Производное ципрофлоксацина, обладающее антибактериальной активностью в отношении антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов Российский патент 2021 года по МПК C07D487/08 A61K31/4709 A61K31/439 A61P31/04 

Изобретение относится к химии органических гетероциклических соединений, а именно к новому производному ципрофлоксацина общей формулы (I)

обладающему антибактериальной активностью в отношении антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов. Заявляемое производное может найти применение в медицине и ветеринарии.

В настоящее время антибиотики широко применяются в сельском хозяйстве. Связано это с тем, что, во-первых, в промышленном производстве большое количество животных содержат на относительно малых площадях, что и предопределяет распространение различных инфекций. Во-вторых, выращивание и содержание животных предусматривает медикаментозную обработку. В-третьих, широкомасштабная профилактика антибиотиками необходима и при транспортировке животных для снятия стресса. Так же широкое распространение получило применение антибиотиков в качестве добавки к кормам для увеличения скорости набора веса животными.

Широкое внедрение в медицинскую и ветеринарную практику антибиотиков приводит к тому, что во всем мире возрастает количество инфекционных заболеваний, вызванных устойчивыми к антибиотикам бактериями. В последние годы главенствующее место в этиологии инфекционных заболеваний вновь занимает грамположительная микрофлора, в том числе бактерии рода Staphylococcus. Микроорганизмы с множественной лекарственной резистентностью (multidrug-resistant organisms, MDRO), такие как метициллин-резистентный золотистый стафилококк, нечувствительные к ванкомицину энтерококки или резистентные к цефалоспоринам третьего поколения грамотрицательные бактерии, в ближайшие десятилетия могут стать более частыми причинами смерти, чем рак [Zipperer A., et al., Human commensals producing a novel antibiotic impair pathogen colonization. // Nature. 2016, V. 535, P. 511-516].

Одним из наиболее эффективных антибактериальных препаратов, используемым в современной практике для подавления метициллин-устойчивых штаммов золотистого стафилококка, является препараты фторхинолонового ряда, в частности ципрофлоксацин. По химической структуре ципрофлоксацин относится к производным фторхинолонового ряда. Однако и для этого антибиотика отмечается значительный рост резистентности микроорганизмов. [Norrby S.R. Side-effects of quinolones: comparisons between quinolones and other antibiotics // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 1991 - V. 10 - P. 378-383].

На дату подачи заявляемого технического решения известно, что резистентными к ципрофлоксацину являются большинство стафилококков, устойчивых к метициллину [Lowy F.D. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus // J. Clin. Invest. - 2003 -V. 111. - P. 1265-1273].

Исследование взаимоотношений структура-биологической активности в ряду производных ципрофлоксацина выявило, что наибольшее влияние на их биологическое действие оказывает природа заместителя при атоме С-7 [Emamia S., Shafiee А., Foroumadi A. Quinolones: Recent Structural and Clinical Developments // Iran. J. Pharm. Res. - 2005. - V. - P. 123-136; заявка WO 2011034971 Al, опубл. 24.03.2011. Modified fluoroquinolone compounds and methods of using the samee]. Наиболее часто в качестве таких заместителей оказываются пяти- и шестичленные азотсодержащие гетероциклы, такие как пиперазин, пиримидин, 1,2,3-триазол, пирролидин и их замещенные производные. В источнике [N. German, et al., Synthesis and evaluation of fluoroquinolone derivatives as substrate-based inhibitors of bacterial efflux pumps // Eur. J. Med. Chem. - 2008 - V. 43. - P. 2453-2463] описаны производные ципрофлоксацина, модифицированные по атому С-7 пиперазинового кольца фрагментами различных пептидов и замещенных диарилмочевин. Данные соединения проявили несколько меньшую антибактериальную активность по сравнению с ципрофлоксацином.

Одним из подходов к созданию антибактериальных препаратов широкого спектра действия и с уменьшенной вероятностью возникновения резистентных штаммов микроорганизмов является получение гибридных структур, объединяющих молекулы с различным механизмом действия.

