Способ диагностики сифилиса Советский патент 1981 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

1

Изобретение относится к медицине и касается диагностики раннего врожденного Сифилиса.

Известен способ диагностики сифилиса путем исследования нейтрофилов периферической крови 11.

Однако способ не является строго специфичным, так как аналогичные изменения ферментов могут возникать и при других состояниях (различные инфекционные заболевания, болезни с обменными нарушениями и пр.) и не позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии. Кроме того, спо-соб технически сложен и не всегда выполним в лабораториях общеклинического профиля.

Цель изобретения - ранняя диагностика заболевания.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики сифилиса путем исследования нейтрофилов периферической крови кровь инкубируют с ультраозвученной бледной трепонемой и определяют показатель повреждения нейтрофилов и при показателях повреждения нейтрофилов от 0,2 до 0,4 диагностируют выраженные, а при показателях от О.П до 0,39 - косвенные признаки сифилиса.

Способ осуществляют следующим образом.

; При постановке реакции для каждого больного готовят ряд пробирок. Если используют один аллерген, то достаточно двух пробирок: опытной и контрольной. В контрольную пробирку стерильной микропипеткой вносят 0,02 мл 5°/о-ного раствора цитрата натрд1я, в опытную 0,02 мл трепонемального антигена, разведенного цитратом натрия по схеме: 0,8 мл цельного трепонемального антигена плюс 0,2 мл 25 /o-HOio цитрата натрия. Оптимальную концентрацию аллергена устанавливают опытным путем, что удовлетворяет основным требованиям реакции: не вызывает выраженной активности клеток здоровых людей (несенсибилизированных здоровых доноров) и обуславливает интенсивную амебоидную реакцию нейтрофилов крови высокосенсибилизиро: ванных больных, страдающих активными формами первичного и вторичного сифилиса с высоким титром реагентов в КСР и антител в РИТ и РИФ.

Для каждой опытной и контрольной пробы микропипеткой набирают 0,08 мл исследуемой крови, и вносят в околодонную часть

пробирки (первую каплю отбрасывают). Для получения антикоагулирующего эффекта пробирки слегка встряхивают, закрывают пробками и ставят на 2 ч в термостат при 38°. Пробирку, взятую после инкубации для приготовления мазков, снова слегка в.стряхивают в целях равномерного распределения лейкоцитов во всем объеме крови. Из каждой пробы делают по .два мазка средней толщины. Для приготовления мазка используют химически чистые обезжиренные стекла. Подсушенные мазки подвергают в дальнейшем фиксации в спиртовом растворе нитрата кальция с добавлением к нему непосредственно перед фиксацией формалина (на каждые 100мл 96 этилового спирта берут 1,8 азотнокислотной меди; 0,9 азотнокислого кальция и 10 мл 40%-ного формалина). Спустя 40 мин после погружения мазков в фиксатор их .отмывают от формалина в 3-х порциях 96° спирта (по 10 мин в каждой порции). Подсохшие мазки окрашиваются по методике А. Л. Шабодаша (гистохимическая реакция на .гликоген).

Основные, этапы окрашивания: инкубация (20 - 25 мин) в растборе периодата при комнатной температуре; промывание (2 - 3 мин) в дистиллированной воде; погружение на 20 - 25 мин в реактив Шиффа; обработка в ЭРх порциях сернистой вОды (по 2 мин в каждой); трехкратное промывание в дистиллированной воде по 15 мин). Заключительный этап - докраска ядер гематоксилинэозином Эрпиха.

Оценка теста (показатель повреждения нейтрофилов ППН) предусматривает просмотр 100 нейтрофилов в контрольном и 100 в опытном мазках. При микроскопии нейтрофилы делят на две категории: нормальные и поврежденные с достаточно объективными проявлениями амебоидной реакции.

Результаты подсчета обрабатывают по формуле

00 .

где Н, -число поврежденных нейтрофилов в опыте;

Hi-число поврежденных нейтрофилов в контроле;

100 - количество просмотренных в мазке : . нейтрофилов.

Для подтверждения специфичности изменений нейтрофильных лейкоцитов при их сенсибилизации к трепонемальному антигену проведено электронномикроскопическое изучение нейтрофилов, инкубированных с указанным антигеном, а также электронномикро скопическое. изучение ультраозвученного трепонемного антигена.

С этой целью лейкоцитарную массу, выделенную из крови исследуемого больного, фиксируют в 2,5%-ном растворе глутаральдегида.45 мин с последующей дефиксацией

в 1%-ном растворе CoSO, на фосфатном буфере 60 мин при 4°С. Обезвоживание образца производят в спиртах возрастающей концентрации, абсолютном ацетоне и заливаю в аральдит или эпон-812. Срезы, полученные на ультрамикротоме LKB-4800, контрастируют уранилацетатом и нитратом свинца и просматривают в электронном микроскопе «JEM-7.

Нормальные нейтрофильные i лейкоциты характеризуются гладкой наружной мембра0 ной с единичными небольшими отростками и вдавливаниями. Ядро сегментировано и на ультратонких срезах состоит из двухтрех сегментов. Ядерное вещество равномерно распределено по нуклеоплазме с концентрацией хроматина по периферии ядра у оболочки. В оболочке видны немногочисленные ядерные поры. В цитоплазме .нейтрофилов встречаются в большом количестве рибосомы и полисомы, отдельные профили гранулярного эндоплазматического ретикулума

0 и митохондрии. Последние имеют обычную структуру, некоторые из них с расщепленным матриксом. Наиболее характерной структурой цитоплазмы нейтрофилов являются разнообразной величины, формы и электронной плотности секреторные гранулы.

