ОЧИСТКА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ Российский патент 2010 года по МПК C07H21/00 

Изобретение относится к способу очистки олигонуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов давно является объектом интенсивных исследований. Были разработаны методы автоматического синтеза, и оборудование для автоматического синтеза имеется в продаже. Большинство указанных методов разработано для получения скорее небольших количеств олигонуклеотидов (в пределах мг). Данные количества достаточны для большинства исследовательских целей.

В частности, с разработкой антисмысловых лекарственных препаратов крупномасштабный синтез приобрел большое значение.

Несмотря на то, что были разработаны методы, связанные с крупномасштабными синтезами, главной сложностью является очистка интермедиатов и продуктов. Для небольших синтезов подходящим методом, позволяющим проводить очистку в количестве мг в короткое время и с хорошим результатом, является ВЭЖХ на обращенной фазе. Для крупномасштабных синтезов ВЭЖХ на обращенной фазе становится сложной процедурой, требующей большого количества растворителей, дорогостоящего оборудования и т.д.

В настоящее время существует насущная потребность в усовершенствованных способах очистки продуктов синтеза олигонуклеотидов.

US 2003/0055241 раскрывает способ получения очищенных олигонуклеотидов, включающий в себя обработку раствора олигонуклеотида агрегирующим агентом и средством, усиливающим осаждение. Способ используется для очистки незащищенных или 5'-защищенных олигонуклеотидов. Ионная форма необходима для взаимодействия молекулы со средством, усиливающим осаждение.

EP 0512768A1 раскрывает способ очистки ДНК. ДНК выделяют из природных источников.

Оба описанных выше способа применимы только для незащищенных или слабо защищенных олигонуклеотидов. Во время синтеза олигонуклеотиды защищены, следовательно, методы US 2003/0055241 и EP 0512768A1 неприменимы.

Основной задачей настоящего изобретения является преодоление недостатков известного уровня техники и предоставление эффективного способа очистки олигонуклеотидов и интермедиатов, в частности для крупномасштабных синтезов.

В одном воплощении настоящее изобретение предоставляет способ очистки защищенного олигонуклеотида, включающий стадию

- получения раствора защищенного олигонуклеотида хотя бы в одном растворителе А, имеющем точку кипения ниже, чем точка кипения растворителя В,

- нагревания раствора до температуры, по меньшей мере, 30°C, но ниже точки кипения, по меньшей мере, растворителя А,

- добавления растворителя В до помутнения раствора, причем указанный растворитель В представляет собой спирт, содержащий от 1 до 6 атомов С, или диол, содержащий от 2 до 6 атомов С,

- охлаждения раствора при перемешивании до образования супернатанта и осадка,

- удаления супернатанта.

В другом воплощении настоящее изобретение предоставляет способ очистки защищенного олигонуклеотида, включающий стадии

- получения растворителя В, причем указанный растворитель В представляет собой спирт, содержащий от 1 до 6 атомов С, или диол, содержащий от 2 до 6 атомов С,

- нагревания растворителя В до температуры, по меньшей мере, 30°C, но ниже точки кипения растворителя В,

- добавления раствора защищенного олигонуклеотида в, по меньшей мере, одном растворителе А до помутнения раствора,

- охлаждения раствора при перемешивании до образования супернатанта и осадка,

- удаления супернатанта.

“Помутнение раствора” представляет собой замечание, описывающее что раствор насыщен, т.е. не способен растворить защищенный олигонуклеотид. Раствор мутнеет при видимом осаждении вещества.

“Охлаждение” означает снижение температуры раствора. Обычно охлаждение производят до достижения комнатной температуры (около 25°C). В некоторых случаях предпочтительно дальнейшее охлаждение, например, по меньшей мере, до 20°C или, по меньшей мере, до 10°C или до 0°C.

“Защищенный олигонуклеотид” представляет собой олигонуклеотид, содержащий одну или более защищенных групп в положении 5', 3', 2' сахарной части и/или в гетероциклических основаниях и/или в Р-соединении (т.е. в фосфате или тиофосфатах).

Термин “защищенные группы” включает в себя группы, которые не удаляют перед использованием олигонуклеотидов, т.е. модификации, используемые для увеличения стабильности олигонуклеотида.

Подходящая защита 2'-гидроксилгруппы включает в себя третбутилдиметилсилил (TBDMS), триизопропилсилилоксиметил (TOM), флоорофенилметоксипиперидинил (FPMP) и CH2-O-Et, и нерасщепляемые модификации как 2'F или 2'MeO, но не ограничена ими.

