ВАКЦИННЫЙ АНТИГЕН, СПОСОБНЫЙ ИНДУЦИРОВАТЬ ПЕРЕКРЕСТНО РЕАГИРУЮЩЕЕ И НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ ПАПИЛЛОМАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА С ВЫСОКИМ РИСКОМ Российский патент 2013 года по МПК C07K14/25 A61K39/12 

Ссылка на связанные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на выдачу патента Японии номер 2007-167154, поданной 26 июня 2007 г., и все раскрытые в ней сведения включены в настоящее описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к вакцинному антигену, индуцирующему перекрестно реагирующие нейтрализующие антитела к папилломавирусам человека с высоким риском. В частности, настоящее изобретение относится к химерному белку, состоящему из белка L1 папилломавируса человека (ВПЧ) типа 16 и специфичного эпитопа L2 папилломавируса человека типа 16, включенного в конкретный участок, и капсиду, представляющему собой агрегат, образованный сборкой химерного белка. Капсид в соответствии с настоящим изобретением может применяться как антиген для использования в вакцине для профилактики заражения папилломавирусом человека, который может привести к раку шейки матки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Папилломавирус человека (ВПЧ) (фигура 1) является малым ДНК-вирусом и существует 100 или более генотипов. Пятнадцать генотипов (генотипы с высоким риском: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 и 73) вызывают рак шейки матки. ВПЧ16 обнаружен при 50-60% рака шейки матки. ВПЧ18 является следующим по распространенности в Европе и Соединенных Штатах, тогда как ВПЧ52 и ВПЧ58 часто обнаруживают в Японии. Хотя для ранней диагностики в Японии проводились массовые исследования, до сих пор у 15000 пациентов отмечают заражение, и число смертных случаев составляет 2500 пациентов ежегодно.

Капсид ВПЧ имеет правильный икосаэдрический скелет, состоящий из 72 пентамеров белка L1 (капсомеры) и связанных с ним 12 молекул белка L2. Обе концевых части белка L2 расположены в капсиде, но часть N-концевой области расположена на поверхности капсида (область поверхности L2) (фигура 2). Экспрессия белка L1 в большом количестве методом рекомбинантных ДНК дает возможность получить вирусоподобные частицы (VLP). Инокуляцией VLP или белка L2 папилломавируса коровы или американского кролика делают инокулируемых животных резистентными к изменению вируса. Фигура 2 - схематическое представление вида в разрезе - иллюстрирует ВПЧ и VLP.

В настоящее время отсутствует культивируемая линия клеток для пролиферации ВПЧ. Для мониторинга заражения ВПЧ используют псевдовирусы. Введение плазмиды, экспрессирующей секреторную щелочную фосфатазу (SEAP), имеющей точку начала репликации SV40, плазмиды, экспрессирующей белок L1, и плазмиды, экспрессирующей белок L2, в клетки человека 293, экспрессирующие SV40T антиген, приводит к включению реплицируемой SEAP-экспрессирующей плазмиды в L1/L2 капсид, что приводит к получению инфекционного псевдовируса (фигура 3). Активность нейтрализующих антител может быть определена посредством измерения ингибирующей активности псевдовирусной инфекции (непатентный документ 1).

У каждой антисыворотки, полученной инокуляцией VLP в ВПЧ животных, присутствует тип-специфичная нейтрализующая активность. Merck разработал вакцину в комбинации VLP от ВПЧ16 и ВПЧ18 и VLP от ВПЧ6 и ВПЧ11, которые предположительно являются причиной кондиломы acuminatum (доброкачественной), в то время как GlaxoSmithKline разработал вакцину в комбинации VLP ВПЧ16 и ВПЧ18 (непатентные документы 2 и 3).

Для этих вакцин были проведены широкие клинические исследования и показана их тип-специфичная противоинфекционная активность, и вакцина Merck была одобрена в 2006 г. FDA и Комиссией ЕС и разрешена к продаже в странах ЕС и США.

Как описано выше, иммунизация капсида L1 ВПЧ животным приводит к индукции сильного тип-специфичного иммунного ответа. Предварительные результаты клинических исследований при применении вакцины капсида L1 ВПЧ16 показали, что вакцина эффективна для предотвращения заражения ВПЧ16, но почти неэффективна для предотвращения других генотипов ВПЧ. Соответственно, до сих пор существует потребность в вакцинной профилактике рака шейки матки, а именно в вакцинном антигене, эффективном в отношении любых ВПЧ с высоким риском.

Авторы изобретения ранее разработали вакцинный антиген, используя обычный нейтрализующий эпитоп к ВПЧ с высокими рисками, который находится в области аминокислот 108-120 белка L2 ВПЧ16. Однако эпитоп имеет аминокислотную последовательность с гомологией приблизительно 60-75% с белками L2 с высоким риском, и антитело, индуцированное таким образом, связывалось с множеством ВПЧ с высоким риском, но имело более низкую эффективность связывания с ними, чем с ВПЧ16. Таким образом, до сих пор существует потребность в антигене, способном связываться с большим числом типов.

Авторы установили, что возможно приготовить вакцинный антиген, способный к индуцированию более мощного нейтрализующего обычные типы антитела посредством продуцирования химерного белка с белком L1 ВПЧ16 и включенной в него областью аминокислот 64-81 белка L2 ВПЧ16, и что вакцинный антиген представляет собой антиген, способным связываться с большим числом типов, который совместим по меньшей мере со всеми типами ВПЧ с высоким риском, и подали заявку на выдачу патента (WO2007/018049, патентный документ 1). Дополнительно, как описано выше, ввиду того факта, что частицы, образованные из химерного белка, состоящего из белка L1 ВПЧ 16 и области аминокислот 108-120 белка L2 ВПЧ16, включенного в белок L1 ВПЧ16, обладают сильной иммуногенностью и потенциалом для индуцирования нейтрализующего антитела, которое является обычным для ВПЧ с высокими рисками, то также химерный белок, состоящий из химерного белка, имеющего дополнительную область аминокислот 64-81, включенную в область аминокислот 109-117 L2 белка ВПЧ16, раскрывается в патентном документе 1.

Непатентный документ 1: Pastrana, D.V., Buck, C.B., Pang, Y.Y., Thompson, C.D., Castle, P.E., FitzGerald, D.C., Kruger, Kjaer, S., Lowy, D.R., Schiller, J.T., 2004. Reactivity of human sera in a sensitive, high throughput pseudovirus-based papillomavirus neutralization assay for HPV16 and HPV18. Virology. 321: 205-216.

Непатентный документ 2: Villa, L.L., et al.: Prophylactic quadrivalent human papillomavirus types (6, 11, 16 and 18) L1 virus-like particle vaccine in young women: a randomised double-blind placebo-controlled multicentre phase II efficacy trial. Lancet Oncology 6, 271-278, 2005.

