СОСТАВ КОНСЕРВИРУЮЩЕЙ ДОБАВКИ К КОНТРОЛЬНЫМ МАТЕРИАЛАМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫМ ПРИ СЕРОДИАГНОСТИКЕ СИФИЛИСА Российский патент 2011 года по МПК A61K31/70 A61K47/42 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и может быть использовано при создании контрольных материалов для серологической диагностики сифилитической инфекции.

Для качественного осуществления серологической диагностики сифилиса применяется технология внутрилабораторного контроля качества (ВлКК). ВлКК представляет собой систему мероприятий, проводимых на регулярной основе, направленных на проверку правильности выполнения серологических исследований и предотвращение возможности ошибок диагностики. Средством измерения, позволяющим оценивать качество проведения исследований, являются контрольные материалы (КМ), содержащие («положительный» контроль) или не содержащие («отрицательный» контроль) антитела к возбудителю сифилиса - Т.pallidum.

Наиболее адекватным для проведения ВлКК при серодиагностике сифилиса в настоящее время признаются КМ, выпускаемые в жидком виде и приготовленные на основе естественной биологической матрицы - сыворотки крови больного сифилисом или здорового человека [ISO 15194]. Вместе с тем необходимым условием для осуществления мероприятий ВлКК является длительное сохранение в КМ постоянного уровня специфических антител к возбудителю сифилиса, то есть сохранение их «специфической активности».

В настоящее время известно большое количество реагентов химической природы, которые при добавлении к биологическим растворам, содержащим специфические иммуноглобулины, обеспечивают их стерильность и сохранение специфической активности. К числу подобных средств относятся ртутьсодержащие реагенты (мертиолят), борная кислота, диметилсульфоксид, азид натрия, ProCline, антибиотики, бронидокс и другие.

Однако не все из указанных реагентов могут быть применены для создания КМ, используемых при серодиагностике сифилиса. Так, азид натрия в рекомендуемых концентрациях (0,1%) может оказывать выраженное бактерицидное действие и способствовать сохранению специфической активности антител в КМ, но он может также инактивировать фермент пероксидазу хрена, а именно этот фермент наиболее часто используется для синтеза конъюгата в иммуноферментном анализе (Масяго А.В, 1997). Применение препаратов, содержащих соли ртути, ограничено в связи с их токсичностью в соответствии с рекомендациями ВОЗ, Европейского Фармакологического комитета, Американского агентства по контролю над пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) и Национального органа по контролю над качеством медицинских иммунобиологических препаратов Российской Федерации (Комитет МИБП). Борная кислота также зарекомендовала себя в качестве реагента, небезопасного для здоровья человека. Растворы антибиотиков характеризуются низкой стабильностью в растворе и быстро подвергаются инактивации при длительном хранении. Таким образом, состав консервирующих добавок, используемых при создании КМ для серодиагностики сифилиса, нуждается в существенной доработке.

В 2007 году в ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий» была разработана и прошла регистрацию в Российской Федерации экспертная панель контрольных сывороток «ЭП СИФИЛИС», предназначенная для проведения мероприятий ВлКК и внешнего контроля качества серодиагностики сифилиса. Панель приготовлена на основе сывороток крови человека (больных сифилисом и здоровых людей) и состоит из 4 образцов, 2 из которых содержат антитела к возбудителю сифилиса в разной концентрации («положительная» часть панели) и 2 - не содержат таких антител («отрицательная» часть панели). В качестве консервирующей добавки, позволявшей на протяжении 6 месяцев сохранять первоначальный уровень антител к Т.pallidum в контрольных сыворотках «положительной части» панели, был использован реагент ProCline-300 (Supelco, США, кат. №48126(1). Однако срок годности панели, равный 6 месяцам, является недостаточным, особенно для КМ, входящих в состав расширенных экспертных (квалификационных) панелей, требующих для своего создания длительного времени и значительных материальных затрат, связанных с подбором образцов биологического материала. В связи с вышеизложенным актуальной в настоящее время является разработка консервирующей добавки к КМ, обеспечивающей более длительное сохранение их специфической активности.

Известно, что в процессе длительного хранения белки сыворотки крови человека подвергаются деградации. Одной из важных причин, определяющих снижение активности специфических иммуноглобулинов в образцах сыворотки крови при их хранении в незамороженном виде, является присутствие нативных ферментов, обладающих протеолитической активностью (Lau P.P. et al, 1990; Hsieh S.Y. et al., 2000; Yi J. et al., 2007).