Подходящая защита 3'-гидроксилгруппы включает в себя третбутилдиметилсилил (TBDMS), левуленил, бензоил, но не ограничена ими.

Подходящие модификации включают в себя LNA (2'O-4'С-метиленовый мостик).

Специалистам в данной области известны подходящие защищенные нуклеиновые основания, например N-4-бензоилцитозин, N-6-бензоиладенин, N-2-изобутирилгуанин, N-4-ацетил- или изобутирилцитозин, N-6-феноксиацетиладенин, N-2-третбутилфеноксиацетилгуанин. Подходящие неосновные остатки включают в себя также водород (Н), приводящий к образованию 1',2'-дидеоксирибозы (dSpacer из Glen Research), которая может быть использована в качестве мостика или для имитации основных участков в олигонуклеотиде (Takeshita et al. J. Biol. Chem., 1987, 262, 10171)

Подходящие 5' защищенные группы включают в себя тритиловые группы, но не ограничены ими, предпочтительно диметокситритиловую группу (DMTr) или монометокситритиловую группу (MMTr). Данные защищенные группы используют в обычно применяемом в данной области техники синтезе олигонуклеотидов на твердой фазе. Другие подходящие 5' защищенные группы включают в себя третбутилдиметилсилил (TBDMS), левуленил, бензоил, флоорофенилметоксипиперидинил (FPMP), 9-фенилтиоксантен-9-ил (S-пиксил), но не ограничены ими.

В предпочтительном воплощении защищенный олигонуклеотид представляет собой неиононное соединение.

“Олигонуклеотид” представляет собой олигомер из мономерных единиц, содержащих сахарные единицы, соединенные с гетероциклическими основаниями, указанные мономерные единицы соединены связями. Типичные связи представляют собой производные фосфора, например фосфаты, тиофосфаты или их производные. Данный термин также охватывает олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, модифицированные олигонуклеотиды, нуклеотидные миметики и соединения, по форме подобные РНК и ДНК. В целом, данные соединения состоят из каркаса связанных мономерных субъединиц, где каждая связанная мономерная субъединица прямо или косвенно присоединена к гетероциклической основной части. Связи, соединяющие мономерные субъединицы, мономерные субъединицы и гетероциклические основные части, могут мигрировать по структуре, приводя к множеству конечных соединений.

Согласно предпочтительным воплощениям изобретения защищенный нуклеотид имеет длину от 2 до 30 нуклеотидов, предпочтительно от 2 до 9, предпочтительно от 2 до 6.

Модификации, известные в данной области техники, представляют собой модификацию гетероциклических оснований, сахара или связей, соединяющих мономерные субъединицы. Вариации межнуклеотидных связей описаны, например, в WO 2004/011474, начиная с конца стр.11 и включены в ссылку.

Типичные производные представляют собой тиофосфаты, дитиофосфаты, метил- и алкилфосфаты и ацетофосфаты. Другие типичные модификации находятся в сахарной части. Рибоза замещается другим сахаром или в одной или более позиций происходит замещение другими группами, такими как F, O-алкил, S-алкил, N-алкил. Предпочтительные воплощения представляют собой 2'-метил и 2'-метоксиэтокси. Все указанные модификации известны в данной области техники.

В отношении гетероциклического основания следует отметить, что существует некоторое количество синтетических оснований, которые используют в данной области техники, например 5-метилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6- или 2-алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-тиоурацил. Такие модификации раскрыты в WO 2004/011474, начиная со стр.21.

Защищенный олигонуклеотид может иметь 5' и 3' защищенные группы или 5' защищенную группу и 3' незащищенную группу или 3' защищенную группу и 5' незащищенную группу. В зависимости от структуры нуклеотида может быть 2' защищенная группа.

Предпочтительно, чтобы Р-связь и гетероциклические основания были соответственно защищены.

В одном воплощении защищенный олигонуклеотид растворяют в растворителе или смеси растворителей, где один из растворителей обозначают как растворитель А. Примерами растворителя А являются CH₂Cl₂, CHCl₃, тетрагидрофуран, ацетонитрил, метанол, этанол, дихлорэтан, тетрахлорэтан, диоксан, ацетон.