Непатентный документ 3: Harper, D.M., et al.: Sustained efficacy up to 4,5 years of a bivalent LI virus-like particle vaccine against human papillomavirus type 16 and 18: follow up from a randomized control trial. Lancet 367 (9518), 1247-1255.

Патентный документ 1: WO 2007/018049.

Все сведения, раскрытые в непатентных документах 1-3 и патентном документе 1, указанным выше, включены в настоящее описание посредством ссылки.

В настоящее время коммерчески доступные вакцины ВПЧ эффективны только к ВПЧ16 и ВПЧ18 из 15 типов ВПЧ с высоким риском. Каждая VLP индуцирует тип-специфичное нейтрализующее антитело, и, таким образом, для индукции антител ко всем типам ВПЧ с высоким риском необходима смесь из 15 видов VLP, что создает трудности при приготовлении практического вакцинного антигена. Поэтому до сих пор существует потребность для разработки вакцинного антигена, который индуцирует перекрестно реагирующее нейтрализующее антитело.

Антиген, описанный в патентном документе 1, представляет собой антиген, совместимый по меньшей мере со всеми типами ВПЧ с высоким риском, обладающими значительным подобием. Несмотря на это, существует следующая проблема. Инфекционные псевдовирусы, которые использовали в исследовании патентного документа 1, были только ВПЧ16 и ВПЧ18, и антиген, описанный в патентном документе 1, показывал благоприятную нейтрализующую активность к этим инфекционным псевдовирусам. Однако в последующем нейтрализующем эксперименте с использованием инфекционных псевдовирусов от ВПЧ31, ВПЧ52 и ВПЧ58, недавно разработанных авторами, у антигена, описанного в патентном документе 1, обнаружили слабую нейтрализующую активность к ВПЧ31, ВПЧ52 и ВПЧ58.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении вакцинного антигена, индуцирующего перекрестно реагирующие нейтрализующие антитела к типам папилломавируса человека с высоким риском.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый объект по настоящему изобретению представляет собой капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка, состоящего из белка L1 папилломавируса человека (ВПЧ) типа 16 и эпитопа L2 ВПЧ16, включенного в область петли белка L1 ВПЧ16, где

область вставки эпитопа L2 представляет собой область аминокислот 430-433 и

эпитоп L2 представлен аминокислотной последовательностью:

LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (далее обозначаемая эпитоп 18-38 L2),

GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (далее обозначаемая эпитоп 56-75 L2) или

DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (далее обозначаемая эпитоп 96-115 L2).

Капсид в соответствии с настоящим изобретением включает следующие типичные варианты выполнения.

1) В указанном выше капсиде эпитоп L2 включает аминокислотную последовательность, в которой одна или более аминокислот делетированы или замещены или к которой добавлены одна или более аминокислот, где такие аминокислоты обеспечивают свойство капсида индуцировать перекрестно нейтрализующее антитело, подобное таковому от ВПЧ с первичным эпитопом L2.

2) Агрегат представляет собой агрегационный комплекс, образованный сборкой нескольких пентамерных капсомеров, каждый из которых состоит из пяти молекул химерного белка.

3) Агрегат, образованный сборкой нескольких пентамерных капсомеров, имеет структуру частицы.

4) Число пентамерных капсомеров, составляющих агрегат, находится в диапазоне 65-80.

5) Число пентамерных капсомеров, составляющих агрегат, составляет 72.

6) Капсид используют для получения вакцины капсида L1.

Второй объект по настоящему изобретению представляет собой капсидную смесь, включающую два или более видов капсидов в соответствии с настоящим изобретением.

Капсидные смеси в соответствии с настоящим изобретением включают следующие типичные варианты выполнения.

1) Капсидная смесь включает капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 18-38 L2, и капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 56-75 L2.

2) Капсидная смесь включает капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 18-38 L2, и капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 96-115 L2.

3) Капсидная смесь включает капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 56-75 L2, и капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 96-115 L2.

4) Капсидная смесь включает капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 18-38 L2, капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 56-75 L2, и капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 96-115 L2.

5) Капсидную смесь используют для получения вакцины капсида L1.

6) Капсидную смесь используют для получения вакцины капсида L1, которая может индуцировать нейтрализующие антитела по меньшей мере к папилломавирусам человека 16, 18, 31, 52 и 58.

Третий объект по настоящему изобретению представляет собой химерный белок, состоящий из белка L1 папилломавируса человека (ВПЧ) типа 16 и эпитопа L2 ВПЧ16, включенного в область петли белка L1 ВПЧ16, где область петли для вставки эпитопа L2 представляет собой область аминокислот 430-433, а эпитоп L2 представлен аминокислотной последовательностью:

LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (далее обозначаемая как эпитоп 18-38 L2),

GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (далее обозначаемая как эпитоп 56-75 L2) или

DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (далее обозначаемая как эпитоп 96-115 L2).

В обычном варианте выполнения химерного белка в соответствии с настоящим изобретением эпитоп L2 представляет собой аминокислотную последовательность, в которой одна или более аминокислот делетированы или замещены или к которой добавлены одна или более аминокислот, где такие аминокислоты обеспечивают свойство капсида индуцировать перекрестно нейтрализующее антитело, подобное таковому от ВПЧ с эпитопом L2.

Четвертый объект по настоящему изобретению представляет собой способ получения капсида в соответствии с настоящим изобретением, где капсид образован сборкой химерного белка, указанного выше.

Пятый объект по настоящему изобретению представляет собой способ получения капсидной смеси в соответствии с настоящим изобретением, включающий приготовление двух или более видов капсидов методом, соответствующим способу получения капсида по настоящему изобретению, и смешивание полученных капсидов.

Шестой объект по настоящему изобретению представляет собой комплекс гемоцианина фиссуреллы и эпитопа L2 папилломавируса человека типа 16, где эпитоп L2 имеет аминокислотную последовательность, представленную:

LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (далее обозначаемая эпитоп 18-38 L2),

GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (далее обозначаемая эпитоп 56-75 L2) или

DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (далее обозначаемая эпитоп 96-115 L2).

В обычном варианте выполнения комплексного соединения в соответствии с настоящим изобретением гемоцианин фиссуреллы и эпитоп L2 связаны через цистеин.

Настоящее изобретение обеспечивает L1 капсидный вакцинный антиген, в котором частица структуры обладает сильной иммунной активностью и L1 капсидный вакцинный антиген способен к значительному антигенпрезентирующему эпитопу L2 ВПЧ и который также способен к индуцированию нейтрализующего антитела, в частности индуцированию нейтрализующего антитела к ВПЧ16, 18, 31, 52 и 58. Если учитывать гомологию аминокислотных последовательностей L2 в 15 типах папилломавируса человека с высоким риском, описанных выше, L1 капсидный вакцинный антиген, способный к индуцированию нейтрализующего антитела к ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31, ВПЧ52 и ВПЧ58 в соответствии с настоящим изобретением, может весьма вероятно представлять собой антиген, который может охватить почти все 15 типов ВПЧ с высоким риском.

