СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В КОПРОФИЛЬТРАТАХ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/556 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, лабораторной диагностике и иммунологии и может быть использовано для определения специфических антител в копрофильтратах, в том числе при диагностике дисбиотических нарушений кишечника.

В настоящее время практически у 80% «условно здорового» населения планеты в той или иной степени присутствуют симптомы дисбиоза. Развивающийся дисбактериоз вызывает иммунологическую перестройку, приводит к снижению резистентности организма. Для коррекции дисбиоза важно определять наличие специфических антител. На основании полученных данных можно сделать вывод о течении дисбиотических нарушений в кишечнике, выявить контингент людей, который нуждается в коррекции дисбактериоза. Но в настоящее время отсутствуют способы определения специфических (мукозных) антител к индигенной микрофлоре, в частности к бифидобактериям и лактобактериям кишечника, которые являются основными представителями симбионтной микрофлоры кишечника. Поэтому разработка способов определения мукозных антител является актуальной задачей.

Цель изобретения - разработка способа определения специфических антител в копрофильтратах.

Поставленная цель достигается тем, что берут копропробы в количестве 0,8-1 г, разводят ее 0,9% раствором хлорида натрия (соотношении проба:раствор 1:2 (по объему)) и перемешивают. Затем центрифугируют пробу при 8000 об/мин в течение 15 минут, осуществляют отбор надосадочной жидкости и добавляют в нее 25-50 мкл отмытых формалинизованных эритроцитов барана. Через 25-30 минут пробу центрифугируют при 2500-3000 об/мин в течение 10 минут. Отбирают надосадочную жидкость, добавляют к ней равное количество 0,9% раствора хлорида натрия и затем раститровывают пробу на 8 и более лунок: в каждую лунку планшета вносят по 25 мкл 0,9% раствора хлорида натрия, в первую лунку вносят 25 мкл исследуемой пробы и затем раститровывают ее кратно двум в последующие лунки. После этого добавляют в каждую лунку по 25 мкл специфического эритроцитарного антигенного диагностикума. И через 1,5-2 часа и/или через 20-24 часа визуально определяют наличие или отсутствие специфических антител: если в лунке сформировался «зонтик» из эритроцитов - определяют наличие специфических антител, а при формировании «пуговицы» из эритроцитов - отсутствие специфических антител. При этом при формировании «зонтика» из эритроцитов в первой лунке определяют титр специфических антител как 1:4, а в следующих - 2-й и далее лунках - соответственно 1:8, 1:16 и т.д. Титр специфических антител в пробе регистрируют по последнему положительному результату (агглютинация эритроцитов в виде «зонтика»).

Поскольку не существует способов определения специфических антител в копрофильтратах, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ может быть использован в микробиологических, иммунологических, клинических лабораториях, в ветеринарии и при проведении научных исследований.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Способ осуществляется следующим образом.

У пациента отбирают свежую копропробу. Навеску копропробы в количестве 0,8-1,0 г производят на электронных весах. Разводят навеску 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:2 (проба:раствор по объему) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем пробу центрифугируют при 8000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость (в среднем 0,8-1,6 мл) пипеткой переносят в чистую пробирку и добавляют в нее 25-50 мкл отмытых формалинизированных эритроцитов барана. Инкубируют пробу при комнатной температуре в течение 25-30 минут (в течение этого времени происходит осаждение эритроцитов), затем пробу центрифугируют при 2,5-3 тыс.об/мин в течение 10 минут. Отбирают надосадочную жидкость и добавляют к ней равное количество 0,9% раствора хлорида натрия, т.е. пробу разводят в два раза, и раститровывают ее на 8 и более лунок (обычно на 8-12 лунок). В каждую лунку планшета вносят по 25 мкл 0,9% раствора хлорида натрия, в первую лунку вносят 25 мкл исследуемой пробы и затем раститровывают ее кратно двум в последующие лунки. После этого добавляют в каждую лунку по 25 мкл специфического антигенного диагностикума.

Все манипуляции осуществляют при комнатной температуре.

В качестве диагностических систем использовали эритроцитарные антигенные диагностикумы для определения специфических антител в сывороточном материале, полученные в соответствии с патентом РФ №2202801.

Для определения специфических антител к бифидобактериям в копрофильтратах в качестве специфического эритроцитарного антигенного диагностикума использовали диагностикум на основе бифидобактерий. Для определения специфических антител к лактобактериям в копрофильтратах в качестве специфического эритроцитарного антигенного диагностикума использовали диагностикум на основе лактобактерий.

