Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител против эритроцитарного антигена V F-системы крупного рогатого скота и родственных ему видов Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в племенном животноводстве для определения групп крови крупного рогатого скота.

Цель изобретения - получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моно- клональные антитела (Мон-АТ) против эрит- роцитарного антигена V F-системы крупного рогатого скота (КРС), повышение их специфичности и устойчивости при хранении.

Штамм получают следующим образом.

Спленоциты мыши линии Balb/c, имми- ниэированной эритроцитами КРС, содержащими V антиген F-системы КРС, гибридизируют с клетками мышной миеломы SP2/0-Ag 14 при соотношении числа спленоцитов к клеткам миеломы 14:1. Штамм отселектируют после двукратного реклонирования и к моменту депонирования проводят через 33 пассажа fn vitro и два пассажа in vfvo.

Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 188Д и получил название IC8/18/2.

Штамм характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Клетки округлой формы, диаметром 20-30 мкм, располагаются раздельно, комками, гроздьями. Ядро одно, ядрышек 1-3. В кариоти- пе имеются хромосомы, подтверждающие происхождение от клеток нормальной мыши и мышиной миеломы SP2/0-Ag14.

Физиологические признаки. В условиях культивирования in vitro культура растет суспензионно на минеральных питательных средах, условно обозначаемых ПС, НПС и КС.

Культивирование на ПС при посевной дозе 200-300 тыс,клеток/мл обеспечивает оптимальную плотность 600-700 тыс.клеток/мл через 24-30 ч и максимальную - 800-900 тыс.клеток/мл через 34-38 ч (в зависимости от условий культивирования). Культура характеризуется слабыми адгезивными свойствами к стеклянной и пластиковой.поверхности.

В условиях культивирования In vivo в мышах Balb/c после внутрибрюшинной инокуляции 5 106-10 клеток в мышь гиб- ридомы образуют солидную, асцитную или смешанную формы опухоли. Асцитическая жидкость выделяется в количестве 2-6 мл из одной мыши. Секретирующая активность клеток характеризуется титром антител в культуральной среде. При оптимальной концентрации клеток в среде титр варьирует в пределах 1:2000-1:4000; при максимальной плотности - 1:4000-1:8000; в асцитической жидкости - от 1:10000 до 1:64000 и в сыворотке крови мышей с развившимися опухолями от 1:20000 до 1:130000.

После криоконсервации при - 196°С в культуре сохраняется 70-75% жизнеспособных клеток, при условии замораживания их в количестве 1-5 млн. в 1 мл эмбриональной сыворотки коров с добавлением 10% диметилсульфоксида (ДМСО),

Свойства секретируемого клетками продукта. Клетки штамма секретируют иммуноглобулины класса G3, определяемого изоферментным методом с использованием панели кроличьих антител против и изотопов в мышиных иммуношлобулинов: М, G1, G2a, G2e. Мон-АТ отличаются высокоспецифическим средством к антигену V F-систе- мы эритроцитов КРС, что доказывается проявлением гемолизирующей активности антител а отношении эритроцитов, на мембранах которых идентифицирован V -анти- ген, и отсутствием реакции с эритроцитами, негативными по данному антигену. Гемолиз

происходит в присутствии комплемента кролика (слабее при использовании комплемента морской свинки) при 35-37°С через 1-2 ч или при через 6-24 ч после

добавления комплемента кролика к смеси МонАТ с эритроцитами.

Активность Мон-АТ остается без изменений в составе асцитической жидкости или сыворотки крови мышей при хранении пре0 паратов при (-70) и (-20)°С или в лиофилизированном состоянии при 4°С в течение 24

мес. Титр препарата не снижается после

трехкратного замораживания-оттаивания.