Некоторые вакцины VLP уже коммерциализированы, и продемонстрирована их тип-специфичная активность в отношении предотвращения заражения. Химерный VLP, разработанный авторами изобретения, представляет собой антиген, состоящий из основного вакцинного антигена и дополнительного эпитопа L2 перекрестной нейтрализации, сохраняет нейтрализующий эпитоп основной вакцины и таким образом индуцирует ВПЧ16-специфичное нейтрализующее антитело и также перекрестно реагирующее нейтрализующее антитело к ВПЧ18, ВПЧ31, ВПЧ52 и ВПЧ58. VLP состоит из 360 молекул белка L1, и, таким образом, у химерного VLP есть 360 эпитопов перекрестной нейтрализации L2. Т.е. получен новый вакцинный антиген в форме частицы, имеющий сильную иммунную активность и представляющий сильную перекрестную нейтрализацию эпитопом L2.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Капсид L1

Капсид L1 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой капсид, который является агрегатом, образованным сборкой химерного белка, состоящего из белков L1 папилломавируса человека (ВПЧ) типа 16 и эпитопа L2 папилломавируса человека 16, который включен в область петли белка L1 ВПЧ16.

Как описано выше, частица ВПЧ представляет собой правильный икосаэдрический капсид, состоящий из 72 капсомеров, каждый из которых содержит пять молекул белка L1. Значительная экспрессия белка L1 в клетке приводит к накоплению в ядре белков L1, автономно формирующих капсиды. Капсид, образованный из белков L1, называют капсидом L1 или вирусоподобной частицей (VLP). Одновременная экспрессия белков L1 и L2 приводит к образованию капсида L1/L2 (или VLP L1/L2), содержащего 12 молекул белка L2 в капсиде L1. Однако капсид L1 и капсид L1/L2 не могут быть дифференцированы электронной микроскопией.

Капсид L1 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой капсид на основе капсида L1 ВПЧ16. Но поскольку существует несколько генотипов ВПЧ, то каждый капсид обозначается соответствующим генотипом, например, таким, как ВПЧ16 или ВПЧ58. Таким образом, например, капсид L1 ВПЧ16 обозначается как капсид L1 16.

Капсид L1 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с эпитопами L2 ВПЧ16, включенными в белок L1 ВПЧ16. Далее химерный белок означает "химерный белок, содержащий эпитоп L2 ВПЧ16, включенный в область петли белка L1 папилломавируса человека (ВПЧ) типа 16", и настоящее изобретение включает такие химерные белки.

Эпитоп L2 ВПЧ16, включенный в белок L1, для получения химерного белка в соответствии с настоящим изобретением представлен аминокислотной последовательностью:

LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (эпитоп 18-38 L2),

GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (эпитоп 56-75 L2) или

DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (эпитоп 96-115 L2).

Эпитоп 18-38 L2 содержит 21 аминокислоту в области аминокислот 18-38 белка L2 ВПЧ16. Эпитоп 56-75 L2 содержит 20 аминокислот в области аминокислот 56-75 белка L2 ВПЧ16. Эпитоп 96-115 L2 содержит 20 аминокислот в области аминокислот 96-115 белка L2 ВПЧ16 (где 101-я и 112-я аминокислоты замещены соответственно лейцином и серином).

В настоящем изобретении аминокислотные остатки в белке нумеруются от аминоконца, и, например, 50-я аминокислота обозначается как аминокислота 50.

Множество клеточных белков могут связываться с поверхностной областью L2. Включение заместительных аминокислотных мутаций приводит к снижению инфекционности, что показывает, что поверхностная область L2 представляет собой функциональную область, необходимую для заражения ВПЧ (фигура 4). Аминокислотная последовательность этой области очень хорошо сохраняется во всех белках L2 ВПЧ с высоким типом риска (фигура 5). Авторы изобретения проводили исследования антисыворотки, полученной при иммунизации кроликов синтетическими пептидами с аминокислотной последовательностью в поверхностной области L2 ВПЧ16. Результаты будут описаны ниже в примере (таблица 1). Результаты в таблице 1 демонстрируют наличие эпитопов перекрестной нейтрализации в областях аминокислот 18-38, 49-75 и 96-115.

В частности, результаты, приведенные в таблице 1, показывают наличие эпитопов перекрестной нейтрализации для ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31 и ВПЧ58 в областях аминокислот 18-38, 56-75 и 96-115. Однако перекрестная реакционная способность к ВПЧ52 не изучалась на этой стадии.

Здесь, в области 96-115 101-й S был замещен на L и 112-й T на S. Мутантный эпитоп с L, заместившим 101-й S, и S, заместившим 112-й T, проявляет более сильное индуцирование перекрестнореагирующего антитела по сравнению с эпитопом с обычной природной аминокислотной последовательностью 96-115.

Результаты в таблице 1 показывают, что также присутствуют эпитопы перекрестной нейтрализации к ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31 и ВПЧ58 в области 49-68. Однако, поскольку химерный белок в области 49-75, включающей область 49-68, не образовывал структуру частицы, и гомология аминокислот L2 в области 49-55 не была высока для ВПЧ типа 15, как показано на фигуре 5, область 49-68 не изучалась в настоящем изобретении.

Таким образом были приготовлены химерные белки, включающие эпитоп перекрестной нейтрализации в области аминокислот 430-433 белка L1, и были продуцированы химерные VLP химерными белками.

Таким образом, настоящее изобретение относится к химерному белку, состоящему из белка L1 папилломавируса человека (ВПЧ) типа 16 и эпитопа L2 ВПЧ16, включенного в область петли белка L1 ВПЧ16, где

область петли для вставки эпитопа L2 представляет собой область аминокислот 430-433 и

эпитоп L2 представлен аминокислотной последовательностью:

LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (далее обозначаемая эпитоп 18-38 L2),

GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (далее обозначаемая эпитоп 56-75 L2) или

DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (далее обозначаемая эпитоп 96-115 L2).

Настоящее изобретение также относится к капсиду, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка. Агрегат состоит из нескольких пентамерных капсомеров, каждый из которых состоит из пяти молекул химерного белка и агрегата, состоящего из нескольких пентамерных капсомеров, предпочтительно имеющих структуру частицы для большей антигенности. Число пентамерных капсомеров, составляющих частицу, находится, например, в диапазоне от 65 до 80, предпочтительно составляет 72, и идентично числу в природных вирусах.