Протеолитические ферменты (протеазы) попадают в сыворотку крови из органов и тканей, в которых осуществляется синтез этих ферментов, например из печени, поджелудочной железы и других органов. Кроме того, в образце цельной крови протеолитические ферменты накапливаются в процессе его хранения в результате естественного разрушения форменных элементов крови (клетки лейкоцитарного ряда, содержащие гранулы с активными ферментами) или за счет бактериальной контаминации образца крови.

Для решения проблемы длительного хранения КМ, содержащих белковые растворы, обладающие специфической иммунной активностью, необходима разработка стабилизирующих добавок, способных ингибировать протеолитическое воздействие ферментов сыворотки крови, например, таких как антитрипсины.

Антитрипсины (antitrypsins) представляют собою группу сывороточных белков из состава альбуминовой фракции, которые являются естественными ингибиторами трипсиноподобных протеаз у многих позвоночных животных. Одним из коммерческих вариантов этого реагента является препарат альфа₁-антитрипсин, характеризующийся большим разнообразием входящих в его состав активных изоформ (у человека имеется несколько десятков антитрипсинов). При этом следует учитывать, что добавление подобных реагентов может приводить к некоторому искажению результатов контрольного тестирования, что необходимо учитывать при выборе качественного и количественного состава используемых ингибиторов протеаз, который не оказывал бы влияния на специфическую активность конечного продукта (КМ).

Определенное защитное действие на белки сыворотки крови оказывает ряд углеводов. При замораживании растворов белков и их последующей лиофиолизации в качестве стабилизирующих веществ часто добавляют различные многоатомные сахара. Самым распространенным стабилизатором является сахароза, однако имеются сведения, что наилучшими свойствами обладает другой углевод - трегалоза, представляющий собой дисахарид, состоящий из двух молекул глюкозы (Chang L.L. et al., 2005; Han Y. et al., 2007). Имеются сообщения о протективных свойствах сахаров для сохранения стабильности белковых молекул и в виде растворов.

Технической задачей настоящего изобретения является разработка консервирующей добавки, обеспечивающей длительное сохранение специфической активности КМ для серодиагностики сифилиса, приготовленных в нативной форме на основе образцов сыворотки крови, полученных от больных различными формами сифилитической инфекции и здоровых доноров крови.

Эта задача достигается за счет того, что к образцам сыворотки крови сразу после их получения последовательно добавляют химические реагенты в соответствии с разработанным составом и последовательностью их внесения: альфа₁-антитрипсин из расчета 0,5 ЕД на 100 мл сыворотки крови, дисахарид трегалозу в конечной концентрации 1% и ProCline-300 в конечной концентрации 0,1%. Каждый последующий реагент вносят после полного растворения предыдущего, для чего осуществляют тщательное перемешивание полученного раствора. Полученный препарат укупоривают стерильной ватно-марлевой пробкой и оставляют в холодильнике при +(4-8)°С на 8-10 часов. Препарат подвергают стерилизующей фильтрации через наборы фильтров с величиной пор 0,8-0,45-0,22 мкм и в стерильных условиях разливают на аликвоты по 0,5 мл в стерильные завинчивающиеся пробирки объемом 1,5-2,0 мл.

Техническим результатом применения разработанного состава консервирующей добавки является инактивация протеолитических ферментов в сыворотке крови, создание оптимальных условий для сохранения специфической активности иммуноглобулинов в растворе и обеспечение условий стерильности, что гарантирует сохранение в КМ специфической активности иммунных антител на уровне 90-93% от первоначального значения в течение не менее 13 месяцев хранения при температуре +(4-8)°С.

Преимущества предлагаемого состава реагентов:

- КМ, приготовленные с применением разработанного состава консервирующей добавки, сохраняются в нативном (жидком) виде, и готовы для применения;

- условия хранения КМ при температуре +(4-8)°С имеются и могут быть обеспечены в любой клинико-диагностической лаборатории и/или аптечном складе;

- применение разработанного состава консервирующей добавки и последовательности внесения составляющих ее реагентов позволяет гарантированно сохранять специфическую активность КМ, приготовленных на основе сыворотки крови человека, на уровне 90-93% от первоначального аттестованного значения в течение не менее 13 месяцев хранения;

- сохранение специфической активности КМ в течение длительного времени позволяет использовать данные КМ для проведения мероприятий внутрилабораторного и внешнего контроля качества, а также при сравнительных испытаниях наборов реагентов для серологических методов исследования, выпускаемых различными производителями;

- разработанный состав консервирующей добавки не содержит реагентов, оказывающих негативное влияние на здоровье лабораторных работников.

Изобретение осуществляют следующим образом.