Пример 1.1млн клеток штамма после

5 криоконсервации освобождают путем центрифугирования (1000 об/мин в течение 10 мин) от среды криоконсервации; пипеткой (1 мл) распределяют клетки по 200 тыс. в лунки (2 мл) 24-ячеечного планшета (Flow)

0 на среду ПС, кондиционированную предварительно посеянными макрофагами. План- шет помещают в атмосферу 95% воздуха и 5% С02 при абсолютной влажности и 37°С. Через 48 ч клетки из каждой лунки перено5 сят во флаконы Карреля в 4-5 мл среды ПС, соблюдая при этом оптимальную посевную дозу 200-300 тыс.клеток в 1 мл. При достижении культуральной плотности 600-700 тыс. клеток/мл их рассеивают в свежую среду

0 (ПС) во флаконы. В третьем пассаже ПС заменяют НПС или НПС с добавлением КС.

Культуру пассируют до накопления 25- 50 млн.клеток, отделяют от среды, центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин,

5 отмывают в растворе Хэнкса (или ФР), центрифугируя 10 мин при 1000 об/мин, концентрируют 25-50 млн клеток в растворе Хэнкса (или ФР) и вводят 8-10 недельным самцам мышей Balb/c внутрибрюшинно по

0 5-10 млн. клеток в мышь. Животных подготавливают к инокуляции клеток за 3-14 сут. введением внутрибрюшинно по 0,5 приста- на (2,6,10,14-тетраметилпентадекан). Через 12-14 сут мышей декапетируют, 1,5-2 мл

5 крови нестерильно собирают в чашку Петри с раствором Хэнкса с добавлением 0,005 мг/мл гепарина, форменные элементы крови устраняют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об./мин. Из брю0 шинной полости стерильно извлекают асцитическую жидкость во флакон с гепари- низированным раствором Хэнкса. При этом соотношение асцитической жидкости и буферного раствора может варьировать в пре5 делах 1:1-1:4. Клетки гибридомы из асцитической жидкости отделяют центрифугированием (10 мин при 1000 об/мин), супернатант смешивают с сывороткой крови мышей, устанавливают титр Мон-АТ, до- авляют 0,02-0,01% азида натрия или

меркаптоэтанола и используют как реагент. Клетки, выделенные из асцитической жидкости, а также извлеченные из солидных опухолевых узлов, используют для повторной инокуляции. В результате первого пассажа гибридомных клеток In vivo количество асцитической жидкости составляет 2- 4 мл/мышь и увеличивается до 3-6 мл/мышь во втором пассаже.

Пример 2. Для установления специфического сродства Мон-АТ к V -антигену эритроцитарной мембраны КРС (или близкородственных видов) готовят 1,5%-2,5% взвесь эритроцитов в 0,85% ФР из крови 10-20 животных, генотипически положительных по У-антигену F-системы (V+) и от 1-3 животных в эритроцитах которых не содержится V антиген (V-) животные ти- пируются ранее с использованием стандартных реагентов). В лунки планшетов для иммунологическихх реакций вносят по 20 мкл ФР. Путем переноса из первой лунки в последующие получают разбавления реагента, кратные 2. Эритроцитарную взвесь вносят по 10 мкл в лунку, перемешивают встряхиванием, добавляют в каждую лунку по 20 мкл комплемента кролика, перемешивают встряхиванием, оставляют при 37- 38°С на 1 ч, встряхивают и оставляют еще на 1 ч. Полный гемолиз определяют по появлению оранжевато-оплесцирующей окраске жидкости в лунках при одновременном исчезновении оформленных эритроцитов. Анти- V специфичность обнаруживают по проявлению гемолиза в лунках с эритроцитами от V+ - животных и отсутствию соответствующей реакции с V- -эритроцитами. Параллельно с Мон-АТ в тех же условиях ставят аналогичную реакцию между V+ и V- эритроцитами и стандартным реагентом против V антигена. Получают результат, аналогичный результату с Мон-Ат для V+ эритроцитов, но отличающийся значительно более низким титром для стандартного препарата. Титр Мон-АТ-1С8 в составе асцитической жидкости с добавлением сыворотки мышей колеблется в зависимости от условий постановки реакции от 1:500 до 1:130000.