Природный VLP в общем случае содержит 360 молекул белка L1, и, соответственно, в частице присутствуют 360 эпитопов перекрестной нейтрализации (фигура 6). Химерный белок с последовательностью аминокислот от 18 до 38, от 56 до 75 или от 96 до 115 (101-я и 112-я аминокислоты замещены соответственно лейцином и серином) белка L2 ВПЧ16, включенного в область 430-433 белка L1 ВПЧ16, экспрессировался в клетках sf9 насекомых с использованием рекомбинантного бакуловируса, получая химерный VLP, который обозначали как Ch18/38, Ch56/75 или Ch96/115 (101L, 112S), соответственно (фигура 7). Электроннограмма на фигуре 7 показывает структуру частицы соответствующих химерных VLP. ELISA с этими химерными VLP в качестве антигенов показывал специфичное связывание антител с включенными эпитопами химерного VLP (как описано ниже в таблице 2 из примера), что показывает воздействие на эпитопы на поверхности VLP.

Антисыворотку готовили иммунизацией кроликов указанными химерными VLP. При проведении ELISA с использованием синтетического пептида с последовательностью, идентичной таковой из эпитопа перекрестной нейтрализации в качестве антигена, каждая иммунная сыворотка специфично реагировала с включенным эпитопом. Пептид 96/115 (101L, 112S) агрегировался легко с уменьшением количества, связанного на планшете ELISA, и, таким образом, полученный титр был немного ниже (как показано ниже в таблице 3 в примере).

Анализ нейтрализующей активности против псевдовирусов ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31, ВПЧ52 и ВПЧ58 показал, что антитело к Ch18/38 нейтрализовало ВПЧ16, ВПЧ18 и ВПЧ31; антитело к Ch56/75 - все типы ВПЧ; и антитело к Ch96/115 (101L, 112S) - ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31 и ВПЧ58 (отсутствовала нейтрализация ВПЧ58 с антисывороткой с низким титром) (как показано ниже в таблицах 4 и 5 из примера).

Было установлено, что вся антисыворотка хорошо реагировала с ВПЧ16, остовом для химерного VLP, что показывает, что эпитоп нейтрализации, присущий VLP, сохранялся и в химерных VLP. Поскольку инфекционные псевдовирусы состоят из 360 молекул белка L1 и 12 молекул белка L2, белок L2, чрезмерно продуцированный в образце, присутствует в свободном виде в клетке. По этой причине был получен довольно низкий титр нейтрализации анти-L2 антитела.

Эксперименты с папилломавирусом животных показали, что эффективность VLP вакцин и вакцин белка L2 почти одинакова, что показывает, что химерные VLP по настоящему изобретению могут применяться на практике как вакцинные антигены, индуцирующие образование антител к эпитопам перекрестной нейтрализации.

Эпитоп L2 может представлять собой аминокислотную последовательность, указанную выше, то есть представленную одной из SEQ ID NO:2-4, в которых одна или более аминокислот могут быть делетированы или замещены или к которым одна или более аминокислот могут быть добавлены, где аминокислоты обеспечивают капсид в соответствии с настоящим изобретением, индуцирующий перекрестно нейтрализующее антитело, подобное таковому от VLP с первоначальным эпитопом L2 (с аминокислотной последовательностью, представленной одной из SEQ ID NO:2-4).

Таким образом, эпитоп 18-38 L2 может включать мутантные аминокислотные эпитопы L2 с аминокислотной последовательностью, представленной LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (SEQ ID NO:2), в которой одна или более аминокислот делетированы или замещены или к которой добавлены одна или более аминокислот, которая обеспечивает капсид в соответствии с настоящим изобретением, индуцирующий перекрестно нейтрализующее антитело, подобное таковому от VLP ВПЧ16 с эпитопом 18-38 L2. Способность индуцировать перекрестно нейтрализующие антитела VLP ВПЧ16 с эпитопом 18-38 L2 показана в таблице 4.

Эпитоп 56-75 L2 может включать мутантные аминокислотные эпитопы L2 с аминокислотной последовательностью, представленной GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (SEQ ID NO:3), в которой одна или более аминокислот делетированы или замещены или к которой добавлены одна или более аминокислот, которая обеспечивает капсид в соответствии с настоящим изобретением, индуцирующий перекрестно нейтрализующее антитело, подобное таковому от VLP ВПЧ16 с эпитопом 56-75 L2. Способность индуцировать перекрестно нейтрализующие антитела VLP ВПЧ16 с эпитопом 56-75 L2 показана в таблице 4.

Аналогично эпитоп 96-115 L2 может включать мутантные аминокислотные эпитопы L2 с аминокислотной последовательностью, представленной DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (SEQ ID NO:4), в которой одна или более аминокислот делетированы или замещены или к которой добавлены одна или более аминокислот, которая обеспечивает капсид в соответствии с настоящим изобретением, индуцирующий перекрестно нейтрализующее антитело, подобное таковому от VLP ВПЧ16 с эпитопом 96-115 L2. Способность индуцировать перекрестно нейтрализующие антитела VLP ВПЧ16 с эпитопом 96-115 L2 показана в таблице 4. В настоящем описании большее количество аминокислот при делеции, замещении или добавлении составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.

Участок белка L1 в химерном белке в соответствии с настоящим изобретением, в который включен эпитоп L2, находится в области аминокислот 430-433 в области петли белка L1. Более конкретно, включаемый эпитоп L2 с аминокислотами 20-21 замещает эти четыре аминокислоты 430-433 в белке L1. Аминокислотная последовательность белка L1 ВПЧ16 показана как SEQ ID NO:1. Область 426-446, включающая аминокислоты 430-433, как предполагают, представляет собой область, распознаваемую как антиген, расположенный вне белка L1, исходя из структурного анализа белка L1 ВПЧ16, распространения нейтрализующих антитела эпитопов и положения цистеинового остатка, необходимого для формирования капсида, и т.д.

Количество эпитопов L2, включаемых в белок L1, составляет один на один белок L1. Однако по меньшей мере два различных вида эпитопов L2 могут быть включены в различные области петли в одном белке L1. Например, любой пептид, помимо трех эпитопов перекрестной нейтрализации, может быть включен в любой участок, помимо аминокислот 430-433 в белке L1. Альтернативно один из трех эпитопов перекрестной нейтрализации может быть включен в участок, помимо аминокислот 430-433 в белке L1.

Получение пептидов, содержащих эпитоп L2

Пептид L2 (аминокислоты 18-38, 56-75 или 96-115) может быть приготовлен обычным твердофазным методом с использованием Fmoc на автоматическом синтезаторе пептидов с 96 колонками. Пептид, который необходимо получить при приготовлении антитела, связывают с KLH (гемоцианин фиссуреллы) и цистеиновый остаток добавляют к N-концу для предотвращения маскировки области пептида KLH.

Настоящее изобретение включает комплексное соединение гемоцианина фиссуреллы и эпитопа L2 ВПЧ16. Эпитоп L2 представлен следующей аминокислотной последовательностью:

LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (эпитоп 18-38 L2),

GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (эпитоп 56-75 L2) или

DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (эпитоп 96-115 L2).

Гемоцианин фиссуреллы и эпитоп L2 связаны друг с другом предпочтительно через цистеин.