Несмотря на то, что одного растворителя может быть достаточно для некоторых защищенных олигонуклеотидов в одном из воплощений, предпочтительнее использовать смесь растворителей, например выбранных из CH₂Cl₂, CHCl₃, тетрагидрофурана, ацетонитрила, метанола, этанола, дихлорэтана, тетрахлорэтана, диоксана, ацетона.

Согласно изобретению раствор защищенного олигонуклеотида нагревают до температуры, по меньшей мере, 30°C, но ниже точки кипения, по меньшей мере, одного растворителя А. Если смесь растворителей используют для раствора защищенного олигонуклеотида, предпочтительно, чтобы раствор не нагревался выше точки кипения любого ингредиента смеси.

После этого растворитель B, спирт или диол, добавляют к раствору.

Предпочтительно, чтобы растворитель А имел точку кипения ниже, чем растворитель В, но можно получить хорошие результаты с растворителями А и В, имеющими близкие точки кипения или даже в ситуациях, когда точка кипения растворителя А выше, чем точка кипения растворителя В.

Наиболее предпочтительный растворитель А содержит CH₂Cl₂ (предпочтительно, по меньшей мере, 90 мас.%) и наиболее предпочтительный растворитель В содержит изопропанол (предпочтительно, по меньшей мере, 90 мас.%). Сочетание CH₂Cl₂ и изопропанола является особенно эффективным и, соответственно, предпочтительным.

Другое воплощение изобретения представляет собой способ, включающий в себя

- получение раствора защищенного неиононного олигонуклеотида в, по меньшей мере, одном растворителе А,

- соединение указанного раствора с растворителем В для формирования растворителя А+В, в котором количества растворителя А и растворителя В выбирают так, чтобы получить насыщенный раствор неионного защищенного олигонуклеотида в растворителе А+В,

- и образование супернатанта и осадка.

Данный растворитель В представляет собой спирт, содержащий от 1 до 6 атомов С, или диол, содержащий от 2 до 6 атомов С.

Если точно не известно необходимое количество растворителя В, то предпочтительно добавлять его по каплям. При добавлении растворителя В раствор мутнеет, но в большинстве случаев при дальнейшем помешивании и/или нагревании опять становится прозрачным. Поскольку точка кипения растворителя В выше, чем растворителя А, температуру раствора увеличивают дальнейшим нагреванием. Предпочтительное количество растворителя В представляет собой количество, которое необходимо добавить, чтобы получить помутнение раствора или несколько меньшее количество растворителя В.

В одном воплощении раствор нагревают до температуры от 5°C до 10°C ниже точки кипения. После того как раствор помутнел, его выдерживают при температуре точки кипения одну минуту и затем охлаждают.

Нагревание раствора является особенно предпочтительным, если в нем много примесей, т.е. чистота олигонуклеотида ниже 85%. В данном случае нагревание увеличивает эффективность очистки. Если чистота выше (например, по меньшей мере, 90%) или эффективность неполной очистки удовлетворительна, способ настоящего изобретения может быть применен при температуре от 25°C до 30°C или даже при температуре 15°C-25°C. Очистка менее эффективна при более низких температурах.

В некоторых воплощениях целесообразно повторить способ настоящего изобретения. В таких случаях первая стадия очистки была бы эффективной при температуре, по меньшей мере, 30°C и последующие стадии очистки при более низкой температуре, например 20°C или 25°C. Затем раствор охлаждают при помешивании. Охлаждение может быть эффективным при комнатной температуре или даже при более низких температурах, например в холодильнике.

Предпочтительно перемешивать данные растворы во время охлаждения. В предпочтительном воплощении перемешивание продолжается, по меньшей мере, в течение трех часов, предпочтительно шесть часов и наиболее предпочтительно всю ночь.

Согласно способу, описанному в настоящем изобретении, образуются супернатант и осадок. Супернатант, содержащий примеси, отделяют и удаляют. Осадок может быть в разных формах. Он может быть в форме геля, масла или иметь кристаллическую форму. В некоторых воплощениях целесообразно добавить эфир к осадку и затем удалить эфир вместе с другими примесями. Защищенные олигонуклеотиды нерастворимы в эфире. В некоторых случаях указанная обработка эфиром увеличивает склонность к образованию кристаллической или порошкообразной формы осадка.

В предпочтительном воплощении процедура очистки повторяется, по меньшей мере, один раз. Добавляют растворитель или смесь растворителей типа А и растворяют повторно олигонуклеотид. Затем повторяют способ очистки настоящего изобретения.