Пример 3. Для использования Мон- АТ в качестве реагента жидкости, полученной путем культивирования клеток in vivo, разбавляют буферным раствором Хэнкса 1:2-1:4, добавляют 0,01-0,02% азида натрия или мертиолата, устанавливают титр антител, фасуют в ампулы по 1 мл, замораживают при (-10), (-12), (-20) или (-70)°С. При v двух последних указанных температурах хранят более двух лет, при (-10), (-12)°С - 8-12 мес. После размораживания реагент 5 разбавляют ФР до титра 1:4-1:8 непосредственно перед употреблением. В случае необходимости хранения более 12 мес разбавленного реагента (титр 1:200-1:500) при оптимальных условиях реакции гемоли0 за) к ФР или раствору Хэнкса добавляют 10-7% бычьего сывороточного альбумина (ЈСА) и замораживают при тех же температурах,

Сохранность активности реагента в те5 чение сроков более двух лет при 4-б°С обеспечивают тем, что асцитическую жидкость, разбавленную раствором Хэнкса в 2-4 раза, лиофилизируют в вакууме при -70°С и конической температуре 25°С. В целях использо0 вания в качестве реагента Мон-АТ, полученных при культивировании клеток in vitro, из культуральной среды антитела осаждают насыщенным раствором сульфата аммония, отмывают 0,01 фосфатным бу5 фером (ЗФР, рН 7.2), диализуют против буфера, разбавляют раствором Хэнкса, добавляют 0,01-0,02% азида натрия или мертиолата устанавливают титр, замораживают или лиофилизируют, хранят как описано вы0 ше.

Таким образом в результате предлагаемого изобретения, используемого в качестве источника Мон-АТ, получают реагент, характеризующийся высокой специфично5 стью к V антигену F-системы КРС и родст- - венных ему видов, активность которого в 50-5000 раз превышает активность стандартного препарата той же специфичности, производимого путем изоиммунизации ко0 ров эритроцитами животных того же вида, устойчивый к длительному хранению в условиях криоконсервации при периодическом оттаивании - повторном завораживании или в условиях лиофилизации, и обеспечи5 вают возможность практически бесконечного получения реагента против эритроцитарного фактора V F-системы КРС и родственных ему видов.

0- Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus ВСКК(П) 188Д - продуцент моноклональных антител против эритроцитарного антигена VF-систеМы

5 крупного рогатого скота и родственных ему видов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в племенном животноводстве для определения групп крови крупного рогатого скота (КРС). Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующих моно- клональные антитела (Мон-АТ), против эрит- роцитарного антигена V F-системы КРС, повышение их специфичности и устойчивости при хранении. Полученный штамм депонирован под номером ВСКК(П) 188D и получил название IC8/18/2, Штамм получают путем гибридизации спленоцитов мыши Balb/c, иммунизированной эритроцитами КРС, содержащими Г-антиген F-системы КРС, с клетками мышиной миеломы SP 2/0- Ад 14. Клетки Mus. musculus IC8/18/2 культивируют в условиях in vitro или in vivo в мышах Balb/c для получения супернатантов культуральной среды, асцитической жидкости или сыворотки крови мышей, содержащих Мон-АТ против антигена V F-системы КРС, которые составляют основу реагента, используемого для определения антигена V. Мон-АТ представляют собой иммуноглобулины класса G3, накапливаются в асцитической жидкости в концентрациях, определяемых титрами 1: 4000 - 1:100000, не снижают активности при хранении в составе асцитической жидкости в течение 9 месяцев при (-10)-( 12)1 °С при трехкратном замораживании - оттаивании и лиофилиза- ции. Помимо основной отрасли изобретение может найти применение в научных исследованиях и в судебной медицине С/ с vj 4 О v|