Так, модификация ципрофлоксацина по атому С-7 пиперазинового кольца аминогликозидным антибиотиком неомицином через мостик, содержащий 1,2,3-триазольный фрагмент, приводило к получению гибридных структур, проявляющих высокую антибактериальную активность в отношении штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий [Pokrovskaya V., et al., Synthesis, and Evaluation of Novel Fluoroquinolone-Aminoglycoside Hybrid Antibiotics // J. Med. Chem. - 2009 - V. 5. - P. 2243-2254].

Недостатком данных соединений является сложный синтез, что делает не рентабельным применение данных соединений в ветеринарии. Кроме того, данные соединения не эффективны в отношении микроорганизмов обладающих устойчивостью к обоим использованным антибиотикам.

Альтернативой антибиотикам при создании гибридных структур, могут служить катионные амфифилы - молекулы с одной или несколькими положительно заряженными группами и липофильными фрагментами [Molchanova N., et al., Advances in development of antimicrobial peptidomimetics as potential drugs // Molecules. 2017. Vol. 22, P. 1430]. Данные соединения являются синтетическими аналогами катионных природных антимикробных пептидов и способны вызывать нарушение трансмембранного потенциала, утечку цитоплазматического содержимого и, в конечном итоге, гибель клеток [Ghosh С, Haldar J. Membrane-active small molecules: Designs inspired by antimicrobial peptides // ChemMedChem. 2015. Vol.10, P. 1606-1624].

Так, в работах [Zimmermann L., et al., New broad-spectrum antibacterial amphiphilic aminoglycosides active against resistant bacteria: From neamine derivatives to smaller neosamine analogues // J. Med. Chem. 2016. Vol.59, P. 9350-9369; Zimmermann L., et al. Broad-spectrum antibacterial amphiphilic aminoglycosides: A new focus on the structure of the lipophilic groups extends the series of active dialkyl neamines // Eur. J. Med. Chem. 2018. Vol. 157, P. 1512-1525] описан синтез и антибактериальная активность ряда аминогликазидных антибиотиков (неомицин, канамицин, амиксин), в которых катионная часть антибиотика одновременно является катионным фрагментом амфифила.

Наиболее близким структурным аналогом к заявляемому соединению - прототипом, является соединение с гибридной структурой, включающее антибиотик линезолид и катионный амфифил на основе четвертичных аммониевых солей, которое получают из деацилированного линезолида ацилированием хлорангидридом хлоруксусной кислоты с последующим алкилированием тритичными аминами. [Bai P.Y. et al., Synthesis and antibacterial bioactivities of cationic deacetyl linezolid amphiphiles // Eur J Med Chem. 2018. Vol. 155, P. 925-945].

Недостатками известных структурных аналогов являются значительно более низкая активность в отношении грамотрицательных микроорганизмов и не полное восстановление активности конъюгата по отношению к штаммам микроорганизмов, выработавших устойчивость к линезалиду.

Задачей изобретения является получение нового производного ципрофлоксацина, обладающего антибактериальной активностью в отношении антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов.

Техническим результатом заявленного технического решения является расширение спектра антибактериальной активности нового производного ципрофлоксацина, а также расширение ассортимента производных ципрофлоксацина, обладающих антибактериальной активностью в отношении антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов.

Поставленная задача достигается предлагаемым соединением, представляющим собой конъюгат ципрофлоксацина с 1-[(4-додецил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан)-1-ил)]-5-[(4-пентил-1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан)-1-ил)] пентан тетрабромидом со структурной формулой (I).

На фиг. 1 представлена общая схема синтеза заявляемого производного ципрофлоксацина.

Предлагаемое соединение получают следующим образом: исходный реагент бромид 1-тетрадецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октан (1) обрабатывают в разбавленном растворе 1,5-дибромпентаном с образованием промежуточного соединения (2). Параллельно ацилированный 6-бромкапроновой кислотой по атому азота пиперазинового кольца ципрофлоксацин (3) обрабатывают избытком 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана. Полученное промежуточное соединение (4) реагирует с предварительно полученной бис-четвертичной солью (2) с образованием целевого соединения (5)

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение нового производного ципрофлоксацина.

Исходный реагент бромид 1-тетрадецил-4-аза-1-азониабицикло[2.2.2]октан (1) растворяют в ацетонитриле. Полученный раствор по каплям при перемешивании добавляют в течение 5 часов к раствору 1,5-дибромпентан в ацетонитриле при 44°С с итоговым соотношением компонентов 1:1. Не охлаждая реакционную смесь, выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме. Выход соединения (2) составляет 57,4%-59,2%.

