СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО ГИДРОЛИЗАТА Российский патент 2009 года по МПК C12N1/16 A23J1/18 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при производстве питательных сред для выделения и культивирования микроорганизмов.

Известен способ получения белковых гидролизатов из биомассы дрожжей путем аутолиза (см. статью Дятлов И.А. и др. «Разработка препаратора дрожжевого аутолизата - заменителя мясной питательной основы для микробиологических сред», сборник Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран Содружества Независимых Государств, 1998 г., стр.184-186).

Однако в виду того, что аутолизат дрожжей - продукт переваривания их без внешних ферментов за счет собственных (пепсиназы, триптазы, эриптазы), последние невозможно дозировать и вносить в гидролизуемую смесь в заданных временных точках. Причем каждый из вышеуказанных ферментов имеет свои оптимум рН и свою специфичность при взаимодействии с белковой молекулой в отношении разрыва пептидных связей. Получаемые в результате такой реакции пептиды имеют различную молекулярную массу, длину и степень полимерности. Эти обстоятельства приводят к тому, что скорость и степень усвоения таких пептидов бактериями достаточно вариабельна, что затрудняет стандартизацию сред на основе аутолизатов.

Наиболее близким по технологическому решению является способ получения белковых гидролизатов из биомассы дрожжей (см. авт.св. СССР №649745, кл. С12D 13/06, А23J 1/18. 28.02/79. Б8), заключающийся в том, что для получения гидролизата используют последовательно в два этапа ферменты Actinomyces cinerosus 3а и «Протосубтилином Г- 3х» для расщепления клеточных белков и высокомолекулярных полипептидов, а из рода Actinomyces применяют штамм Actinomyces cinerosus 3а.

Недостатком указанного способа является: многоступенчатость процесса гидролиза, необходимость использования в работе сложного оборудования (центрифуг, лиофилизатора), применения малодоступных вследствие их мелкосерийного производства «Протосубтилина Г- 3х», дрожжелитического ферментного препарата Actinomyces cinerosus 3а и кормовых дрожжей Candida guillieroudii - основного субстрата для проведения гидролиза. Эти обстоятельства усложняют способ, а отсутствие примеров использования полученных белковых гидролизатов по известной технологии не дают представления о применении их в качестве питательных сред с широкими технологическими возможностями при культивировании разных микроорганизмов.

Техническая задача предполагаемого изобретения состояла в упрощении способа получения белкового гидролизата, используемого в качестве основы для питательных сред при культивировании микроорганизмов.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения белковых гидролизатов из биомассы дрожжей путем ферментативного гидролиза с последующим инкубированием при 45°С и коррекцией рН 20% раствором гидроокиси натрия, гидролиз проводят в одну стадию, используя в качестве ферментного препарата - панкреатин крупного рогатого скота сухой, который вносят в емкости из расчета 0,14 г на один литр гомогенной суспензии дрожжей, при этом полученную смесь тщательно перемешивают, инкубируют, осуществляют контроль и коррекцию рН до 8,3, а завершают процесс при достижении значения показателя аминного азота не ниже 2,2%, исключая затем дальнейшее его нарастание в течение последующих шести часов, после этого гидролизат осветляют при комнатной температуре, надосадочную жидкость декантируют и проводят консервацию.

При этом гомогенную суспензию получают путем измельчения прессованных хлебопекарных дрожжей, которые вносят в прогретые до 45°С емкости и добавляют очищенную подогретую до 45°С воду из расчета (4:1) частей воды к дрожжам с последующим перемешиванием, при этом к полученной суспензии добавляют хлороформ в соотношении (100:1), перемешивают содержимое емкости и устанавливают значение рН 8,3.

Кроме того, коррекцию и контроль рН от момента внесения фермента осуществляют в течение первых четырех часов, каждые 20 минут, затем в связи с нарастанием буферной емкости с интервалом один час, а после девятичасового гидролиза с трехчасовым интервалом до окончания процесса.