Результаты реакции учитывали через 1,5-2 часа и/или через 20-24 часа: в лунках наблюдали формирование «зонтика» или «пуговицы». Если в лунке формировался «зонтик» из эритроцитов - определяли наличие антител, а при формировании «пуговицы» из эритроцитов - отсутствие антител.

При этом при формировании «зонтика» из эритроцитов титр специфических антител в первой лунке равен 1:4 (в связи с первоначальным разведением пробы 1:2), во второй - 1:8, в третьей - 1:16, в четвертой - 1:32 и т.д. (разведение кратно 2). Титр специфических антител в пробе регистрировали по последнему положительному результату (агглютинация эритроцитов, имеющая вид «зонтика»),

Параллельно с опытными пробами ставили контрольные образцы, содержащие специфические антитела в известных разведениях (положительный контроль) и не содержащие специфические антитела (отрицательный контроль). Для положительного контроля использовали иммунную кроличью сыворотку с титром антител 1:64 (кролики были вакцинированы бифидобактериями или лактобактериями по стандартной методике).

Пример 1. У пациента отбирали свежую копропробу. Навеску копропробы в количестве 0,8 г производили на электронных весах. Разводили навеску 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:2 (навеска:раствор по объему) и тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Затем пробу центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость пипеткой переносили в чистую пробирку и добавляли в нее 25 мкл отмытых формалинизированных эритроцитов барана. Через 25 мин (после осаждения эритроцитов) пробу центрифугировали при 2,5 тыс.об/мин в течение 10 минут. Отбирали надосадочную жидкость, добавляли в нее равное количество 0,9% раствора хлорида натрия и раститровывали ее на 8 лунок, как описано выше, затем добавляли в каждую лунку по 25 мкл эритроцитарного антигенного диагностикума на основе бифидобактерий.

Все манипуляции осуществляли при комнатной температуре.

Результаты реакции учитывали через 1,5 часа и через 20 часов. Через 1,5 часа в 1-5-й лунках наблюдали сформированные «зонтики» из эритроцитов. В 6-8-й лунках наблюдали «пуговицы» из эритроцитов. Таким образом, в пробе присутствуют специфические антитела к бифидобактериям. Титр антител равен 1:64.

Через 20 часов также в 1-5-й лунках наблюдали сформированные «зонтики» из эритроцитов, в 6-8-й лунках - «пуговицы». Титр специфических антител к бифидобактериям равен 1:64.

Пример 2. У пациента отбирали свежую копропробу. Навеску копропробы в количестве 1,0 г производили на электронных весах. Разводили навеску 2 мл 0,9% раствором хлорида натрия (соотношении навеска:раствор (по объему) равно 1:2) и тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Затем пробу центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость пипеткой переносили в чистую пробирку и добавляли в нее 50 мкл отмытых формалинизированных эритроцитов барана. Через 30 минут пробу центрифугировали при 3 тыс.об/мин в течение 10 минут. Отбирали надосадочную жидкость и добавляли в нее равное количество 0,9% раствора хлорида натрия и затем раститровывали ее на 12 лунок, как описано выше. В каждую лунку добавляли по 25 мкл эритроцитарного антигенного диагностикума на основе бифидобактерий.

Все манипуляции осуществляли при комнатной температуре.

Результаты реакции учитывали через 2 часа и через 24 часа.

Через 2 часа в 1-6-й лунках наблюдали сформированные «зонтики» из эритроцитов, в 7-й лунке нельзя было точно определить, что формируется, поэтому титр специфических антител к бифидобактериям определили как 1:128-1:256. В 8-12-й лунках наблюдали сформированные «пуговицы» из эритроцитов.

Через 24 часов в 1-7-й лунках наблюдали четко сформированные «зонтики» из эритроцитов, в 8-12-й лунках - четко наблюдали «пуговицы» из эритроцитов. Таким образом, в пробе присутствуют специфические антитела к бифидобактериям. Титр специфических антител к бифидобактериям 1:256.