Способ, представленный в настоящем изобретении, является особенно подходящим для крупномасштабных синтезов, т.е. в количествах начиная от 100 мг и до кг. Оборудование, необходимое для способа, представленного в настоящем изобретении, дешево по сравнению с крупномасштабной ВЭЖХ.

Способ настоящего изобретения особенно эффективен для удаления катализаторов, таких как тетразол, DCI или BMT и сульфитирующих агентов, таких как PADS.

Далее изобретение объясняется в ссылках на следующие, не ограничивающие его применение, примеры:

1) 5'-O-DMTr-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -3'-O-Lev (10,8 ммоль)

растворяют в 25 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 120 мл 2-пропанола (в соотношении 1:4,8), когда раствор нагрет до 55-60°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 77,2 до 88,0% после одной очистки. При использовании 5'-O-TBDMS-C^Bz-P(S,OCNE)-C^Bz-3'-O-Lev чистота увеличивалась от 78,1% до 94,8% после двух последовательных очисток.

2) 5'-O-DMTr-A ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -3'-O-Lev (15 ммоль)

растворяют в 50 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 450 мл 2-пропанола (в соотношении 1:9), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 50,8 до 79,5% после двух последовательных очисток.

3) 5'-O-DMTr-A ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -3'-OH (1,63 ммоль)

растворяют в 20 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 400 мл 2-пропанола (в соотношении 1:20), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 79,5 до 93,2% после двух последовательных очисток.

4) 5'-O-DMTr-C ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -3'-O-Lev (7,58 ммоль)

растворяют в 12 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 130 мл 2-пропанола (в соотношении 1:10,8), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 62,5 до 88,7% после двух последовательных очисток.

5) 5'-O-DMTr-C ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -3'-OH (2,0 ммоль)

растворяют в 10 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 70 мл 2-пропанола (в соотношении 1:4,8), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 88,2 до 95,5% после двух последовательных очисток.

6) 5'-O-DMTr-T-P(S,OCNE)-G ^iBu -3'-O-Lev (10,2 ммоль)

растворяют в 30 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 450 мл 2-пропанола (в соотношении 1:15), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 68,0 до 96,2% после двух последовательных очисток.

7) 5'-O-DMTr-T-P(S,OCN E)-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -3'-O- Lev (1,41 ммоль)

растворяют в 15 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 50 мл 2-пропанола (в соотношении 1:3,3), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 68,0 до 89,6% после двух последовательных очисток.

8) 5'-O-H-T-P(S,OCN E)-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -3'-O-Lev (0,33 ммоль)

растворяют в 5 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 11 мл 2-пропанола (в соотношении 1:2,2), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 59,2 до 83,7% после двух последовательных очисток.

9) 5'-O-DMTr-T-P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -3'-O-Lev (0,26 ммоль)

растворяют в 5 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 11 мл 2-пропанола (в соотношении 1:2,2), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 57,6 до 94,3% после трех последовательных очисток.

10) 5'-O-DMTr-T-P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -3'-OH (0,22 ммоль)

растворяют в 10 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 30 мл 2-пропанола (в соотношении 1:3), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 90,1 до 95,2% после одной очистки.

11) 5'-O-DMTr-C ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-G ^iBu -3'-O-Lev (0,74 ммоль)

растворяют в 10 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 11 мл 2-пропанола (в соотношении 1:6), когда раствор нагрет до 55-60°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 47,6 до 80,6% после двух последовательных очисток.

12) 5'-OH-C ^Bz -P(S/OCNE)-G ^iBu -P(S/OCNE)-T-P(S/OCNE)-G ^iBu -3'-O-Lev (0,23 ммоль)

растворяют в 20 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 100 мл 2-пропанола (в соотношении 1:5), когда раствор нагрет до 55-60°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 70,2 до 85,2% после двух последовательных очисток.

13) 5'-O-DMTr-A ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-G ^iBu -3'-O-Lev (0,2 ммоль)

растворяют в 10 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 45 мл 2-пропанола (в соотношении 1:4,5), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 45,2 до 77,9% после двух последовательных очисток.

14) 5'-O-DMTr-A ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -P(S,OCNE)-T-P(S,OCNE)-G ^iBu -3'-OH (0,1 ммоль)

растворяют в 5 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 8 мл 2-пропанола (в соотношении 1:1,6), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 72,2 до 88,4% после трех последовательных очисток.

