K. pneumoniae и E. coli при экспозиции в течение 10 минут. Результаты исследований представлены в таблице в таблице 1.

Табл. 1 - Численность колониеобразующих единиц (КОЕ) исследуемых штаммов энтеробактерий под влиянием бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, прогретого при различных температурах в течение 10 минут, в сравнении с контролями.

Исследуемые штаммы энтеробактерий КОЕ исследуемых штаммов энтеробактерий Контроль 1
без добавления супернатанта бифидобактерий Контроль 2
с добавлением супернатанта бифидобактерий без воздействия температуры Опыт
с добавлением супернатанта бифидобактерий после воздействия температуры 50°С 60°С 70°С 80°С 90°С 100°С E. coli (n=12) 10⁵-10⁷ 10² 10² единичные колонии единичные колонии 10³ 10³ 10³ K. pneumoniae
(n=12) 10⁶-10⁷ 10² 10² единичные колонии единичные колонии 10³ 10³ 10³

Полученные результаты свидетельствуют, что бесклеточный супернатант B. bifidum 791 обладает анттимикробной активностью в отношении исследуемых штаммов бактерий, снижая их численность до 10² КОЕ. При этом, прогревание на водяной бане при 50°С в течение 10 минут не приводило к изменению антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791. Увеличение температуры до 60°С и 70°С приводило к увеличению антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, что сопровождалось снижением численности (КОЕ) энтеробактерий до единичных колоний.

Дальнейшее повышение температуры до 80°С - 100°С приводило к снижению антимикробной активности супернатанта, о чем свидетельствовало повышение КОЕ энтеробактерий до 10³.

В связи с полученными данными на следующем этапе работы нами были проведены исследования по влиянию температуры 60°С и 70°С при экспозиции 10, 20 и 30 минут на антимикробную активность бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении исследуемых штаммов K. pneumoniae и E. coli. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Табл. 2 - Численность колониеобразующих единиц (КОЕ) исследуемых штаммов энтеробактерий под влиянием бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, прогретого при 60°С и 70°С в течение 10, 20 и 30 минут, в сравнении с контролями.

Исследуемые штаммы энтеробактерий КОЕ исследуемых штаммов энтеробактерий Контроль 1
без добавления супернатанта бифидобактерий Контроль 2
с добавлением супернатанта бифидобактерий без воздействия температуры Опыт
с добавлением супернатанта бифидобактерий после воздействия температуры 60°С 70°С 10 мин 20 мин 30 мин 10 мин 20 мин 30 мин E. coli (n=12) 10⁵-10⁷ 10² единичные колонии роста нет единичные колонии единичные колонии роста нет единичные колонии K. pneumoniae
(n=12) 10⁶-10⁷ 10² единичные колонии роста нет единичные колонии единичные колонии роста нет единичные колонии

Как видно из представленной таблицы, наиболее высокой антимикробной активностью в отношении исследуемых штаммов K. pneumoniae и E. coli обладал бесклеточный супернатант B. bifidum 791, после воздействия на него температуры 60° и 70°С в течение 20 минут.

Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить уровень антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении культур K. pneumoniae и E. coli, что может быть использовано для приготовления сырья с антимикробной активностью на основе супернатанта бифидобактерий при производстве местных (топических, наружных) лечебно-профилактических средств и метабиотиков с антимикробным действием против представителей грамнегативных бактерий K. pneumoniae и E. coli.

ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1.

Определяли антимикробную активность бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, прогретого при температуре 60°С в течение 20 минут в отношении тест-штамма E. coli АТСС 35218 и клинических изолятов E. coli.