Исходный, ацилированный по атому азота ципрофлоксацин (3) растворяют в метаноле. Полученный раствор добавляют к раствору 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана в ацетонитриле (соотношение реагентов 1:2) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 48 ч. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме. Выход соединения (4) составляет 86,5%-87,3%. Раствор соединений (2) и (4) в метаноле, взятых в соотношении 1:1, кипятят с обратным холодильником в течение 6 ч. Реакционную смесь охлаждают и к реакционной смеси добавляют эквивалентный объем ацетонитрила. Выпавший осадок дважды перекристаллизовывают из смеси метанола с ацетонитрилом (1:1). Выход целевого соединения (5) составляет 24,3-25,6%.

Спектр ЯМР 1Н, δ, м.д. (J, Гц): 0.93 (уш. т, 3Н, CH₃(CH₂)₁₃N+, J 6.6), 1.14-1.28 (m, 6Н, Н-5_cip, H-6_cip, СН₂СН₂СН₂СО-,); 1.32-1.45 (м, 26Н, CH₃(CH₂)₁₁CH₂CH₂N+, CH₂CH₂CH₂CH₂CO-); 1.32 (м, 2Н,+NCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂N+); 1.88 (м, 2Н, CH₃(CH₂)₁₁CH₂CH₂N++); 1.98 (м, 4Н,+NCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂N+); 2.38 (т, 2Н, J=7.3, -СН₂СО-); 3.12 (м, 4Н, H-8_cip, H-10_cip,), 3.62 (м, 6Н, CH₃(CH₂)₁₂CH₂N+. H-7_cip, H-9_cip); 3.75 (м, 5Н,+NCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂N+. H-4_cip); 4.07-4.12 (м, 24Н,+N(CH₂CH₂)3N+); 7.53 (д, J=7.4 Hz, 1Н, H-2_cip); 7.86 (д, J=13.0 Hz, 1H, H-3_cip); 8.61 (с, 1H, H-l_cip); 15.16 (с, 1H, COOH)

ESI-MS m/z: [M+H]⁺1240.53 (расч для C₅₄H₉₁Br₄FN₇O₄⁺: 1240.38).

Пример 2. Оценка антибактериальной активности соединения (5) на патогенные тест-штаммы: Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa.

Растворы соединения (5) вносили в питательную среду одновременно с посевной концентрацией тест-штамма, инкубировали стационарно в пробирках (по 1 мл) при 37°С в течение 24 часов. Результаты учитывали методом биологического титрования, определяя количество микроорганизмов (титр) до и после инкубации (в колонии образующие единицы на 1 мл, КОЕ/мл). В качестве контроля использовали среду с тест-штаммом без внесения тестируемого препарата. Количество повторов 4.

Бактерицидную активность (БА) оценивали условно:

+ наличие бактерицидной активности (резкое уменьшение количества микроорганизмов);

+\- наличие бактериостатической активности (отсутствие увеличения или незначительное увеличение количества микроорганизмов);

- отсутствие активности (увеличение количества микроорганизмов, сравнимое с контролем).

В таблице 1 представлены усредненные показатели активности различных концентраций тестируемого препарата на патогенные штаммы бактерий, где С-концентрация соединения (5), а значение<10² показывает, что на чашках Петри не выросло ни одной колонии патогенных микроорганизмов.

Из таблицы 1 видно, что тестируемое соединение (5) обладает выраженным антимикробным действием по отношению к патогенным штаммам как грамотрицательных, так и грамположительных микроорганизмов. При концентрации препарата 100 мкг/мл происходит полная инактивация всех исследуемых микроорганизмов. При снижении концентрации до 10 мкг/мл препарат полностью инактивирует штаммы бактерий Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris и уменьшает титр Pseudomonas aeruginosa в 10 тысяч раз по отношению к контролю. Наибольшую активность тестируемое соединение проявляет по отношению к Staphylococcus aureus.

Пример 3. Оценка антибактериальной активности соединения (5) на патогенные штаммы Staphylococcus aureus, устойчивые к действию ципрофлоксацина.