Способ осуществляется следующим образом

Прессованные хлебопекарные дрожжи (ГОСТ 171-81) измельчают и вносят их в прогретые до 45°С емкости (например, 20 л), затем туда добавляют очищенную, подогретую до 45°С воду (из расчета 4 части воды на 1 часть дрожжей). После этого емкость закрывают, перемешивают содержимое до получения гомогенной суспензии. В последнюю вносят хлороформ в соотношении 100:1, вновь перемешивают и устанавливают значение рН суспензии равным 8,3 с помощью 20% раствора гидроокиси натрия.

Затем проводят гидролиз, в одну стадию для этого в суспензию дрожжей вносят панкреатин крупного рогатого скота сухой (ОСТ 49167-92) из расчета 0,14 г на 1 литр упомянутой суспензии, перемешивают, закрывают емкости крышками и инкубируют при 45°С. При этом, следует отметить, что 0,14 панкреатина является величиной необходимой и достаточной, обоснованной опытными данными. Причем количественное уменьшение фермента замедляет процесс, регистрируя неполный гидролиз белков о чем свидетельствует невысокий показатель аминного азота, а увеличение не дает преимуществ ни в скорости, ни в глубине гидролиза.

При этом, в течение первых четырех часов суспензию дрожжей перемешивают с интервалом 20 минут, начиная с пятого часа до окончания гидролиза интервал между перемешиваниями составляет один час. Контроль и коррекцию рН до значения 8,3 осуществляют также 20% раствором гидроокиси натрия каждые 20 минут в течение четырех часов от момента внесения фермента, а затем с интервалом один час вследствие нарастания буферной емкости гидролизуемой суспензии. Начиная с 9 часа и до окончания гидролиза контроль рН и при необходимости его коррекцию осуществляют с трехчасовым интервалом.

В процессе переваривания суспензии пекарских дрожжей через каждые два часа проводят определение аминного азота, который является основным критерием гидролиза, (потому как накопление аминокислот и пептидов определяют по количеству аминного азота). Опытным путем было обнаружено, что достаточно определения одного критерия - аминного азота и тенденция роста его подтверждает, что процесс гидролиза идет. В связи с этим в предложенном способе достаточно проводить оптимизацию на аминному азоту для гидролизата, имеющего стандартные показатели. Последние обеспечены стандартным сырьем - хлебопекарскими дрожжами и стандартным ферментным препаратом.

Гидролиз считают завершенным, если показатель аминного азота достиг значения не менее 2,2% и в дальнейшем не нарастает в течение шести часов. Ориентировочная длительность гидролиза составляет 15-18 часов.

Полученный гидролизат осветляют методом отстаивания при комнатной температуре до формирования плотного осадка. Затем надосадочную жидкость декантируют, разливают в емкости. С целью консервации полученного продукта в емкости с ним добавляют хлороформ из расчета 5 мл/1 л гидролизата, после чего емкости герметизируют и хранят при температуре (2-25)°С, срок хранения 2 года.

Физико-химические показатели полученного по предлагаемому способу белкового гидролизата должны быть следующими: рН (8,3±0,2), общий азот (9,3±2,1)%, аминный азот (2,85±0,65) %, содержание хлорида натрия (0,46±0,15)%, углеводы (0,04±0,015)%, свободный триптофан (0,107±0,004)%, нуклеиновые кислоты (0,002±0,0005)%, содержание витамина B₁ (0,000045±0,000003)%, содержание витамина В₂ (0,000051±0,000004)%, содержание витамина РР (0,00086±0,00003)%.

Биологические показатели приготовленного по предлагаемому способу белкового гидролизата определяют путем бактериологического контроля питательных сред для культивирования микроорганизмов на его основе.

ПРИМЕР 1.

Готовят питательную среду для культивирования и выделения холерного вибриона следующего состава: белкового гидролизата, полученного по предлагаемому способу, - 0,05% (по аминному азоту), NaCl - 0,4%, Na₂HPO₄ 12 Н₂О - 0,6%. агара микробиологического - 1,3%, рН (7,8±0,2). Среду стерилизуют при 110°С 20 минут. Приготовленная среда характеризуется следующими биологическими показателями в отношении тест-штаммов холерного вибриона Vibrio cholerae P-1 (145), V.cholerae eitor M -878, V.cholerae non O1/non O139 Р-9741 через 12 часов культивирования при 37°С (см. таблицу 1).