Готовили бульон Шедлера по прилагаемой инструкции к коммерческой питательной среде (производитель HIMEDIA, Индия, кат. номер № M292-500G): питательную среду (в количестве 28,4 г) растворяли в 1000 мл дистиллированной воды, перемешивали и доводили до кипения; затем стерилизовали методом автоклавирования при температуре 121°С (1,1 атм) в течение 15 мин, охлаждали до температуры культивирования. Бульон Шедлера разливали в стерильные пробирки по 9 мл (10 пробирок). Готовили рабочий раствор инокулята бифидобактерий. Для этого брали 1 флакон сухого лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» штамм B. bifidum 791 (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров), содержащего 5 доз препарата (в одной дозе содержание микробных клеток 1×10⁷), соответственно во флаконе концентрация микробных клеток 5×10⁷, которые разводили в 10 мл бульона Шедлера. Приготовленный рабочий раствор инокулята бифидобактерий по 1 мл вносили стеклянной пипеткой на дно в каждой из пробирок с 9 мл бульона Шедлера (конечная концентрация B. bifidum в растворе 5×10⁵). Пробирки инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.

Полученные бульонные культуры бифидобактерий центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную культуральную жидкость забирали стеклянной пипеткой и пропускали её через мембранные бактериальные фильтры «Millipore» (США), таким образом получали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученный бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали в стерильные стеклянные флаконы объемом 250 мл.

Прогревали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Для этого стерильные стеклянные флаконы, содержащие бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали на водяную баню при температуре 60°С и выдерживали в течение 20 минут. Охлаждали при комнатной температуре.

Параллельно готовили взвеси культур E. coli (музейные и клинические изоляты эшерихий) в физиологическом растворе хлорида натрия. Для этого штаммы E. coli каждый в отдельности выращивали на агаре Мюллер-Хинтона в течение 24 часов при 37°С. Из выросшей агаровой культуры кишечных палочек каждой в отдельности готовили суспензию на 0,9% растворе NaCl соответствующую концентрации 0,5 MF (1,5х10⁸ КОЕ/мл) и доводили до рабочей концентрации взвеси E. coli 3х10³ КОЕ/мл путем последовательного разведения исходной концентрации в физиологическом растворе.

Далее соинкубировали взвеси культур E. coli каждую в отдельности с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, прогретым при 60°С в течение 20 минут. Для этого 0,2 мл взвеси культур E. coli (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл прогретого при 60°С в течение 20 минут супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации делали высев штаммов E. coli по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности E. coli. Численность эшерихий определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.

В качестве контроля использовали соинкубирование взвеси культур E. coli (каждая в отдельности) с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, без воздействия температуры. Для этого 0,2 мл взвеси культур E. coli (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл бесклеточного супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации также делали высев штаммов E. coli по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности колоний E. coli. Численность колоний эшерихий определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.

В результате, бесклеточный супернатант B. bifidum 791 прогретый при 60°С в течение 20 минут обладал более высокой антимикробной активностью в отношении штаммов E. coli в сравнении с не гретым бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, поскольку происходило снижение количества колониеобразующих единиц исследуемых штаммов: у E. coli АТСС 35218 с 40±3 до 0 КОЕ, E. coli № 25 с 301±10 до 60±5 КОЕ и у E. coli № 37 с 230±11 до 110±9 КОЕ. Данный факт свидетельствует о повышении антимикробной активности против исследуемых штаммов E. coli прогретого бесклеточного супернатанта B. bifidum 791.

Пример 2.

Определяли антимикробную активность бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, прогретого при температуре 70°С в течение 20 минут в отношении тест-штамма K. pneumoniae АТСС 7006003 и клинических изолятов K. pneumoniae (№ 170, 252, 254).

Готовили бульон Шедлера по прилагаемой инструкции к коммерческой питательной среде (производитель HIMEDIA, Индия, кат. номер № M292-500G): питательную среду (в количестве 28,4 г) растворяли в 1000 мл дистиллированной воды, перемешивали и доводили до кипения; затем стерилизовали методом автоклавирования при температуре 121⁰С (1,1 атм) в течение 15 мин, охлаждали до температуры культивирования. Бульон Шедлера разливали в стерильные пробирки по 9 мл (10 пробирок). Готовили рабочий раствор инокулята бифидобактерий. Для этого брали 1 флакон сухого лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» штамм B. bifidum 791 (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров), содержащего 5 доз препарата (в одной дозе содержание микробных клеток 1×10⁷), соответственно во флаконе концентрация микробных клеток 5×10⁷, которые разводили в 10 мл бульона Шедлера. Приготовленный рабочий раствор инокулята бифидобактерий по 1 мл вносили стеклянной пипеткой на дно в каждой из пробирок с 9 мл бульона Шедлера (конечная концентрация B. bifidum в растворе 5×10⁵). Пробирки инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.