Приготовление белка с эпитопом L2 с включенным белком L1 (химерные белки)

Получали химерный ген L1, и химерный ген L1 экспрессировали с использованием бакуловирусного вектора, получая химерный белок L1 и химерный капсид. Химерный ген L1 готовили посредством ПЦР. Более конкретно, использовали следующую методику:

(A) Готовили пару праймеров с областями, которые следует включить.

(B) Набор праймеров, состоящий из праймера, имеющего область вставки, и праймера 1, и набор, состоящий из другого праймера, имеющего область вставки, и праймера 2, использовали для амплификации в ПЦР.

(C) Готовили два амплифицированных фрагмента ДНК с включенным фрагментом на одной стороне. Соответствующие комплементарные области соединяли для продолжения реакции.

(D) Готовили химерный ген, содержащий включенную ДНК.

(E) ПЦР выполняли с использованием включенной ДНК в качестве матрицы и праймеров 1 и 2.

(F) Таким образом амплифицировали ДНК, содержащую включенный ген.

Настоящее изобретение включает способ получения капсида, включающий его формирование в виде агрегата, образованного сборкой химерного белка в соответствии с настоящим изобретением. Как описано выше, химерный ген L1 готовили и экспрессировали с использованием бакуловирусного вектора, получая химерный белок L1. Химерные белки L1, продуцированные ранее, образуют автономный химерный капсид (капсид в соответствии с настоящим изобретением). Его экспрессия бакуловирусным вектором может быть выполнена по обычной известной методике, но условия предпочтительно оптимизированы для ускорения формирования автономного химерного капсида.

Капсид в соответствии с настоящим изобретением может быть использован для получения вакцины капсида L1. Вакцина капсида L1 может быть продуцирована, например, бакуловирусной экспрессирующей системой.

Настоящее изобретение включает капсидные смеси, содержащие два или более вида капсидов в соответствии с настоящим изобретением. Три вида капсидов в соответствии с настоящим изобретением могут отличаться друг от друга способностью индуцировать перекрестно нейтрализующее антитело, и использование двух или более таких капсидов, отличающихся способностью индуцировать перекрестно нейтрализующее антитело, в комбинации приводит к более высокой нейтрализующей активности.

Капсидная смесь в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой, например, смесь капсида, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 18-38 L2, и капсида, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным 56-75 L2 эпитопом. Два вида капсидов могут быть смешаны, например, в массовом соотношении в диапазоне от 1:100 до 100:1. Однако соотношение двух видов капсидов не ограничено указанным и может быть изменено в соответствии с требуемой иммуногенностью и нейтрализующей активностью индуцированных антител.

Капсидная смесь в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой, например, смесь капсида, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 18-38 L2, и капсида, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 96-115 L2. Два вида капсидов могут быть смешаны, например, в массовом соотношении в диапазоне от 1:100 до 100:1. Однако соотношение двух видов капсидов не ограничено указанным и может быть изменено в соответствии с требуемой иммуногенностью и нейтрализующей активностью индуцированных антител.

Капсидная смесь в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой, например, смесь капсида, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 56-75 L2, и капсида, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 96-115 L2. Два вида капсидов могут быть смешаны, например, в массовом соотношении в диапазоне от 1:100 до 100:1. Однако соотношение двух видов капсидов не ограничено указанным и может быть изменено в соответствии с требуемой иммуногенностью и нейтрализующей активностью индуцированных антител.

Капсидная смесь в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой, например, смесь капсида, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 18-38 L2, капсида, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 56-75 L2, и капсида, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 96-115 L2. Три вида капсидов могут быть смешаны, например, в массовом соотношении между соответствующими двумя видами капсидов в диапазоне от 1:100 до 100:1. Однако соотношение двух видов капсидов не ограничено указанным и может быть изменено в соответствии с требуемой иммуногенностью и нейтрализующей активностью индуцированных антител.

Капсидная смесь в соответствии с настоящим изобретением также может быть использована для получения вакцины капсида L1. Способ получения вакцины с использованием капсидной смеси аналогичен описанному выше.

Капсидная смесь в соответствии с настоящим изобретением используется для получения вакцины капсида L1, которая может индуцировать нейтрализующие антитела к ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31, ВПЧ52 и ВПЧ58.

ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров.

Пример 1

Приготовление пептидной кроличьей антисыворотки

Иммунизировали двух японских белых кроликов (от 2,5 кг до 3,0 кг). Использованный антиген представлял собой конъюгат химически полученного пептида и KLH (гемоцианин фиссуреллы). В первой сенсибилизации 0,5 мг антигена вводили подкожно с полным адъювантом Фрейнда. Через две недели после первого введения вводили 0,25 мг антигена подкожно с полным адъювантом Фрейнда. Кроликов аналогично сенсибилизировали дополнительно (0,25 мг) через 2, 4 и 6 недель, в общей сумме пять раз. Через неделю после последней сенсибилизации отбирали кровь и получали серологический образец (препарат был подготовлен Scrum Inc по контракту).

Кролика иммунизировали синтетическим пептидом с аминокислотной последовательностью области поверхности L2 ВПЧ16, и полученную иммунную сыворотку анализировали в эксперименте нейтрализации, описанном ниже. Полученные результаты приведены в таблице 1. Результаты, показанные в таблице 1, демонстрируют наличие эпитопов перекрестной нейтрализации в областях аминокислот 18-38, 49-75 и 96-115.

Эксперимент нейтрализации

1. Клетки 293FT (закуплены у Invitrogen) инокулировали на 96-луночном планшете с клеточной культурой в концентрации 10000 клеток/лунка за день до проведения эксперимента нейтрализации.

2. Сыворотку разбавляли буфером нейтрализации (среда DMEM без фенолового красного, содержащая 10% FCS, 1% заменимых аминокислот, 1% L-глютаминовой кислоты и 10 мМоль HEPES) и смешивали со штаммом инфекционного псевдовируса, и затем смесь оставляли при 4°C в течение одного часа, а затем добавляли к клеткам 293FT, инокулированным за день.

3. После культивирования в течение приблизительно 72 часов собирали 20 мкл супернатанта и определяли щелочную активность фосфатазы по методу Roden и др. (см. http://home.ccr.cancer.gov/lco/ColorimetricSEAP.htm).