Из таблицы видно, что среда приготовления из полученного по предлагаемому способу белкового гидролизата полностью соответствуют требованиям МУ 3.3.2.2124-06 «Медицинские иммунобиологические препараты. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, брецеллеза, легионеллеза».

ПРИМЕР 2.

Готовят питательную среду для культивирования чумного микроба при 28°С следующего состава: белкового гидролизата, полученного по предлагаемому способу, - 0,08% (по аминному азоту), NaCl - 0,3%, Na₂HPO₄·12 Н₂О - 0,6%, агара микробиологического - 1,4%, рН (7,2±0,1). Среду стерилизуют при 110°С 20 минут. Приготовленная среда характеризуется следующими биологическими показателями в отношении тест-штамма Yersinia pestis EV 1290 через 48 часов культивирования при 28±1°С (см. таблицу 2).

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют, что среда приготовления из полученного по предлагаемому способу белкового гидролизата полностью соответствуют требованиям МУ 3.3.2.2124-06.

ПРИМЕР 3.

Готовят питательную среду для культивирования сибиреязвенного микроба следующего состава: белкового гидролизата, полученного по предлагаемому способу, - 0,09% (по аминному азоту), NaCl - 0,5%, Na₂HPO₄·12 Н₂О - 0,3%, агара микробиологического - 1,4%, рН (7,2±0,1). Среду стерилизуют при 110°С 20 минут. Приготовленная среда характеризуется следующими биологическими показателями в отношении тест-штамма Bacillus anthracis СТИ - 1 через 21±3 часа культивирования при 35°С (см. таблицу 3).

Сравнивая показатели (см. таблицу 3): чувствительности, прорастания, диаметра колоний и их морфологии с требованиями МУ 3.3.2.2124 - 06, приходим к выводу, что они соответствуют этим требованиям.

Таким образом, преимущества панкреатического гидролиза пекарских дрожжей - это управляемость и прогнозируемость, возможность дозирования фермента и оптимизации соотношения фермент- субстрат. Мягкость действия панкреатина на белки значительно снижает опасность рацемизации аминокислот и образования вторичных продуктов; узкая специфичность действия трипсина (гидролизует только пептидные связи, образованные основными аминокислотами - лизином и аргинином); достаточно глубокое расщепление им дрожжевых белков с образованием низкомолекулярных пептидов и отдельных аминокислот, хорошо усваиваемых микробными клетками при минимальных затратах энергии на мобилизацию клеточных депептидаз; высокая активность компонентов панкреатина - амилазы и липазы, что значительно снижает концентрацию липидов и полисахаридов в конечном продукте, создает условия для его хорошей осветляемости и возможности использовать в составе сред с индикаторами, сохранение в гидролизате основных нуклеотидов и витаминов группы В, необходимых для стимуляции роста бактерий. Изложенные аргументы в пользу панкреатического переваривания пекарских дрожжей позволили впервые показать, что полученная таким образом питательная основа обеспечивает возможность культивирования и выделения большого круга микроорганизмов, являясь достойной альтернативой традиционным мясным пептонам и триптонам.

Использование предлагаемого способа позволяет проводить гидролиз биомассы дрожжей простым способом в одну стадию с использованием одного ферментного препарата - панкреатина крупного рогатого скота сухого, что дает возможность получать основу для питательных сред с широкими технологическими возможностями при культивировании различных микроорганизмов, например холерного вибриона, чумного и сибиреязвенного микробов.

При этом в качестве субстрата используются повсеместно доступные, широко применяемые в хлебопекарном производстве, недорогие, стандартизированные прессованные хлебопекарные дрожжи, а фермент - панкреатин крупного рогатого скота сухой выпускается большинством мясоперерабатывающих предприятий, имеет невысокую себестоимость и также стандартизирован в соответствии с требованиями отрасли.

