СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ ИЗ ГРИБНОЙ КУЛЬТУРЫ ASPERGILLUS AWAMORI (ШТАММ 120-77) Российский патент 2001 года по МПК C12N9/34 C12N9/34 C12R1/665 

Изобретение относится к области биотехнологии, а точнее к ее итоговой стадии - процессам выделения и концентрирования целевых компонентов, в частности ферментов из культуральной жидкости, полученной методом глубинного культивирования на искусственных средах.

Препараты технической глюкоамилазы используются в спиртовой промышленности на стадии осахаривания крахмалсодержащего сырья. Потребность в данном ферменте вызвала необходимость получать его в больших количествах, в товарных формах, удобных для транспортировки и длительного хранения. Препараты глюкоамилазы получают в отечественной промышленности в сухом виде. Способ концентрирования глюкоамилазы для получения технических препаратов хорошо описан в статье Л.Р. Джилавян, Л.С. Лосякова, Э.П. Москвичева "Влияние некоторых факторов на получение технической глюкоамилазы" - Ферментная и спиртовая промышленность, 1984, N 6 с.36-38. Фильтрат культуральной жидкости Aspergillus awamori (штамм F-122) высушивают при значениях pH 6,0, температуре греющего агента на входе в распылительную сушилку типа СРЦ 130^oC и на выходе 65^oC в присутствии наполнителя сернокислого натрия в количестве 100% к содержанию сухих веществ фильтрата и стабилизатора сернокислого кобальта - 0,025% к объему фильтрата, получают препараты технической глюкоамилазы ГЗХ с активностью не менее 500 ед/г. Тестировка единиц активности фермента глюкоамилазы - согласно ГОСТ 20264.4-89.

Это - техническая глюкоамилаза под названием глюковаморин ГЗХ выпускается в России согласно ТУ 483-05803071-02-93 с ферментативной активностью по глюкоамилазе от 330 до 700 ед/г. Срок хранения препарата 6 месяцев при температуре 20-25^oC.

Этот метод концентрирования при получении технических препаратов глюкоамилазы мы принимаем за аналог.

Его основной недостаток - низкая ферментативная активность глюкоамилазы, что делает ее неудобной при применении в спиртовой промышленности.

Ферментные препараты глюкоамилазы выпускаются также и в жидком виде. Жидкий препарат глюкоамилазы представляет собой культуральную жидкость, полученную методом глубинного культивирования низших грибов, обладающих способностью продуцировать в культуральную жидкость в процессе роста глюкоамилазные ферменты. Препарат имеет название глюковаморин ГХ и выпускается согласно ТУ 10-04-03-07-87. Срок хранения данного препарата 10 дней при температуре 20-25^oC.

Ферментная активность 110-200 ед/мл. Недостаток - низкая ферментная активность, малый срок хранения, неудобство транспортировки больших объемов культуральной жидкости на спиртзаводы.

Наиболее близким аналогом является изобретение С.И. Крайчева, Н.И. Белова и др. "Способ получения амилолитических ферментных препаратов" - авторское свидетельство, N SU 997455A, С 12 N 9/34, 1984. Здесь описаны два способа получения ферментного препарата глюкоамилазы из культуральной жидкости Aspergillus awamori - 466. Первый способ включает в себя ферментацию, дрожжевое сбраживание остаточных сахаров, отделение биомассы, ультраконцентрирование на ацетатцеллюлозных мембранах.

В результате получали ультраконцентрат, содержащий фермент глюкоамилазу с активностью 1600 ед.ГлС в 1 г и этиловый спирт до 3,3% об.

Второй способ заключается в ферментации Aspergillus awamori - 466, дрожжевом сбраживании остаточных сахаров и вакуум-выпаривании с одновременной отгонкой спирта. При этом получали препараты с активностью глюкоамилазы 300 ед.ГлС/мл.

К недостаткам обоих способов получения следует отнести длительность процедуры, поскольку сбраживание остаточных сахаров дрожжами Saccharomyces cerevisial проводят в течение 24 ч. Кроме этого, в случае получения ультраконцентрата в препаратах кроме глюкоамилазы остается этиловый спирт, поэтому их сразу направляли на осахаривание. При вакуум-выпаривании получали препараты глюкоамилазы с низкой ферментативной активностью. Поскольку биомассу Aspergillus awamori - 466 и дрожжевой культуры не отделяли, то их также сразу же отправляли на производство. Так как в концентрате биомассы содержатся продукты метаболизма и остатки культуральной жидкости, концентрат является богатой средой для развития посторонней микрофлоры.

И, наконец, культивирование низшего гриба Aspergillus awamori - 466 требует стерильных условий производства, тогда как процесс сбраживания дрожжами относится к условно-стерильным производствам.

Проводить обе операции на одном и том же оборудовании и в одних и тех же производственных помещениях крайне нежелательно. Разделение этих процессов еще больше усложняет и удорожает данные способы получения концентратов фермента глюкоамилазы.

Высококонцентрированных, жидких технических ферментных препаратов, обладающих глюкоамилазной активностью (Гла), отечественная промышленность не производит.

Фирма Novo Nordisk (Дания) выпускает жидкий ферментный препарат для спиртовой промышленности, который обладает глюкоамилазной активностью порядка 3000 ед/мл и а-амилазной активностью 700 ед/мл (единицы по ГОСТ 20264.4-89). Это препарат - SAN Super 240L. Срок хранения данного препарата 3 месяца при температуре 20-25^oC. "Карта продукта, Отдел ферментов", В 804d-RU, фирма Novo Nordisk, c.1:2, 1996.