Для тестирования использовали клинические изоляты метилрезистентных штаммов микроорганизмов Staphylococcus aureus: ЭМТК 675, ЭМТК 707, ЭМТК 1695, ЭМТК 1732, ЭМТК 1733, ЭМТК 1850. В качестве препарата сравнения использовали лекарственную форму антибиотика ципрофлоксацина (раствор для внутривенного введения, С=2 мг/мл).

Для работы использовали взвесь ночных бульонных культур, выращенных на стандартных питательных средах. Количество микроорганизмов (титр) во взвеси определяли по оптической плотности клеточной суспензии (ОП) при длине волны 595 нм.

Для оценки антибактериального действия препаратов проводили совместное инкубирование клеточных культур с исследуемыми соединениями в 96-луночных планшетах для культивирования. Ночные бульонные культуры ресуспендировали в среде Мюллера-Хинтона, доводя количество микроорганизмов до посевной дозы 5×10⁵ КОЕ/мл. В лунки одновременно вносили клеточную суспензию и исследуемые препараты до конечной концентрации последних 8, 4, 2, 1, 0,5 и 0,25 мкг/мл. Количество повторов - 4. Инкубировали при 37°С в течение 24 часов, измерение ОП проводили через 1, 2, 4, 8, 12, 24 часа на мультиридере при длине волны 595 нм. Наличие бактерицидности оценивали по изменению ОП по сравнению с контролем.

Результаты тестирования обобщены в таблице 2, где С - концентрация соединения (5); «+» - активный рост микроорганизмов, сравнимый с контролем (вода), «-» - отсутствие роста клеток (бактерицидный эффект), «+/-» - слабый рост клеток (бактериостатический эффект).

Из представленных данных видно, что тестируемое соединение полностью подавляют рост всех штаммов в концентрации от 1 мкг/мл и выше. При уменьшении концентрации до 0,5 мкг/мл происходит достоверная задержка роста микроорганизмов (бактериостатический эффект).

Исходный антибиотик гораздо менее эффективен по отношению к данным микроорганизмам. Ципрофлоксацин проявляет только бактериостатические свойства по отношению к 3 штаммам из 6 в максимальной из исследуемых концентраций (8 мкг/мл), на 2 штамма в протестированных концентрациях не действует вообще, и только для штамма 1732 проявляет бактерицидную активность в концентрации 2 мкг/мл и бактериостатическую активность при концентрации 1 мкг/мл.

Таким образом, новое производное ципрофлоксацина (соединение 5) обладает выраженным антибактериальным действием по отношению к антибиотикоустойчивым штаммам микроорганизмов.

Пример 4. Сравнение кинетики подавления Staphylococcus aureus соединением (5) и ципрофлоксацином.

Исследована антибактериальная активность заявляемого соединения (5) в зависимости от времени воздействия на примере подавления Staphylococcus aureus АТСС 25923. Измерения проводили аналогично примеру 3. Полученные результаты представлены на фиг. 2.

Как видно из представленных результатов, соединение (5) начинает проявлять активность практически сразу после введения. Уже через 1 час происходит снижение концентрации жизнеспособных микроорганизмов более чем в десять раз. Аналогичный эффект для ципрофлоксацина наблюдается ближе к 8 часам. В то время как через 8 часов для соединения (5) наблюдается 100% гибель микроорганизмов. Поскольку катионные амфифилы способны нарушать клеточные мембраны бактерий, можно предположить, что значительно более высокая скорость гибели Staphylococcus aureus под воздействием соединения (5) может быть обусловлена более быстрым проникновением конъюгата в микроорганизмы.

Таким образом, заявляемое новое производное ципрофлоксацина обладает следующими преимуществами перед известными:

- обладает выраженным антибактериальным действием по отношению к антибиотикоустойчивым штаммам микроорганизмов;

- обладает более высокой скоростью инактивации микроорганизмов, по сравнению с базовым антибиотиком.

Изобретение относится к производному ципрофлоксацина общей формулы (I), обладающему антибактериальной активностью, которое может быть использовано в ветеринарии для лечения бактериальных инфекций, вызванных грамположительными и грамотрицательными бактериями, в том числе устойчивых к ципрофлоксацину. 2 ил., 2 табл., 4 пр.

(I)

Производное ципрофлоксацина общей формулы (I)

,

обладающее антибактериальной активностью в отношении антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов.