ИНГИБИТОР РЕПРОДУКЦИИ ВИЧ-1 И ВИРУСА ГРИППА А Российский патент 2013 года по МПК A61K31/56 A61P31/16 A61P31/18 

Изобретение относится к области фармакологии и касается средств с противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) и вируса гриппа A (H7N1).

Перспективной основой для получения разнообразных биологически активных производных являются природные пентациклические тритерпеноиды бетулин и бетулиновая кислота.

Бетулиновая кислота проявляет ингибирующую активность в отношении репродукции ВИЧ-1 (ЕС₅₀ 1,4 мкМ) [Т.Fujioka, Y.Kashiwada, R.E.Kilkuskie, L.M.Cosentino, L.M.Ballas, J.B.Jiang, W.P.Janzen, I.-S.Chen, K.-H.Lee. Anti-AIDs agents. II. Betulinic acid and platanic acid as anti-HIV principles from Syzigium claviflorum, and the anti-HIV activity of structurally related triterpenoids // Journal of Natural Products. - 1994. - №57. - С.243-247], но практически не активна (ЕС₅₀>219,0 мкМ) в отношении вируса гриппа A [N.I.Pavlova, O.V.Savinova, S.N.Nikolaeva, E.I.Boreko, O.B.Flekhter. Antiviral activity of betulin, betulinic and betulonic acids against some enveloped and non-enveloped viruses // Fitoterapia. - 2003. - V.74. - P.489-492].

Обнаружение анти-ВИЧ свойств у бетулиновой кислоты стимулировало работы по ее дальнейшей химической модификации.

Противовирусная активность наиболее часто обнаруживается у азотсодержащих тритерпеновых производных лупанового типа - соответствующих амидов, пептидов, гидразидов, гидразонов и оксимов.

Так, высокой (ЕС₅₀ 2,17 мкМ) противовирусной активностью в отношении вируса гриппа А обладает 3-оксим бетулоновой кислоты [О.Б.Флехтер, Е.И.Бореко, Л.Р.Нигматуллина, Н.И.Павлова, И.И.Медведева, С.Н.Николаева, Е.В.Третьякова, O.B.Савинова, Л.А.Балтина, Л.Т.Карачурина, Ф.З.Галин, Ф.З.Зарудий, Г.А.Толстиков. Синтез и фармакологическая активность ацилированных оксимов бетулоновой кислоты и 28-оксоаллобетулона // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. - Т.38. - №3. - С.31-34], сведения об антиретровирусной активности которого отсутствуют.

Азотсодержащие тритерпеновые производные представляют интерес и в качестве синтетической основы для новых фармакологически активных соединений.

Так, неактивный в отношении ВИЧ-1 диоксим 3-оксобетулин-28-аля является ключевым интермедиатом в синтезе анти-ВИЧ активных агентов [I.-C.Sun, H.-K.Wang, Y.Kashiwada, J.-K.Shen, L.M.Cosentino, C.-H.Chen, L.-M.Yang, K.-H.Lee. Synthesis and structure-activity relationships of betulin derivatives as anti-HIV agents // Journal of Medicinal Chemistry. - 1998. - V.41. - №23. - P.4648-4657].

Одна из основных проблем антиретровирусной терапии - высокая стоимость специфичных противовирусных препаратов, которая значительно возрастает в условиях развития ВИЧ-ассоциированных заболеваний. В связи с этим актуальной является разработка препаратов с возможностью одновременного антивирусного действия в отношении нескольких вирусов, включая ВИЧ-1.

Наиболее близким аналогом (прототипом) настоящего изобретения является 28-оксим бетулиналя [О.Б.Флехтер, О.Ю.Ашавина, Е.И.Бореко, Л.Т.Карачурина, Н.И.Павлова, Н.Н.Кабальнова, О.В.Савинова, Ф.З.Галин, С.Н.Николаева, Ф.С.Зарудий, Л.А.Балтина, Г.А.Толстиков. Синтез 3-O-ацетилбетулинового и бетулонового альдегидов по Сверну и фармакологическая активность их оксимов // Химико-фармацевтический журнал. - 2002. - Т.36. - №6. - С.21-24]. Однако известно о противовирусном действии 28-оксима бетулиналя только в отношении вируса гриппа А (ЕС₅₀ 0,43 мкМ и МПК/ЕС₅₀ 31,3).

Задачей изобретения является разработка средства с противовирусной активностью в отношении нескольких вирусов для расширения арсенала противовирусных средств.

Для решения задачи предлагается ингибитор репродукции ВИЧ-1 и вируса гриппа А, представляющий собой 2-гидроксимино-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овую кислоту.

2-Гидроксимино-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овая кислота известна в качестве промежуточного соединения для получения 1-циано-2,3-секолуп-20(29)-ен-3-аль-28-овой кислоты, проявляющей противовирусную активность в отношении вирусов герпеса простого I типа и гриппа А [патент РФ №2410390. 2,3-Секопроизводные бетулиновой кислоты / Толмачева И.А., Гришко В.В., Бореко Е.И., Савинова О.В., Павлова Н.И. Опубл. 27.01.2011]. Сведения о противовирусной активности соединения, заявляемого в качестве ингибитора, отсутствуют.