15) 5'-OH-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-A ^Bz -P(S,OCNE)-T-3'-O-Lev (0,72 ммоль)

растворяют в 25 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 120 мл 2-пропанола (в соотношении 1:4,8), когда раствор нагрет до 55-60°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 75,3 до 92,1% после двух последовательных очисток.

16) 5'-O-H-C ^Bz -P(S,OCNE)-G ^iBu -P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-C ^Bz -P(S,OCNE)-A ^Bz -P(S,OCNE)-T-3'-O-Lev (0,69 ммоль)

растворяют в 100 мл дихлорметана и нагревают до 40°C. Добавляют 300 мл 2-пропанола (в соотношении 1:3), когда раствор нагрет до 55-60°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 55,3 до 95,3% после трех последовательных очисток.

17) 5'-O-DMTr-C ^Bz -P(S,OCNE)-A ^Bz -P(S,OCNE)-T-3'-O-Lev (6,0 ммоль)

растворяют в 25 мл дихлорметана и 1 мл метанола и нагревают до 40°C. Добавляют 120 мл 2-пропанола (в соотношении 1:4,8), когда раствор нагрет до 50-55°C. После добавления 2-пропанола смесь охлаждают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 66,2 до 91,8% после двух последовательных очисток.

18) 5'-O-DMTr-T-P(O,OCN E)-C ^Bz -3'-OH (15,1 ммоль)

растворяют в 50 мл дихлорметана при 20°C. Добавляют 700 мл 2-пропанола (в соотношении 1:14), когда раствор нагрет до 30°C. После добавления 2-пропанола смесь перемешивают и охлаждают до комнатной температуры в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 79,2 до 91,3% после двух последовательных очисток.

19) 5'-O-DMTr-G ^iBu -P(O,OCNE)-T-P(O,OCNE)-T-P(O,OCNE)-G ^iBu -3'-O-Lev (0,76 ммоль)

растворяют в 10 мл дихлорметана и 1 мл метанола при 20°C. Добавляют 30 мл 2-пропанола (в соотношении 1:3) при перемешивании, при нагревании раствора до 30°C. После добавления 2-пропанола смесь перемешивают и охлаждают до комнатной температуры в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 79,2 до 91,3% после одной очистки.

20) 5'-O-DMTr-T-P(O,OCNE)-C ^Bz -P(O,OCNE)-G ^iBu -P(O,OCNE)-T-P(O,OCNE)-T-P(O,OCNE)-G ^iBu -3'-O-Lev (0,38 ммоль)

растворяют в 10 мл дихлорметана и 1 мл метанола при 20°C. Добавляют 50 мл 2-пропанола (в соотношении 1:5) при перемешивании, при нагревании раствора до 30°C. После добавления 2-пропанола смесь перемешивают и охлаждают до комнатной температуры в течение ночи. Очищенный продукт выделяют в виде бесцветного осадка. Чистота увеличивалась от 50,8 до 70,3% после одной очистки.

Способ очистки защищенных неионных олигонуклеотидов, включающий в себя следующие стадии: а) - получения раствора защищенного олигонуклеотида в, по меньшей мере, одном растворителе А, имеющем точку кипения ниже чем точка кипения растворителя В, - нагревания раствора до температуры, по меньшей мере, 30°С, но ниже точки кипения, по меньшей мере, растворителя А, - добавления растворителя В до видимого осаждения вещества в растворе, причем указанный растворитель В представляет собой спирт, содержащий от 1 до 6 атомов С, или диол, содержащий от 2 до 6 атомов С, - охлаждения раствора при перемешивании до образования супернатанта и осадка, - удаления супернатанта или b) - получения растворителя В, причем указанный растворитель В представляет собой спирт, содержащий от 1 до 6 атомов С, или диол, содержащий от 2 до 6 атомов С, - нагревание растворителя В до температуры выше 30°С, но ниже точки кипения растворителя В, - добавление раствора защищенного олигонуклеотида в, по меньшей мере, одном растворителе А до видимого осаждения вещества в растворе, - охлаждения раствора при перемешивании до образования супернатанта и осадка, - удаления супернатанта. Данный способ является эффективным, в частности для крупномасштабных синтезов олигонуклеотидов и их интермедиатов. 2 н. и 16 з.п. ф-лы.