Целью изобретения является получение в промышленных масштабах высококонцентрированных жидких ферментных препаратов, обладающих глюкоамилазной активностью и стабильностью в процессе хранения при температурах от 18 до 25^oC.

Эта цель достигается тем, что комбинацией методов ультрафильтрации и вакуум-выпаривания на вакуум-выпарной установке сепарационного типа из фильтрата культуральной жидкости Aspergillus awamori (штамм 120-77) получают высококонцентрированные ферментные препараты с активностью до 1500 ед/мл.

Сущность изобретения заключается в выборе метода и достижении оптимального соотношения параметров ультрафильтрации и вакуум-выпаривания на вакуум-выпарной установке сепарационного типа при температурных режимах, которые позволяют сохранять его биологическую активность не только в процессе концентрирования, но и в течение длительного срока хранения при температурах от 18 до 25^oC. В результате получают целевой препарат - жидкий ферментативный концентрат, обладающий глюкоамилазной активностью до 1500 ед/мл. Отличия заявляемого способа от прототипа позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "новизна". Признаки, отличающие заявляемое решение от прототипа, не выявлены в других решениях при изучении данной и смежной областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию "существенные отличия".

Заявляемый способ концентрирования фермента глюкоамилазы заключается в следующем. Профильтрованную культуральную жидкость, содержащую ферментный препарат - глюкоамилазу, концентрируют сначала методом ультрафильтрации, а затем методом вакуум-выпаривания на вакуум-выпарной установке сепарационного типа Центритерм марки СТ-9 производительностью 2,4 м³/ч по упаренной влаге.

В качестве примеров рассмотрим процессы концентрирования глюкоамилазы.

Пример N 1 (по аналогу).

В производственную культуральную жидкость глюковаморина Гх (Aspergillus awamori штамм 120-77), полученную на обедненных питательных средах в количестве 5 м³, добавляют сульфат цинка из расчета 0,025% к объему в качестве стабилизатора. Затем к ней добавляют сульфат натрия в количестве 240 кг.

Полученную смесь сушат на распылительной сушилке марки СРЦ ВК 300/8 со скоростью подачи продукта 0,8 м/ч. Температура теплоносителя на входе в сушилку 125^oC, на выходе 60^oC.

Ферментативная активность исходной культуральной жидкости составляет 100 ед/мл. В результате получают 566 кг сухого глюковаморина ГЗХ с ферментативной активностью 330 ед/гр.

Пример N 2 (по заявляемому методу).

Объектом для эксперимента используют культуральную жидкость глюковаморина ГХ (Aspergillus awamori штамм 120-77), полученную при стандартных условиях. 2 м³ культуральной жидкости фильтруют через фильтр-пресс с промывкой его водой для удаления из осадка остатков фермента. Предварительно перед фильтрацией добавляют 2% фильтр-перлита. Далее фильтрат подвергают ультрафильтрации на установке с плоскопараллельными мембранами на мембранах марки ПА-20.

Далее ультраконцентрат упаривают на вакуум-выпарной установке Центритерм СТ-9 на следующих режимах: скорость подачи 2 м³/ч, температура теплоносителя на входе в установку 100^oC, температура вакуум-концентрата 45^oC, вакуум - 0,09 МПа. В таблице 1 приведены данные экспериментов по вакуум-концентрированию ультраконцентрата глюковаморина ГХ.

Вакуум-выпаривание проводят в два этапа с остановкой установки. Полученный препарат имеет активность 1500 ед/мл, что подтверждает 10 кратное концентрирование по ферментативной активности. Полученный жидкий концентрат хорошо хранится при комнатной температуре и не теряет достигнутой ферментативной активности в течение трех месяцев.

Таким образом, в результате использования данного способа можно получать тоннажные количества жидкого концентрированного ферментного препарата глюкоамилазы.

Способ может быть применен на предприятиях микробиологической и спиртовой промышленности при производстве ферментных препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии, к процессам выделения и концентрирования ферментов из культуральной жидкости. Использование возможно при производстве ферментных препаратов для спиртовой и крахмалопаточной промышленности. Осуществляют комбинацию ультрафильтрации и вакуум-выпаривания на установке сепарационного типа при температуре теплоносителя на входе в установку 100^oC, температуре концентрата 45^oC и вакууме 0,09 МПа из фильтрата культуральной жидкости Aspergillus awamori (штамм 120 - 77). Получают высококонцентрированный ферментный препарат с активностью глюкоамилазы 1500 ед/мл. Препарат стабилен при хранении при температурах 18 - 25^oC. Способ позволяет получать в промышленных масштабах высококонцентрированный жидкий ферментный препарат, обладающий глюкоамилазной активностью. 1 табл.

Способ концентрирования глюкоамилазы из грибной культуры Aspergillus awamori штамм 120-77 вакуум-выпариванием культуральной жидкости, отличающийся тем, что исходную культуральную жидкость концентрируют комбинацией методов ультрафильтрации и вакуум-выпаривания на установке сепарационного типа при температуре теплоносителя на входе в установку 100^oC, температуре концентрата 45^oC и вакууме 0,09 МПа до получения концентрата с активностью глюкоамилазы 1500 ед/мл.