От больных сифилисом или здоровых доноров, предварительно обследованных на наличие и уровень активности антител, ассоциированных с сифилитической инфекцией, и не имеющих указаний на инфицирование гепатитами В и С человека, а также ВИЧ_1,2, путем венепункции получают образцы крови. Забор крови производится в пробирки или пластиковые емкости для сбора крови без применения антикоагулянтов. Полученные образцы, содержащие или не содержащие антитела к антигенам возбудителя сифилиса, инкубируют 30 минут в термостате при 37°С для формирования сгустка крови и подвергают первичному фракционированию в лабораторной центрифуге в течение 15-20 минут со скоростью вращения ротора 2500-3000 оборотов в минуту.

Полученную сыворотку крови немедленно переносят в отдельную стерильную мерную емкость и подвергают термической инактивации при температуре +56°С в течение 3 часов в соответствии с общепринятыми правилами для обеспечения условий биобезопасности при работе с образцами.

По окончании процесса инактивации сыворотку крови охлаждают до комнатной температуры (18-25°С) и добавляют в ее состав альфа₁-антитрипсин из расчета 0,5 ЕД на 100 мл сыворотки крови, раствор тщательно перемешивают. Перемешивание осуществляют на магнитной мешалке. После полного растворения альфа₁-антитрипсина добавляют трегалозу в конечной концентрации 1% и раствор тщательно перемешивают. После полного растворения трегалозы к имеющемуся объему сыворотки добавляют реагент ProCline-300 в конечной концентрации 0,1%; раствор тщательно перемешивают. Емкость с полученным препаратом укупоривают стерильной ватно-марлевой пробкой и оставляют в холодильнике при +(4-8)°С на 8-10 часов.

Приготовленный КМ подвергают стерилизующей фильтрации через наборы фильтров с величиной пор 0,8-0,45-0,22 мкм и в стерильных условиях разливают на аликвоты в стерильные завинчивающиеся пробирки. Пробирки маркируют и хранят в бытовом холодильнике при температуре +(4-8)°С.

Эффективность применения разработанного состава консервирующей добавки доказана при хранении КМ в течение 13 месяцев с последующим исследованием их специфической активности.

Пример 1

12.12.2007 г. от пациентов М. (с сифилисом вторичным) и А. (с сифилисом первичным), обследованных в серологических реакциях на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С человека, путем венепункции было получено по 20,0 мл цельной крови. Кровь больных сифилисом была помещена в пластиковые стерильные пробирки без стабилизаторов свертывания.

Образцы сыворотки крови №1 и №2 выдерживали 30 минут в термостате при +37°С и подвергали центрифугированию при 3000 оборотах в минуту в течение 15 минут. Каждый образец сыворотки крови переносили в две отдельные стерильные пробирки и инактивировали при температуре +56°С в течение 3 часов.

Из образцов сыворотки крови, полученных от каждого из пациентов, готовили два вида контрольного материала. При приготовлении КМ №1а и №2а в пробирки последовательно добавляли альфа₁-антитрипсин из расчета 0,5 ЕД на 100 мл сыворотки крови, трегалозу в конечной концентрации 1% и реагент ProCline-300 в конечной концентрации 0,1%; каждый последующий реагент вносили после полного растворения предыдущей добавки; сыворотку крови при этом тщательно перемешивали на магнитной мешалке.

При приготовлении КМ №1б и №2б в пробирки с сывороткой крови вносили только реагент ProCline-300 в конечной концентрации 0,1%; сыворотку крови при этом тщательно перемешивали.

После завершения процесса приготовления все образцы подвергали аттестации путем определения уровня антител. Образцы №1а и №1б (полученные от больного М.) характеризовались высоким уровнем антител, определенных в регламентированных тестах на сифилис (ИФА, РПГА, РМП); образцы №2а и №2б (полученные от больного А.) - низким уровнем антител.

Пробирки с препаратами укупоривали стерильной пробкой и оставляли в холодильнике при +(4-8)°С до следующего дня. После этого каждый образец контрольной сыворотки набирали в пластиковый шприц и пропускали через набор фильтров с калиброванной величиной пор 0,8-0,45-0,22 мкм и разливали в стерильных условиях на аликвоты по 0,075 мл в стерильные пробирки Эппендорфа объемом 0,6 мл. Пробирки маркировали, помещали в пластиковые пакеты и хранили в бытовом холодильнике при температуре +(4-8)°С в течение 13 месяцев.

Сразу после розлива и через каждые 2 недели осуществляли контроль активности полученных контрольных материалов при их исследовании в ИФА на сифилис, который позволял оценивать динамику уровня антител по объективному показателю - коэффициенту позитивности (табл.1).