1. Способ очистки неионных защищенных олигонуклеотидов, включающий стадии:
a) получения раствора защищенного олигонуклеотида в, по меньшей мере, одном растворителе А, имеющем точку кипения ниже, чем точка кипения растворителя В,
нагревания раствора до температуры, по меньшей мере, 30°С, но ниже точки кипения, по меньшей мере, растворителя А,
добавления растворителя В до видимого осаждения вещества в растворе, причем указанный растворитель В представляет собой спирт, содержащий от 1 до 6 атомов С, или диол, содержащий от 2 до 6 атомов С,
охлаждения раствора при перемешивании до образования супернатанта и осадка,
удаления супернатанта или
b) получения растворителя В, указанный растворитель В представляет собой спирт, содержащий от 1 до 6 атомов С, или диол, содержащий от 2 до 6 атомов C,
нагревания растворителя В до температуры выше 30°С, но ниже точки кипения, растворителя В,
добавление раствора защищенного олигонуклеотида в, по меньшей мере, одном растворителе А до видимого осаждения вещества в растворе,
охлаждения раствора при перемешивании до образования супернатанта и осадка,
удаления супернатанта.

2. Способ по п.1, где защищенный олигонуклеотид имеет длину от 2 до 30 нуклеотидов.

3. Способ по п.1 или 2, где защищенный олигонуклеотид имеет
3' и 5' защищенные группы,
5' защищенную группу и 3' незащищенную группу,
3' защищенную группу и 5' незащищенную группу.

4. Способ по п.3, где 5' защищенная группа представляет собой DMTr, MMTr, третбутилдиметилсилил (TBDMS), левуленил, бензоил, флоорофенилметоксипиперидинил (FPMP) или 9-фенилтиоксантен-9-ил (S-пиксил).

5. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где растворитель А выбирают из CH₂Cl₂, СНСl₃, тетрагидрофурана, ацетонитрила, метанола, этанола, дихлорэтана, тетрахлорэтана, диоксана, ацетона.

6. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где раствор защищенного олигонуклеотида содержит смесь растворителей, выбранных из группы, состоящей из СН₂Сl₂, СНСl₃, тетрагидрофурана, ацетонитрила, метанола, этанола, дихлорэтана, тетрахлорэтана, диоксана, ацетона.

7. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где раствор, содержащий защищенный олигонуклеотид и растворитель В, нагревают до температуры между 40 и 70°С.

8. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где растворитель В добавляют по каплям.

9. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где соотношение между объемом раствора защищенного олигонуклеотида и объемом растворителя В составляет от 1:1 до 1:100, предпочтительно от 1:1 до 1:10.

10. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где осадок представляет собой гель, масло или кристалл.

11. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где к осадку добавляют эфир, так что эфир затем удаляют вместе с примесями.

12. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где осадок повторно растворяют для образования раствора, содержащего, по меньшей мере, один растворитель А, и стадии п.1 повторяют, по меньшей мере, еще раз.

13. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где
а) растворитель В добавляют до видимого осаждения вещества в растворе даже при дальнейшем нагревании, или
b) раствор защищенного олигонуклеотида в растворителе А добавляют до видимого осаждения вещества в растворе даже при дальнейшем нагревании.

14. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где растворитель В выбирают из группы, состоящей из метанола, этанола, 1,2-дигидроксиэтана, 1-пропанола, 2-пропанола, бутанола и пентанола.

15. Способ по любому из пп.1, 2 или 4, где растворитель А представляет собой CH₂Cl₂ и растворитель В представляет собой 2-пропанол.

16. Способ очистки защищенного неионного олигонуклеотида, включающий в себя стадии
a) получение раствора защищенного неионного олигонуклеотида в, по меньшей мере, одном растворителе А,
b) соединение указанного раствора с растворителем В для формирования растворителя А+В, указанный растворитель В представляет собой спирт, содержащий от 1 до 6 атомов С, или диол, содержащий от 2 до 6 атомов С,
где растворимость (вес/объем) при 25°С защищенного неионного олигонуклеотида лучше в растворителе А, чем в растворителе В,
и где количества растворителя А и растворителя В выбирают так, чтобы получить насыщенный раствор неионного защищенного олигонуклеотида в растворителе А+В,
с) охлаждение раствора А+В, по меньшей мере, до 10°С для улучшения образования супернатанта и осадка,
d) образование супернатанта и осадка;
d) удаление супернатанта.

17. Способ по п.16, где растворитель А выбирают из СН₂СН₂, СНСl₃, тетрагидрофурана и диоксана.

18. Способ по п.16 или 17, где растворитель В выбирают из изопропанола, 1-пропанола или этанола.