Таблица 1 Показатели Среда, приготовленная из полученного по предлагаемому способу белкового гидролизата Требования МУ 3.3.2.2124-06   Тест штаммы V. cholerae Тест штаммы V. сholerae   145 (Р-1) М-878 Р-9741 145 (Р-1) М-878 Р-9741 Чувствительность (м.к.) 10,0 10,0 10,0 Не ниже 10,0 Показатель прорастания (%) 36,3±2,7 42,2±3,8 37,5±2,1 Не менее 30 Диаметр колоний (мм) 1,4±0,2 2,2±0,2 2,5±0,3 Не менее 1,0   Гладкие, прозрачные, голубоватые Гладкие, полупрозрачные, голубоватые Гладкие, прозрачные, голубоватые Гладкие, полупрозрачные, голубоватые

Таблица 2 Показатели Среда, приготовленная из полученного по предлагаемому способу белкового гидролизата Требования МУ 3.3.2.2124-06 Чувствительность (м.к.) 10,0 Не ниже 10,0 Показатель прорастания (%) 54,6±4,2 Не менее 50 Диаметр колоний (мм) 1,4±0,2 Не менее 1,0 Морфология колоний Колонии зернистые, пигментированные, бугристые с периферической кружевной зоной Колонии зернистые, пигментированные, бугристые с периферической кружевной зоной

Таблица 3 Показатели Среда, приготовленная из полученного по предлагаемому способу белкового гидролизата Требования МУ 3.3.2.2124-06 Чувствительность (м.к.) 10,0 Не ниже 10,0 Показатель прорастания (%) 59,7±4,7 Не менее 50 Диаметр колоний (мм) 2,8±0,2 Не менее 2,0 Морфология колоний Колонии шероховатые серовато-белого цвета с ворсистым краем в виде «гривы льва» (R-форма) Колонии шероховатые серовато-белого цвета с ворсистым краем в виде «гривы льва» (R-форма)

Способ получения белкового гидролизата включает ферментативный одностадийный гидролиз биомассы хлебопекарных дрожжей, последующее перемешивание, инкубирование при 45°С, осуществляют контроль и коррекцию рН до 8,3. В качестве ферментного препарата используют панкреатин крупного рогатого скота сухой в количестве 0,14 г на один литр гомогенной суспензии дрожжей. Процесс завершают при достижении значения показателя аминного азота не ниже 2,2%. Полученный гидролизат осветляют при комнатной температуре. Надосадочную жидкость декантируют и проводят консервацию. Способ позволяет получить белковый гидролизат со следующими показателями: общий азот (9,3±2,1)%, аминный азот (2,85±0,б5)%, углеводы (0,04±0,015)%, свободный триптофан (0,107±0,004)% нуклеиновые кислоты (0,002±0,0005)%, витамин B₁ (0,000045±0,000003)%, витамин В₂ (0,000051±0,000004)%, витамин РР (0,00086±0,00003)%. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения белковых гидролизатов из биомассы дрожжей путем ферментативного гидролиза с последующим инкубированием при 45°С и коррекцией рН раствором гидроокиси натрия, отличающийся тем, что гидролиз проводят в одну стадию, используя в качестве ферментного препарата - панкреатин крупного рогатого скота сухой, который вносят в емкости из расчета 0,14 г на один литр гомогенной суспензии дрожжей, при этом полученную смесь тщательно перемешивают, инкубируют, осуществляют контроль и коррекцию рН до 8,3, а завершают процесс при достижении значения показателя аминного азота не ниже 2,2, после этого гидролизат осветляют при комнатной температуре, надосадочную жидкость декантируют и проводят консервацию.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомогенную суспензию получают путем измельчения прессованных хлебопекарных дрожжей, которые вносят в прогретые до 45°С емкости и добавляют очищенную подогретую до 45°С воду из расчета (4:1) частей воды к дрожжам с последующим перемешиванием, при этом к полученной суспензии добавляют хлороформ в соотношении (100:1), перемешивают содержимое емкости и устанавливают значение рН 8,3.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что коррекцию и контроль рН, от момента внесения фермента, осуществляют в течение первых четырех часов каждые 20 минут, затем - с интервалом один час, а после девятичасового гидролиза с трехчасовым интервалом до окончания процесса.