Результаты наблюдений показали, что в образцах КМ №1а и №2а, при приготовлении которых была использована разработанная нами консервирующая добавка, в течение 13 месяцев хранения при температуре +(4-8)°С отмечалось сохранение специфических антител на уровне 90,0-93,0% от исходного аттестованного значения.

В образцах КМ №1б и №2б, при приготовлении которых был использован только реагент ProCline-300, было отмечено снижение уровня специфической активности антител до уровня 65,4 и 53,6% соответственно.

Таким образом, как следует из данного примера, разработанная консервирующая добавка, включающая антитрипсин, трегалозу и ProCline-300, обеспечивала сохранение высокого уровня специфической активности КМ в течение длительного периода времени.

Пример 2

17.12.2007 г. от активных доноров плазмы крови С. и А., обследованных в серологических реакциях на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С человека, при проведении плазмафереза было получено по 20,0 мл цельной крови в пластиковые стерильные пробирки без стабилизаторов свертывания - образцы №3 и №4 соответственно. Оба образца не содержали специфических антител к возбудителю сифилиса, определявшихся в регламентированных тестах на сифилис.

Образцы сыворотки крови выдерживали 30 минут в термостате при +37°С и подвергали центрифугированию при 3000 оборотах в минуту в течение 15 минут. Образец сыворотки, полученный от одного донора, переносили в две отдельные стерильные пробирки. Полученные контрольные сыворотки инактивировали при температуре +56°С в течение 3 часов.

Контрольные материалы №3а и №4а готовили путем последовательного добавления к объему сыворотки крови реагентов: альфа₁-антитрипсина из расчета 0,5 ЕД на 100 мл сыворотки крови, трегалозы в конечной концентрации 1% и реагента ProCline-300 в конечной концентрации 0,1%. Каждый последующий реагент вносили после полного растворения предыдущей добавки; сыворотку крови при этом тщательно перемешивали на магнитной мешалке. КМ №3б и №4б были получены путем добавления к сыворотке реагента ProCline-300 в чистом виде в конечной концентрации 0,1%. Пробирки с приготовленными КМ укупоривали стерильной пробкой и оставляли в холодильнике при +(4-8)°С до следующего дня.

Каждый образец КМ набирали в пластиковый шприц и пропускали через набор фильтров с калиброванной величиной пор 0,8-0,45-0,22 мкм и разливали в стерильных условиях на аликвоты по 0,075 мл в стерильные пробирки Эппендорфа объемом 0,6 мл. Пробирки маркировали, помещали в пластиковые пакеты и хранили в бытовом холодильнике при температуре +(4-8)°С в течение 13 месяцев, предохраняя от воздействия света.

Сразу после розлива и через каждые 2 недели осуществляли контроль активности полученных контрольных материалов при их исследовании в ИФА на сифилис (табл.2).

Результаты контрольных исследований показали, что с образцами КМ, полученными от здоровых доноров крови, уровень показателей оптической плотности в ИФА в течение всего срока наблюдения сохранялся на уровне ниже ОП критического при добавлении обеих консервирующих добавок; неспецифической реактивности в ИФА установлено не было.

Таким образом, приведенные примеры 1 и 2 демонстрируют:

- возможность использования разработанной консервирующей добавки для получения КМ для серодиагностики сифилиса, обладающих специфической активностью;

- возможность использования разработанной прописи консервирующей добавки получения КМ для серодиагностики сифилиса, не обладающих специфической активностью;

- возможность длительного сохранения специфической активности антител к T.pallidum (до 13 месяцев) в КМ, сохраняемых при температуре +(4-8)°С в присутствии разработанной консервирующей добавки.

Библиографический список

1. ISO 15194. In Vitro Diagnostic Medical Devices - Measurement of Quantities in Samples of Biological Origin, Description of Reference Materials.

2. Масяго A.B. Некоторые ошибки при постановке ИФА. // Новости «Ветор-Бест». - 1997. - №1(3). - С.3-7 (htth://www.vector-best.mhost.ru/nvb/st3_7.htm).

3. Chang L.L. Mechanism of protein stabilization by sugars during freeze-drying and storage: native structure preservation, specific interaction, and/or immobilization in a glassy matrix? / L.L.Chang, D.Shepherd, J.Sun et al. // J. Pharm. Sci. - 2005. - Vol.94. - №.7. - P.1427-1444.

4. Han Y. Effects of sugar additives on protein stability of recombinant human serum albumin during lyophilization and storage / Y.Han, B.S.Jin, S.B.Lee et al. // Arch. Pharm. Res. - 2007. - Vol.30. - №9. - P.1124-1131.