Пример 3. У пациента отбирали свежую копропробу. Навеску копропробы в количестве 0,8 г производили на электронных весах. Разводили навеску 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:2 (навеска:раствор по объему) и тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Затем пробу центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость пипеткой переносили в чистую пробирку и добавляли в нее 25 мкл отмытых формалинизированных эритроцитов барана. Через 25 минут (после осаждения эритроцитов) пробу центрифугировали при 2,5 тыс.об/мин в течение 10 минут. Отбирали надосадочную жидкость, добавляли в нее равное количество 0,9% раствора хлорида натрия, раститровывали ее на 8 лунок, как описано выше. Затем добавляли в каждую лунку по 25 мкл эритроцитарного антигенного диагностикума на основе бифидобактерий.

Все манипуляции осуществляли при комнатной температуре. Результаты реакции учитывали через 1,5 часа и через 20 часов. Через 1,5 часа в 1-8-й лунках наблюдали сформированные «пуговицы» из эритроцитов.

Через 20 часов в 1-8-й лунках также наблюдали сформированные «пуговицы» из эритроцитов. Таким образом, в данной пробе отсутствуют специфические антитела к бифидобактериям.

Пример 4. У пациента отбирали свежую копропробу. Навеску копропробы в количестве 0,8 г производили на электронных весах. Разводили навеску 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:2 (навеска:раствор по объему) и тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Затем пробу центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость пипеткой переносили в чистую пробирку и добавляли в нее 25 мкл отмытых формалинизированных эритроцитов барана. Через 25 минут после осаждения эритроцитов пробу центрифугировали при 2,5 тыс.об/мин в течение 10 минут. Отбирали надосадочную жидкость, добавляли в нее равное количество 0,9% раствора хлорида натрия и раститровывали ее на 8 лунок, как описано выше. Затем в каждую лунку добавляли по 25 мкл эритроцитарного антигенного диагностикума на основе лактобактерий.

Все манипуляции осуществляли при комнатной температуре.

Результаты реакции учитывали через 1,5 часа и через 20 часов.

Через 1,5 часа в 1 и 2-й лунках сформировались «зонтики» из эритроцитов. В 3-8-й лунках сформировались «пуговицы» из эритроцитов.

Таким образом, в пробе присутствуют специфические антитела к лактобактериям. Титр специфических антител к лактобактериям равен 1:8.

Через 20 часов также наблюдаются в 1 и 2-й лунках «зонтики» из эритроцитов, в 3-8-й лунках - «пуговицы». Таким образом, титр специфических антител к лактобактериям равен 1:8.

Пример 5. У пациента отбирали свежую копропробу. Навеску копропробы в количестве 1,0 г производили на электронных весах. Разводили навеску 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:2 (навеска:раствор по объему) и тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Затем пробу центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость пипеткой переносили в чистую пробирку и добавляли в нее 50 мкл отмытых формалинизированных эритроцитов барана. Через 30 минут (после осаждения эритроцитов) пробу центрифугировали при 3 тыс.об/мин в течение 10 минут. Отбирали надосадочную жидкость, добавляли в нее равное количество 0,9% раствора хлорида натрия и раститровывали ее на 12 лунок, как описано выше. В каждую лунку добавляли по 25 мкл эритроцитарного антигенного диагностикума на основе лактобактерий.

Все манипуляции осуществляли при комнатной температуре.

Результаты реакции учитывали через 2 часа и через 24 часа.

Через 2 часа в 1 и 2-й лунках сформировались «зонтики» из эритроцитов, в 3-й лунке было нельзя точно определить, что формируется - «зонтик» или «пуговица». В 4-12-й лунках сформировались «пуговицы» из эритроцитов. Таким образом, в пробе присутствуют специфические антитела к лактобактериям. Титр специфических антител к лактобактериям определили как 1:8-1:16.

Через 24 часов в 3-й лунке четко наблюдается «зонтик» из эритроцитов (что соответствует титру антител 1:16), в 4-12-й лунках - четко наблюдаются «пуговицы» из эритроцитов. Таким образом, титр специфических антител к лактобактериям равен 1:16.

Пример 6. У пациента отбирали свежую копропробу. Навеску копропробы в количестве 1,0 г производили на электронных весах. Разводили навеску 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:2 (навеска:раствор по объему) и тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Затем пробу центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость пипеткой переносили в чистую пробирку и добавляли в нее 50 мкл отмытых формалинизированных эритроцитов барана. Через 30 минут (после осаждения эритроцитов) пробу центрифугировали при 3 тыс.об/мин в течение 10 минут. Отбирали надосадочную жидкость, добавляли в нее равное количество 0,9% раствора хлорида натрия и раститровывали ее на 12 лунок, как описано выше. Затем в каждую лунку добавляли по 25 мкл эритроцитарного антигенного диагностикума на основе лактобактерий.