Таблица 1
Нейтрализационная активность анти-L2 пептидных антител Антипептидное антитело ВПЧ16 ВПЧ18 ВПЧ31 ВПЧ58 anti-14/27 <50 <50 <50 <50   <50 <50 <50 <50 anti-18/38 800 50 <50 <50   400 100 <50 <50 anti-28/42 <50 <50 <50 <50   800 <50 <50 <50 anti-49/68 800 50 800 800 anti-56/75 400 200 200 400   200 50 100 200 anti-61/75 400 100 <50 500   800 200 <50 100 anti-64/81 3200 400 <50 100   800 200 <50 50 anti-90/111 200 <50 50 <50   200 <50 <50 <50 anti-96/115 200 <50 50 <50   400 <50 400 200 anti-96/115m 100 <50 200 200 (101L, 112S) 100 50 100 100 anti-107/122 100 <50 <50 50

anti-131/144 <50 <50 <50 <50   200 <50 <50 <50

Пример 2

Методика получения капсидного антигена

16 L1 и 16L1/L2 гены экспрессировали в рекомбинантной бакуловирусной системе. Рекомбинантный вирус готовили в экспрессирующей бакуловирусной системе Bac-to-Bac (GIBCO-BRL Inc., New York, NY) и экспрессировали в клетках Sf9 (клетки получены от Mamestra brassicae). 16L1 ген клонировали в вектор pFastbac1, получая pFastbac1/16L1. 16L1/L2 ген клонировали в вектор pFastbac dual, получая pFastbac dual/16L1/L2. Затем каждый клонированный вектор pFastbac вводили в DH10BAC E. coli (компетентная клетка с максимальной эффективностью, содержащая бакуловирусную ДНК и хелперную плазмиду, GIBCO BRL), получая Bacmid. ДНК Bacmid вводили в клетки sf-9, используя Effectene Transfection Reagent (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany), получая капсидный экспрессирующий белок рекомбинантный бакуловирус.

Рекомбинантный бакуловирус инфицировали в клетки sf-9 и после инкубации в течение 72 часов собирали клетки. Инфицированные клетки суспендировали в 0,5% растворе NP40; смесь выдерживали в течение 10 минут при комнатной температуре и центрифугировали (9000 об/мин, 15 минут, 4°C) для отделения ядерной фракции (преципитата) от цитоплазматической фракции. Ядерную фракцию повторно суспендировали в растворе 1,28 г/мл цезия хлорида в PBS, обрабатывали клетки ультразвуком для разрушения (Sonifier 250, Branson) и ультрацентрифугировали (34000 об/мин, 20 часов, 20°C) с использованием ротора SW50.1 (Beckman Coulter Inc, Fulleron, CA). Белок с удельной плотностью приблизительно 1,28 г/мл в градиенте хлорида цезия собирали и проводили диализ с 0,5 М NaCl-PBS, получая капсидный белковый раствор.

Последовательности аминокислот белка L2 ВПЧ16 18-38, 56-75 или 96-115 (101-я и 112-я аминокислоты замещены соответственно лейцином и серином) включали в область аминокислот 430-433 белка L1 ВПЧ16 при получении капсидного антигена, и полученный химерный белок экспрессировали в клетках насекомых sf9, используя рекомбинантный бакуловирус, получали химерные VLP, которые обозначали соответственно как Ch18/38, Ch56/75 и Ch96/115 (101L, 112S). Электроннограмма на фигуре 7 показывает частицы химерных VLP. ELISA с этими химерными VLP в качестве антигенов показывал специфичное связывание антител с включенными эпитопами, что показывает, что эпитопы были подвергнуты воздействию на поверхности VLP.

Методика проведения ELISA для капсида

1. Каждый капсидный антиген добавляли в количестве 1 мкг/100 мкл/лунка и смесь оставляли при 4°C на ночь.

2. После удаления антигенного раствора добавляли 350 мкл блокирующего раствора (5% обезжиренное молоко в PBS) и планшет оставляли еще на 2 часа при 37°C.

3. После удаления блокирующего раствора каждую лунку промывали раствором (0,05% Tween 20/0,05% NP40 в PBS) три раза.

4. Пятьдесят мкл антисыворотки, разбавленной в 500 раз блокирующим раствором, добавляли в каждую лунку, и раствор оставляли при комнатной температуре в течение 1 часа.

5. После удаления серологического образца лунку промывали девять раз, и HRP-связанные антикроличьи IgG антитела, разбавленные в 2000 раз, добавляли в каждую лунку в количестве 50 мкл. Раствор оставляли еще в течение 30 минут при комнатной температуре, и лунки промывали раствором шесть раз после удаления раствора.

6. Добавляли пятьдесят мкл раствора субстрата (24 мг o-фенилендиамина, растворенного в 12 мл цитратно-фосфатного буферного раствора с pH 5,0, содержащего 1,2 мкл H₂O₂), после окрашивания через 15 минут определяли интенсивность света при длине волны 450 нм, используя Immuno reader.

Применяя метод получения капсидного антигена (пример 2), химерные белки, каждый с последовательностью аминокислот 18-38, 56-75 или 96-115 (101-я и 112-я аминокислоты замещены соответственно лейцином и серином) белка L2 ВПЧ16, включенные в область аминокислот 430-433 белка L1 ВПЧ16, экспрессировали в sf9 клетки насекомых, используя рекомбинантный бакуловирус, получая химерные VLP, которые обозначали соответственно как Ch18/38, Ch56/75 и Ch96/115 (101L, 112S). Электроннограммы на фигуре 7 показывают частицы химерных VLP. ELISA с этими химерными VLP в качестве антигенов показывал специфичное связывание антител с включенными эпитопами с химерными VLP, что показывает, что эпитопы были подвергнуты воздействию на поверхности VLP. Полученные результаты показаны в таблице 2.

Таблица 2
Связывание антител против пептида L2 с химерным VLP Антиген/ VLP L1 ВПЧ16 Ch18/38 Ch56/75 Ch96/115 (101L, 112S) антисыворотка anti-P18/38 0,042 0,872 0,037 0,042 anti-P56/75 0,041 0,039 0,803 0,041 anti-P96/115 (101L, 112S) 0,040 0,043 0,045 0,821 (Абсорбция в ELISA с сывороткой, разбавленной 1 к 500 для пептидных антигенов и 1:2000 для VPL L1 ВПЧ16)

Антисыворотку готовили иммунизацией кроликов этими химерными VLP. Антисыворотку готовили способом, аналогичным описанному в примере 1 (однако доза химерного капсида составляла 50 мкг, и в качестве адъюванта использовали TiterMax (произведенный TiterMax, США)). ELISA с использованием синтетического пептида с последовательностью, идентичной таковой из эпитопа перекрестной нейтрализации, в качестве антигена показал, что каждая антисыворотка реагировала специфично с включенным эпитопом. Полученные результаты показаны в таблице 3. Пептид 96/115 (101L, 112S) агрегировал легко, что приводило к уменьшению количества, связывающегося с планшетом ELISA, и таким образом, полученный титр был немного ниже, чем полученный при других двух пептидах.