5. Hsieh S.Y. Systematical evaluation of the effects of sample collection procedures on low-molecular-weight serum/plasma proteome profiling / S.Y.Hsieh, R.K.Chen, Y.H.Pan, H.L.Lee // Proteomics. - 2006. - Vol.6. - №10. - P.3189-3198.

6. Lau P.P. Proteolytic degradation of human recombinant proinsulin/insulin by sera from acute pancreatitis patients and complete inhibition by Eglin-C / P.P.Lau, M.Van Handel, M.Larvin et al. // Pancreas. - 1990. - Vol.5. - №1. - P.17-26.

7. Yi J. Inhibition of intrinsic photolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma / J.Yi, C.Kim, C.A.Gelfand // J. Proteome Res. - 2007. - Vol.6. - №.5. - P.1768-1781.

Таблица 1 Результаты исследования динамики уровня антител к T.pallidum в опытно-экспериментальных сериях КМ, приготовленных на основе сыворотки крови больных сифилисом с добавлением разработанного состава консервирующей добавки или реагента ProCline-300, в процессе их хранения при температуре +(4-8)°С с применением ИФА (по показателю КП) № серии КМ Характеристика серии КМ Результаты исследования уровня антител к T.pallidum в ИФА с набором реагентов «РекомбиБест аптипаллидум суммарные антитела» D-1855 (г.Новосибирск) через n месяцев хранения 0 1 9 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1а КМ с высоким уровнем антител к T.pallidum и разработанным составом консервирующей добавки 14,570 14,560 14,500 14,496 14,531 14,541 14,500 14,470 13,950 13,918 13,865 13,607 13,666 13,551 1б КМ с высоким уровнем антител к T.pallidum + ProCline-300 14,550 14,460 14,185 13,644 13,300 13,114 13,040 12,545 12,226 11,905 11,726 11,475 10,100 9,509 2а КМ с низким уровнем антител к T.pallidum и разработанным составом консервирующей добавки 5,857 5,734 5,699 5,642 5,669 5,595 5,612 5,425 5,435 5,389 5,229 5,300 5,258 5,271 2б КМ с низким уровнем антител к T.pallidum + ProCline-300 5,795 5,556 5,600 5,452 5,460 5,398 5,420 5,236 5,125 4,980 4,655 4,200 3,810 3,087

Таблица 2 Результаты исследования динамики уровня антител к T.pallidum в опытно-экспериментальных сериях КМ, приготовленных на основе сыворотки крови здоровых доноров крови с добавлением разработанного состава консервирующей добавки или реагента ProCline-300, в процессе их хранения при температуре +(4-8)°С с применением ИФА (по показателю КП) № серии КМ Характеристика серии КМ Результаты исследования уровня антител к T.pullidum в ИФЛ с набором реагентов 1 «РекомбиБест антипаллидум суммарные антитела» D-1855 (г.Новосибирск) через n месяцев хранения 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 3а КМ не содержит антитела к T.pallidum + разработанный состав консервирующей добавки 0,048 0,051 0,046 0,063 0,064 0,058 0,065 0,040 0,050 0,048 0,037 0,040 0,066 0,052 3б КМ не содержит антитела к T.pallidum + ProCline-300 0,049 0,050 0,048 0,050 0,058 0,060 0,065 0,077 0,08 0,095 0,110 0,102 0,120 0,150 4а КМ не содержит антитела к T.pallidum + разработанный состав консервирующей добавки 0,050 0,046 0,046 0,068 0,060 0,052 0,058 0,058 0,066 0,059 0,077 0,054 0,068 0,057 4б КМ не содержит антитела к T.pallidum + ProCline-300 0,055 0,059 0,060 0,078 0,075 0,080 0,075 0,095 0,085 0,085 0,097 0,110 0,120 0,152

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Предложен состав консервирующей добавки к контрольным материалам, используемым при серодиагностике сифилитической инфекции. К образцам сыворотки крови, полученным от больных сифилисом или здоровых лиц, сразу после их получения последовательно добавляют реагенты альфа₁-антитрипсин, трегалозу и ProCline-300. Применение разработанного состава консервирующей добавки позволяет обеспечить сохранение специфической активности контрольных материалов в нативном виде на уровне 90-93% от первоначального уровня при их хранении в течение 13 месяцев в условиях температуры +(4-8)°С. 2 табл.

Состав консервирующей добавки к контрольным материалам, используемым при серодиагностике сифилиса, включающий реагент ProClme-300, отличающийся тем, что дополнительно содержит альфа₁-антитрипсин и трегалозу при следующем количественном соотношении компонентов на 100 мл сыворотки крови:
альфа₁-антитрипсин 0,5 ЕД трегалоза в концентрации 1% ProCline-300 в концентрации 0,1%