Пример 1. Методика исследования противовирусной активности в отношении ВИЧ-1

Испытания проводили на перевиваемой суспензионной Т-лимфо-бластоидной линии клеток человека МТ-4 (плотность 4-5×10⁵ клеток/мл) на питательной среде RPMI-1640 Sigma-Aldrich (США). В качестве инфекционного агента использовали высокорепликативный изолят ВИЧ-1_zmb с титром 6,0 lg ТЦД₅₀. Определение наличия анти-ВИЧ активности проводили с помощью формазанового теста в МТТ-варианте. Исходный раствор препарата (10,3 мкМ) готовили ex tempore путем растворения в 10% этаноле. Базовый раствор титровали в лунках 96-луночной панели, после чего в лунки последовательно вносили клетки и вирус (терапевтическая схема). Конечный объем реакционной смеси составлял 200 мкл/лунку. Контролями служили необработанные препаратом ВИЧ-инфицированные клетки (контроль вируса) и необработанные препаратом неинфицированные клетки (контроль клеток). Панели инкубировали в атмосфере, содержащей 5% CO₂ при 37°С. Учет результатов осуществляли через 72 ч. В качестве позитивного контроля на анти-ВИЧ активность использовали коммерческий препарат азидотимидина, который титровали параллельно с исследуемым образцом.

Методика базируется на определении интенсивности образования формазанового продукта при внесении в клеточную культуру реагента МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид). После 3-часовой экспозиции при 37°С надосадок удаляли, а образовавшийся формазановый продукт растворяли в диметилсульфоксиде, затем проводили измерение интенсивности развившегося окрашивания на спектрофотометре Plate Reader DAS A3 (Италия) при длине волны 550/630 нм. Результаты теста учитывали путем определения индекса защиты клеток, который в положительных случаях должен быть не ниже 50%. Вычисляли ЕС₅₀ препарата и соотношение МПК/ЕС₅₀, характеризующее широту спектра его нетоксических эффективных концентраций.

Пример 2. Исследование противовирусной активности в отношении вируса гриппа А

При проведении испытаний использовали культуру клеток первичных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), а также вирус гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7N1). Исследования проводили методом редукции количества бляшек под агаровым покрытием. Монослойную культуру ФЭК, выращенную во флаконах, отмывали от ростовой среды, инфицировали различными разведениями вируса в пределах 0,01-0,0001 БОЕ/клетка путем нанесения на клетки вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37°С. Затем жидкость удаляли и клетки покрывали расплавом питательной среды на основе концентрата среды 199 с добавлением 1% бактагара и 0,005% нейтрального красного (все реактивы - Sigma) и различных концентраций исследуемого препарата. После застывания покрытия флаконы помещали в термостат на 36 ч и затем подсчитывали количество бляшек, видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя.

Титр вируса в присутствии исследуемого вещества и в контроле рассчитывали в lg БОЕ (бляшкообразующих единиц) в 1 мл. Первичным критерием противовирусного действия считали наличие различий в сравнении с контролем вируса. Обработку полученных данных (вычисление титра вируса и средней ошибки средней арифметической, Sx) выполняли методами статистики для малых значений n в несгруппированном ряду данных. Концентрацию вещества, подавляющую размножение вируса на 50% (среднеэффективная концентрация, ЕС₅₀), определяли на основе пробит-анализа и взвешенной линейной регрессии. Вычисляли также отношение максимальной переносимой концентрации (МПК) вещества к ЕС₅₀. МПК определяли как максимальную концентрацию вещества, не оказывающую влияния на морфологию неокрашенной культуры клеток и нарушения поглощения ей витального красителя (нейтрального красного).

В результате исследований установлено, что 2-гидроксимино-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овая кислота обладает способностью подавлять репродукцию ВИЧ-1 и вируса гриппа А в диапазоне концентраций 3,1-0,06 и 824,7-12,9 мкМ соответственно (см. таблицу).

Противовирусные свойства 2-гидроксимино-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овой кислоты МПК МТ-4/RD, мкМ Противовирусные свойства ВИЧ-1 вирус гриппа А ЕС₅₀, мкМ отношение МПК/ЕС₅₀ ЕС₅₀, мкМ отношение МПК/ЕС₅₀ 3,1/824,7 0,06 51,5 12,9 64,1

Установлено, что в отличие от прототипа с избирательным действием в отношении одного из вирусов, 2-гидроксимино-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овая кислота сочетает выраженное антиретровирусное (анти-ВИЧ) действие с противовирусной активностью в отношении вируса гриппа А, что позволяет рассматривать данное соединение в качестве перспективного ингибитора репродукции вирусов.

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается ингибитора репродукции ВИЧ-1 и вируса гриппа А, представляющего собой 2-гидроксимино-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овую кислоту и обладающего высокой противовирусной активностью. 1 табл., 2 пр.

Ингибитор репродукции ВИЧ-1 и вируса гриппа А, представляющий собой 2-гидроксимино-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овую кислоту.