Все манипуляции осуществляли при комнатной температуре.

Результаты реакции учитывали через 2 часа и через 24 часа.

Через 2 часа в 1-12-й лунках сформировались «пуговицы» из эритроцитов.

Через 24 часов в 1-12-й лунках наблюдаются «пуговицы» из эритроцитов. Таким образом, в данной пробе отсутствуют специфические антитела к лактобактериям.

Предлагаемый способ использовали при определении антител к бифидо- и лактобактериям в копрофильтратах как у людей - у детей (от рождения) и взрослых (всего 518 копропроб), так и у животных (собаки, кошки) - 12 проб.

Предлагаемый способ позволяет определять наличие или отсутствие специфических антител в копрофильтратах человека и животных, а также их титр. Способ позволяет выявить очень высокие и низкие концентрации специфических антител, при этом способ быстрый, неинвазивный, доступный, прост в исполнении. Определяя наличие или отсутствие специфических антител в копрофильтратах, можно сделать вывод о течении дисбиотических нарушений в кишечнике.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, лабораторной диагностике и иммунологии и может быть использовано для определения специфических антител в копрофильтратах, в том числе при диагностике дисбиотических нарушений кишечника. Сущность: берут копропробу в количестве 0,8-1 г, разводят ее 0,9% раствором хлорида натрия в соотношении 1:2 (по объему), перемешивают, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 15 минут, отбирают надосадочную жидкость и добавляют в нее 25-50 мкл отмытых формалинизированных эритроцитов барана, осаждают эритроциты в течение 25-30 минут, центрифугируют пробу при 2500-3000 об/мин в течение 10 минут, отбирают надосадочную жидкость и добавляют в нее равное количество 0,9% раствора хлорида натрия. После этого раститровывают пробу на 8 и более лунок, при этом в каждую лунку планшета вносят по 25 мкл 0,9% раствора хлорида натрия, затем в первую лунку вносят 25 мкл исследуемой пробы, после чего раститровывают ее кратно двум в последующие лунки. Затем добавляют в каждую лунку по 25 мкл специфического эритроцитарного антигенного диагностикума. В качестве специфического эритроцитарного антигенного диагностикума используют антигенный диагностикум на основе бифидобактерий или на основе лактобактерий. Через 1,5-2 часа и/или через 20-24 часа визуально определяют специфические антитела: при формировании в лунке «зонтика» из эритроцитов определяют наличие специфических антител. При формировании «пуговицы» из эритроцитов - отсутствие специфических антител. При этом при формировании «зонтика» из эритроцитов титр специфических антител равен 1:4 в первой лунке, 1:8 - во-второй, 1:16 - в третьей и т.д. (разведение кратно 2). Способ позволяет определять отсутствие или наличие, а также титр специфических антител в копрофильтратах человека и животных. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ определения специфических антител в копрофильтратах, включающий взятие копропробы в количестве 0,8-1 г, разведение ее 0,9%-ным раствором хлорида натрия в соотношении 1:2 (по объему), перемешивание пробы, центрифугирование ее при 8000 об/мин в течение 15 мин, отбор надосадочной жидкости и добавление в нее 25-50 мкл отмытых формалинизированных эритроцитов барана, осаждение эритроцитов в течение 25-30 мин, центрифугирование при 2500-3000 об/мин в течение 10 мин, отбор надосадочной жидкости, добавление в нее равного количества 0,9%-ного раствора хлорида натрия, и раститровывание пробы на 8 и более лунок, при этом в каждую лунку вносят по 25 мкл 0,9%-ного раствора хлорида натрия, затем в первую лунку вносят 25 мкл исследуемой пробы, после чего раститровывают ее кратно двум в последующие лунки, затем добавляют в каждую лунку по 25 мкл специфического эритроцитарного антигенного диагностикума и визуально определяют через 1,5-2 ч и/или через 20-24 ч специфические антитела: при формировании в лунке «зонтика» из эритроцитов определяют наличие специфических антител, при этом титр специфических антител в первой лунке равен 1:4, во - второй 1:8, в третьей - 1:16 и т.д., а при формировании «пуговицы» из эритроцитов определяют отсутствие специфических антител.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве специфического эритроцитарного антигенного диагностикума используют антигенный диагностикум на основе бифидобактерий.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве специфического эритроцитарного антигенного диагностикума используют антигенный диагностикум на основе лактобактерий.