Сенсибилизация нейтрофилов к трепонемному антигену вызывает выраженные изменения клеточной поверхности и внутриклеточных структур.

На наружной поверхности появляются

0 многочисленные отростки длиной до нескольких микрон, инвагинации цитоплазмы, образования типа псевдополий. Эти изменения видимо свидетельствуют об усилении фагоцитарной активности нейтрофилов. В цитоплазме нейтрофилов, инкубированных с тре5 понемальыым антигеном, появляются многочисленные вакуоли размером от 0,5 до 10 - 12 мкм, в отдельных случаях эти вакуоли занимают большую часть цитоплазмы. Содержимое вакуолей представляет собой элек, тронно-светлые поля, на фоне которых различаются частички, представляющие собой клеточный детрит, отдельные мембранные комплексы и другие структуры.

Проведенные электрйнномикроскопические исследования взвеси ультраозвученного |5 трепонемного антигена показывают, что он представляет собой различной величины обрывки мембран, клеточный детрит и другие структурные образования, встречаемые в вакуолях нейтро.фильных лейкоцитов.

В исследованной взвеси трепОнемального антигена структурные компоненты располагаются в гораздо большей концентрации, чем в вакуолях нейтрофилов, что объясняется значительным разведением антигена, используемого в реакции.

что нейтрофильиые лейкоциты больных с

врожденным сифилисом обладают способностью фагоцитировать частички трепонемного антигена.

Было обследовано 66 новорожденных, родившихся от матерей, больных сифилисом, и 18 новорожденных, родившихсяОт матерей с нормальным течением беременности. При этом все дети былн подразделены на 4 группы.

1Группа - дети с у.становленным диагнозом врожденного сифилиса (17);

2Группа - дети с косвенными признаками, стигматами врожденного сифилиса: сомнительные серологические реакции, кост.ные дистрофии, увеличение печени, селезенки, гипотрофия и пр. (16);

3Группа - дети без клинико-серологических -проявлений (33);

контрольная группа - здоровые новорожденные (18).

Сравнительные результаты приведены в табл. 1 и 2.

Сопоставление результатов исследования в указанных группах показывают, что самые высокие значения реакции ППН (от 0,11 - 0,4) у детей с установленным врождением сифилисом и в группе детей с косвенными признаками врожденного сифилиса, в то время как у новорожденных без клиникосерологических проявлений значения ППН приближены к результатам контрольной группы.

Из табл. 1 следует, что чем выше показатель повреждения нейтрофилов, тем вероятнее диагноз врожденного сифилиса.

Так, в группе детей с ранним врожденным сифилисом, подтвержденным положи-/

24 25,0 10,9 1 . 6,25 6,05 . П

326 78,8 7,2 39,0 4,94

11,1 7,4 Нет 16

88,9 7,А

тельными серологическими реакциями (группа I), ППН находится в пределах 0,2--О/. я выше. В контрольной группе такие показатели отсутствуют вообще.

Во 2:ОЙ группе (дети с косвенными признаками заболевания и отрицательными серологическими реакциями) показатель лишь у 4-х детей находится в пределах 0,01 -0,1, а у 12-ти (75 ± 12,5) в пределах 0,11-0,39. При статистической обработке данных в сравнении с контрольной группой различия показателей (р 5/о) удовлетворительно достоверны.

При сравнении данных первых двух групп по методу х различия показателей достоверны (р 0,05).

В 3-ей группе (дети без .клинико-серологических проявлений) показатель у 29-ти (87,8 ± 6,0) детей находился в пределах 0,01 -0,19, у четверых - 0,2 - 0,39. В контрольной группе ППН был в пределах 0,01 - 0,19 у 18-ти (100%) детей. При статистической обработке в сравнении третьей группы с контрольной результаты недостоверны.

Отсюда видно, что величина показателя соответствует форме заболевания (0,2 и выше - выраженные формы, 0,11 -0,39 - формы с косвенными признаками).

Предлагаемый способ дает возможность диагностировать сифилис на ранних стадиях, позволяя своевременно подвергнуть больного лечению.

Экономический эффект ранней диагностики выражается в возможности сэкономить медикаменты и сократитьсроки нахождения больного в стационаре.

Таблица I

76,5+10,24 23,5-|-10,2

68,75+11,6Нет

12,2+5,7Нет

-Нет

Формула изобретения

Способ диагностики сифилиса путем исследования нейтрофилов периферической крови, отличающийся тем, что, с целью ранней диагностики заболевания, кровь инкубируют с ультраозвученной бледной трепонемой и определяют показатель повреждения нейтрофилов и при показателях повреждеТаблица 2

ния нейтрофилов от 0,2 до 0,4 диагностируют выраженные признаки сифилиса, а при показателях повреждения нейтрофилов от 0,11 до 0,39 диагностируют косвенные признаки сифилиса.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 577018, кл..а 01 N 1/28, 1977.