Таблица 3
Связывание антител против химерного VLP (сыворотка) с пептидом L2 Антиген/ VLP ВПЧ16 Пептид сыворотка Р18/38 Р56/75 Р96/115 (101L, 112S) анти-Ch18/38 #1 0,711 0,543 0,041 0,042   #2 0,633 0,402 0,039 0,039 анти-Ch56/75 #1 0,844 0,040 0,965 0,039   #2 0,354 0,037 0,135 0,042   #3 0,923 0,043 1,034 0,045   #4 0,854 0,042 0,972 0,041 анти-Ch96/115
(101L, 112S) #1 0,765 0,041 0,045 0,421 (0,170)*   #2 0,590 0,043 0,042 0,380 (0,158)* (Абсорбция в ELISA с сывороткой, разбавленной 1 к 500 для пептидных антигенов и 1 к 2000 для VPL ВПЧ16)
* показан второй результат
В скобках указан первый результат

Пример 3

Приготовление инфекционного псевдовируса

1. Плазмиду, экспрессирующую белок L1 ВПЧ16, плазмиду, экспрессирующую белок L2 ВПЧ16, и плазмиду, экспрессирующую секреторную щелочную фосфатазу, трансфицировали в клетки 293TT, используя Fugene HD. Клетки собирали через 72 часа после трансфекции.

2. Собранные клетки суспендировали в буфере с детергентом (0,5% Briji58, 0,5% Benzonase и 1% АТФ-зависимой плазмидобезопасной экзонуклеазы C в D-PBS (CaCl₂: 1 мМ, MgCl₂: 10 мМ)) и оставляли суспензию при 37°C на ночь.

3. После этого суспензию оставляли еще при 4°C на 10 минут и добавляли 5 М NaCl до конечной концентрации NaCl 850 мМ.

4. Клеточную суспензию центрифугировали при 1500×g в течение 10 минут и отбирали супернатант.

5. Собранный супернатант наносили слоем на 27%, 33% или 39% раствор Optiprep (произведенный AXIS-SHIELD PoC AS) (разбавленный PBS) и ультрацентрифугировали раствор при 50000 об/мин в течение 3 часов при 16°C.

6. После ультрацентрифугирования собирали каждую фракцию с нижней поверхности в количестве приблизительно 300 мкл, и фракцию с самым высоким титром использовали как инфекционную псевдовирусную фракцию в эксперименте инфицирования.

Эксперимент нейтрализации

1. Клетки 293FT (закуплены у Invitrogen) инокулировали на 96-луночном планшете с клеточной культурой в концентрации 10000 клеток/лунка за день до проведения эксперимента нейтрализации.

2. Сыворотку разбавляли буфером нейтрализации (среда DMEM без фенолового красного, содержащая 10% FCS, 1% заменимых аминокислот, 1% L-глютаминовой кислоты и 10 мМ HEPES) и смешивали со штаммом инфекционного псевдовируса, и затем смесь оставляли при 4°C в течение одного часа, а затем добавляли к клеткам 293FT, инокулированным за день.

3. После культивирования в течение приблизительно 72 часов собирали 20 мкл супернатанта и определяли щелочную активность фосфатазы по методу Roden и др. (см. http://home.ccr.cancer.gov/lco/ColorimetricSEAP.htm).

Нейтрализующую активность антихимерных антител VLP против псевдовирусов ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31, ВПЧ35, ВПЧ52 и ВПЧ58 определяли по методике, описанной выше. Полученные результаты показаны в таблице 4. Антитело к Ch18/38 нейтрализовало псевдовирусы ВПЧ16, ВПЧ18 и ВПЧ31. Антитело к Ch56/75 нейтрализовало все шесть видов псевдовирусов. Антитело к Ch96/115 (101L, 112S) нейтрализовало псевдовирусы ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31 и ВПЧ58 (нейтрализация антисыворотки с низким титром не наблюдалась с псевдовирусом ВПЧ58). VLP анти-ВПЧ16 в качестве сравнения нейтрализовал псевдовирусы ВПЧ16, ВПЧ31 и ВПЧ35.

Таблица 4
Нейтрализация псевдовирусов ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31, ВПЧ52 и ВПЧ58 антихимерной VLP сывороткой Нейтрализующий титр Сыворотка   ВПЧ16 ВПЧ18 ВПЧ31 ВПЧ35 ВПЧ52 ВПЧ58 анти-Ch18/38 #1 204,800 400 3,200 NT <50 <50   #2 102,400 200 50 NT <50 <50 анти-Ch56/75 #1 51,200 200 3,200 6,400 6,400 1,600   #2 1,600 <50 50 400 400 50   #3 51,200 800 50 100 50 400   #4 409,600 100 800 50 6,400 400   #5 204,800 100 3200 NT 3,200 800 анти-Ch96/115 (101L, 112S) #1 204,800 100 800 NT <50 50   #2 102,400 50 50 NT <50 <50 VLP анти-ВПЧ16   204,800 <50 800 50 <50 <50                

Кроме того, определяли нейтрализующую активность смесей антител (массовое соотношение: 1:1) к псевдовирусам ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31, ВПЧ52 и ВПЧ58. Полученные результаты показаны в таблице 5. Смесь антител к Ch18/38 и Ch56/75 и смесь антител к Ch56/75 и Ch96/115 (101L, 112S) нейтрализовали все пять типов псевдовирусов. Смесь антител к Ch18/38 и Ch96/115 (101L, 112S) нейтрализовала псевдовирусы ВПЧ16, ВПЧ18, ВПЧ31 и ВПЧ58.

Таблица 5
Нейтрализующая активность антихимерных VLP антител Нейтрализующий титр Смесь антисывороток ВПЧ16 ВПЧ18 ВПЧ31 ВПЧ52 ВПЧ58 анти-Ch18/38 #1 анти-Ch56/78 #1 204,800 800 3,200 3,200 400 анти-Ch56/78 #1 анти-Ch96/115
(101L, 112S) #1 204,800 200 3,200 3,200 400 анти-Ch18/38 #1 анти-Ch96/115 (101L, 112S) #1 204,800 200 1,600 <50 50

На следующие источники могут быть даны ссылки при описании выполнения экспериментов в примерах настоящего описания. Следующие источники и полное их содержание включены в данное описание посредством ссылки:

Справочная литература

1) Matsumoto. K, et al.: Antibodies to human papillomavirus 16, 18, 58, and 6b major capsid proteins among Japanese females. Jpn. J. Cancer Res., 88, 369-375, 1997.

2) Xiaojiang S. Chen, et al.: Structure of small virus-like particles assembled from the L1 protein of human papillomavirus 16. Mol. Cell., 5, 557-567, 2000.

3) Jean-Remy Sadeyen, et al.: Insertion of a foreign sequence on capsid surface loops of human papillomavirus type 16 virus-like particles reduces their capacity to induce neutralizing antibodies and delineates a conformational neutralizing epitope. Virology., 309, 32-40, 2003.

4) Ishii. Y, et al.: Mutational analysis of human papillomavirus type 16 major capsid protein LI: the cysteines affecting the intermolecular bonding and structure of LI capsids. Virology., 308, 128-136, 2003.