Полученные бульонные культуры бифидобактерий центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную культуральную жидкость забирали стеклянной пипеткой и пропускали её через мембранные бактериальные фильтры «Millipore» (США), таким образом получали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученный бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали в стерильные стеклянные флаконы объемом 250 мл.

Прогревали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Для этого стерильные стеклянные флаконы, содержащие бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали на водяную баню при температуре 70°С и выдерживали в течение 20 минут. Охлаждали при комнатной температуре.

Параллельно готовили взвеси культур K. pneumoniae (музейные и клинические изоляты клебсиелл) в физиологическом растворе хлорида натрия. Для этого штаммы K. pneumoniae каждый в отдельности выращивали на агаре Мюллер-Хинтона в течение 24 часов при 37°С. Из выросшей агаровой культуры кишечных палочек каждой в отдельности готовили суспензию на 0,9% растворе NaCl соответствующую концентрации 0,5 MF (1,5х10⁸ КОЕ/мл) и доводили до рабочей концентрации взвеси K. pneumoniae 3х10³ КОЕ/мл путем последовательного разведения исходной концентрации в физиологическом растворе.

Далее соинкубировали взвеси культур K. pneumoniae каждую в отдельности с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, прогретым при 70°С в течение 20 минут. Для этого 0,2 мл взвеси культур K. pneumoniae (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл прогретого при 70°С в течение 20 минут супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации делали высев штаммов K. pneumoniae по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности K. pneumoniae. Численность клебсиелл определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.

В качестве контроля использовали соинкубирование взвеси культур K. pneumoniae (каждая в отдельности) с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, без воздействия температуры. Для этого 0,2 мл взвеси культур K. pneumoniae (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл бесклеточного супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37⁰С. После инкубации также делали высев штаммов K. pneumoniae по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности колоний K. pneumoniae. Численность колоний клебсиелл определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.

В результате, бесклеточный супернатант B. bifidum 791 прогретый при 80°С в течение 20 минут обладал более высокой антимикробной активностью в отношении штаммов K. pneumoniae в сравнении с не гретым бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, поскольку происходило снижение количества колониеобразующих единиц исследуемых штаммов: у K. pneumoniae АТСС 7006003 с 130±10 до 55±8 КОЕ, у K. pneumoniae №170 с 55±5 до 33±3 КОЕ, у K. pneumoniae № 252 с 150±6 до 4±2 и у K. pneumoniae № 254 с 100±4 до 0 КОЕ. Данный факт свидетельствует о повышении антимикробной активности в отношении исследуемых штаммов K. pneumoniae прогретого бесклеточного супернатанта B. bifidum 791.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ повышения антимикробной активности бесклеточного супернатанта Bifidobacterium bifidum 791 в отношении Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli, включающий приготовление питательной среды бульона Шедлера, посев культуры бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791 на дно пробирки с питательной средой, культивирование 48 ч в термостате при 37°С с последующим выделением бесклеточного супернатанта путем центрифугирования и пропусканием через мембранный бактериальный фильтр «Millipore». Полученный бесклеточный супернатант Bifidobacterium bifidum 791 прогревают 20 мин на водяной бане при температуре от 60 до 70°С с последующем охлаждением до комнатной температуры. Изобретение обеспечивает расширение арсенала лечебно-профилактических средств с антимикробным действием в отношении Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli. 2 табл., 2 пр.

Способ повышения антимикробной активности бесклеточного супернатанта Bifidobacterium bifidum 791 в отношении Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli, включающий приготовление питательной среды бульона Шедлера, посев культуры бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791 на дно пробирки с питательной средой, культивирование в термостате при температуре 37°С в течение 48 ч с последующим выделением бесклеточного супернатанта путем центрифугирования и пропусканием через мембранный бактериальный фильтр «Millipore», затем полученный бесклеточный супернатант Bifidobacterium bifidum 791 прогревают на водяной бане при температуре от 60 до 70°С 20 мин с последующем охлаждением до комнатной температуры.