Способ определения чувствительности лимфоцитов к левамизолу Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

05

.

CD

сл to Изобретение относится к медицине, а имен но к клинической иммунологии. Известен способ определения чувствительности лимфоцитов к ИММуНОМОДуЛЯТОраМ (ТИ мозину), включающий двухэтапное инкубированне лимфоцитов, обработанных иммуномоду лятором с эритроцитами барана, центрифугирование и подсчет Е-розеткообразующих клеток 1. Однако известный способ недостаточно чув ствителен. Целью изобретения является повышение чу ствительности способа. Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа, включающего двухэтапное инкубирование лимфоцитов, обработанных левомизолом с эритроцитами барана, центрифугирование и подсчет Е-розеткообразуюишх клеток, центрифугирование осуществл ют после первого зтапа инкубации лимфоцитов, обработанных левамизолом с эритроцитами барана, причем левамизол берут в концентрации 0,01 мкг/мл среды, содержащей Г10 лимфоцитов. Способ осуществляют следующим образом. , Берут 0,1-0,2 мл крови из пальца, выделяют Г 10 лимфоцитов для двух проб. Лимфоциты одной из проб обрабатывают иммуномодулятором (например, 0,01 мкг левамизола в 0,1 мл среды 199) и инкубируют один час при 37 С. Постановку реакции Е-розеткообразования проводят путем пятиминутного центрифугирования смеси суспензии лимфоцитов с 0,4%-нои взвесью, эритроцитов барана (соотношение 1:90) и двухэтапной инкубацией: 30 мин в термостате при 37 С и 18-20 ч в холодильнике при +10°С. Стимулирующий эффект иммуномодулятора (например, левамизола) определяют по разности процентного содержания Е-розеткообразуюших клеток, стимулированных иммуно модулятором (например, левамизолом), и спонтанных. Пример. 1. Выделение лимфоцитов. Кровь берут из пальца утром в одно и тоже время в количестве 0,1-0,2 мл в силиконированцую пробирку, содержащую 0,1 мл гепарина (25 ед. гепарина в I мл физиологи ческого раствора). Взятую кровь разводят средой 199 в 2 раза и наслаивают на 0,51 мл смеси фиколуротраст (фикол-верографин) - плотность раствора 1,077 г/мл. Центрифугируют 30 мин при 400 q в центрифуге с угловым ротором. Снимают белое кольцо (выделенная взвесь лимфоцитов) с интерфазной поверхности в чистую пробирку, отмывают средой 199 три раза в течение 10 мин при 200 q, затем проверяют жизнеспособность выделенных лимфоцитов по суправитальной окраске с трипановым синим и производят подсчет лимфоцитов в 1 мл. 2.Обработка, лимфоцитов левамизолом. К 0,1-0,2 мл взвеси лимфоцитов прибавляют 0,01 мкг левамизола в 0,1 мл среды 199, инкубируют 1 ч при 37°С в термостате, центрифугируют 5 мин при 200 q и с осадком ставят реакцию Е- розеткообразования. 3.Постановка реакции Е-розеткообразования. Реакцию ставят параллельно с двумя пробами лимфоцитов: чистой взвесью и с обработанными иммуномодулятором (например, левамизолом). К 0,1 мл суспензии лимфоцитов прибавляют 0,1 мл среды 199 и 0,1 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов барана (соотношение 1:90). Смесь Центрифугируют в течение 5 мин при 200 q, вьщерживают в термостате при 37° С 30 мин и оставляют на ночь (на 18-20 ч) при -10°С. На следующий день осадок осторожно ресуспендируют и производят подсчет в камере Горяева 200 лимфоцитов, вычисляют процент клеток, образовавших розетки не менее, чем с четырьмя эритроцитами барана. 4.Иммуностимулирующий эффект левамизола оценивают по разности процентного содержания розеткообразуюших клеток в пробах с иммуномодулятором и без него. Данные исследования чувствительности Лимфоцитов (in vitro) к синтетическому (левамиэолу) и естественному (тимозину) йммуномодуляторам представлены в табл. 1. Установлено, что наиболее оптимальной концентрацией левамизола при исследовании чувствительности к ним лимфоцитов (in vitro) является 0,01 мкг/мл (0,005-0,05 мкг/мл) тимозина - 100 мкг/мл согласно предлагаемому способу (табл. 1). Показана более высокая достоверность различий в числе Е-розеткообразующих клеток до и после обработки иммуномодулятором при использовании предлагаемого способа. Количество больших розеток (т.е. присоединивших 9 и более эритроцитов) достоверно выше при использовании предлагаемого способа, что позволяет повысить чувствительность метода и точность подсчета результатов.

310649524 Эффективность влияния различных доз левамизола и тимозняа на количество

Е-розеткообразующих клеток у детей с частыми распираторными заболеваниями согласно известному и предлагаемому способам

Т а б ли ц а 1

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИTE.FH HOCTH ЛЮЙФСЩИТОВ К ЛЕВАМИЗОЛУ. включающий двухэтапное инкубирование лимфоцитов, о аботанных яевамиэолом с эритроцитами барана, центрифугирование и подсчет Е-розеткообразующих клеток, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, центрифугирование осуществляют после первого этапа инкубации ЛИМФОШ4ТОВ, обработанных левамизолом с: эритроцитами барана, причем левамизол берут в концентрации 0,01 мкг/мл среды, содержащей ilO лимфоцитов.

Примечание. Р Р достоверность различий по сравнению с контролем, достоверность различий по сравнению с ранее известным способом.

Изменение последовательности соверишемых действий по нзвеспюму способу;

инкубация, центрифугирование, инкубация; при такой последовательности действий

образуется меньше розеток, особенно больших, по предлагаемому:

Известный способ (Т -4С) Температура -10° С является оптимальной для процесса розеткообразования, так как при ней образуется максимальное количество Е-ЮК, особенно больших. Преимушество использования 0,4%-ной взве си зритроцитов барана: согласно известному способу 5010 (500-10) 1:5;; , .,-:..-.

центрифугирование, инкубация; при такой последовательности действий образуется значительно большее количество розеток, особенно больших..

Данные, подтверждающие оптимальность температурного реяшма согласно предлагаемому способу, пред;ставлены в табл. 2.

Таблица2

Предлагаемый способ (Т -10° С) согласно предлагаемому способу 90-10 (90010) 1 : 90. Соотношение 1:90 обеспечивает оптимальный эффект розеткообразования. Таким образом, Предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность способа в 2-3 раза, а кроме того, позволяет сэкономить в 10 раз количество дорогостоящих реактивов и иммуномодулятора.