Промышленная применимость

Капсид в соответствии с настоящим изобретением является антигеном к ВПЧ16 VLP с дополнительным обычным эпитопом L2. Капсид содержит дополнительные 360 новых эпитопов в частице, сохраняя ее антигенность текущих вакцин. После исследований активности в предотвращении заражения с анти-L2 антителом он может быть использован как вакцинный антиген, который может предотвращать инфекцию всех типов канцерогенных ВПЧ. Возможно, он представляет собой второе поколение антигенной вакцины от ВПЧ, которая может предотвратить заражение заболеваний, связанных с ВПЧ с высоким риском, таких как цервикальный рак, который составляет 11% от всех женских злокачественных опухолей в мире (450 тысяч пациентов).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 представляет собой иллюстрацию для объяснения, что представляют собой частицы папилломавируса человека. Геном: двухспиральная кольцевая ДНК. Частица: правильный икосаэдр (55 нм). Различные млекопитающие постоянно заражаются папилломавирусами, специфичными к каждому из видов. Существует 100 или более типов ВПЧ, и заражение 15 типами (с высоким риском) может привести к цервикальному раку.

На фигуре 2 показаны изображения, поясняющие вирусоподобную частицу (VLP). Фактически отсутствует культивируемая линия клеток, подходящая для пролиферации ВПЧ. Экспрессия белка L1, например, рекомбинантным бакуловирусом приводит к его сборке в ядре, формируя VLP. Вакцины первого поколения содержат VLP типа 16 или типа 18 в качестве антигенов. Антигенность VLP в значительной степени тип-специфичная.

На фигуре 3 показаны изображения, поясняющие методику получения инфекционного псевдовируса.

На фигуре 4 показаны изображения, поясняющие область поверхности L2. Аминокислотная последовательность в области поверхности L2 канцерогенного ВПЧ, значительно гомологичная аминокислотным последовательностям, играет основную роль в инфекционности ВПЧ.

На фигуре 5 показана аминокислотная последовательность области поверхности L2 ВПЧ16.

На фигуре 6 представлены изображения, поясняющие приготовление химерного VLP включением эпитопа перекрестной нейтрализации в белок L1. Химерный VLP содержит 360 эпитопов L2 перекрестной нейтрализации. Антигенность и стабильность VLP были проверены.

На фигуре 7 показаны изображения, поясняющие химерные VLP, Ch18/38, Ch56/75 и Ch96/115 (101L, 112S) (включение аминокислотных последовательностей) и фотографии частиц. 16 L1 WT VLP - фотография нехимерного VLP.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. Описан химерный белок, включающий эпитоп L2 папилломавируса человека (ВПЧ) типа 16, включенный в область петли белка L1 папилломавируса человека типа 16; и капсид, который является агрегатом химерного белка. Область петли, в которую включается эпитоп L2, расположена между аминокислотным остатком в положении 430 и аминокислотным остатком в положении 433. Эпитоп L2 представлен аминокислотной последовательностью, имеющей любую из следующих формул: LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (18-38 Е2-эпитоп); GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (56-75 Е2-эпитоп) и DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (96-115 L2-эпитоп). Изобретение может быть использовано для получения вакцины против папилломавируса человека. 5 н. и 13 з.п. ф-лы, 7 ил., 5 табл., 3 пр.

1. Капсид для применения в вакцине для профилактики заражения папилломавирусом человека, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка, состоящего из белка L1 папилломавируса человека (ВПЧ) типа 16 и эпитопа L2 ВПЧ16, включенного в область петли белка L1 ВПЧ16, где
область для вставки эпитопа L2 является областью аминокислот 430-433 и эпитоп L2 представлен аминокислотной последовательностью:
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (далее обозначаемой эпитоп 18-38 L2),
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (далее обозначаемой эпитоп 56-75 L2) или
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (далее обозначаемой эпитоп 96-115 L2).

2. Капсид по п.1, где эпитоп L2 включает аминокислотную последовательность, где в указанной последовательности одна или более аминокислот делетированы или замещены или к которой добавлены одна или более аминокислот, где аминокислоты придают капсиду способность индуцировать перекрестно нейтрализующее антитело, подобное таковому при ВПЧ с исходным эпитопом L2.

3. Капсид по п.1 или 2, где агрегат представляет собой агрегат, образованный сборкой нескольких пентамерных капсомеров, каждый из которых составлен из пяти молекул химерного белка.

4. Капсид по п.3, где агрегат, образованный сборкой нескольких пентамерных капсомеров, имеет структуру частицы.

5. Капсид по п.4, где число пентамерных капсомеров, составляющих агрегат, находится в диапазоне от 65 до 80.

6. Капсид по п.4, где число пентамерных капсомеров, составляющих агрегат, составляет 72.

7. Капсид по п.1 или 2, применяемый для получения вакцины капсида L1.

8. Капсидная смесь для применения в вакцине для профилактики заражения папилломавирусом человека, включающая два или более вида капсидов по любому из пп.1-6.

9. Капсидная смесь по п.8, включающая капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 18-38 L2, и капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 56-75 L2.

10. Капсидная смесь по п.8, включающая капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 18-38 L2, и капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 96-115 L2.

11. Капсидная смесь по п.8, включающая капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 56-75 L2, и капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 96-115 L2.

12. Капсидная смесь по п.8, включающая капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 18-38 L2, капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 56-75 L2, и капсид, который представляет собой агрегат, образованный сборкой химерного белка с включенным эпитопом 96-115 L2.

13. Капсидная смесь по любому из пп.8-12, применяемая для получения вакцины капсида L1.

14. Капсидная смесь по любому из пп.8-12, применяемая для получения вакцины капсида L1, которая может индуцировать нейтрализующие антитела по меньшей мере к папилломавирусам человека 16, 18, 31, 52 и 58.

15. Химерный белок, состоящий из белка L1 папилломавируса человека (ВПЧ) типа 16 и эпитопа L2 ВПЧ16, включенного в область петли белка L1 ВПЧ16, для применения в вакцине для профилактики заражения папилломавирусом человека, где
область петли для вставки эпитопа L2 является областью аминокислот 430-433, и
эпитоп L2 представлен аминокислотной последовательностью:
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (далее обозначаемой эпитоп 18-38 L2),
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL (далее обозначаемой эпитоп 56-75 L2) или
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (далее обозначаемой эпитоп 96-115 L2).

16. Химерный белок по п.15, где эпитоп L2 представляет собой аминокислотную последовательность, где в указанной последовательности одна или более аминокислот делетированы или замещены или к которой добавлены одна или более аминокислот, где аминокислоты придают капсиду, составленному из химерного белка, способность индуцировать перекрестно нейтрализующее антитело, подобное таковому от ВПЧ с эпитопом L2.

17. Способ получения капсида по любому из пп.1-6, где способ включает формирование капсида путем сборки химерного белка по п.15 или 16.

18. Способ получения капсидной смеси по любому из пп.8-14, включающий получение двух или более видов капсидов способом по п.17 и смешивание полученных капсидов.