СПОСОБ АНАЛИЗА ПРОЦЕССА Арг-Х ПРОТЕОЛИЗА В ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ФРАКЦИЯХ БЕЛКОВ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР В РАСТУЩЕЙ ПОПУЛЯЦИИ ESCHERICHIA COLI Российский патент 2013 года по МПК C12N9/16 C07K1/18 C07K14/245 

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии прокариотической клетки и может быть применено к анализу молекулярно-генетических механизмов формирования структуры клетки прокариот и роли белковых компонентов в их организации, а также особенностей ремоделирования генома, что является необходимым для раскрытия путей регулирования механизмов воздействия макро- и микроорганизмов, а также поиску новых мишеней для лекарственных средств и разработке экологически безопасных лечебных препаратов.

Также известен способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью [1], в котором в супраструктурах клеточных ядер растений были определены протеолитическая и ингибиторная активности.

Недостатком этого способа является то, что анализ осуществлялся в суммарных фракциях белков клеточных ядер растений, без разделения их на гистоновые и негистоновые белки с помощью ионообменной хроматографии на амберлите ИРЦ-50.

Известен способ препаративного выделения основных (положительно заряженных) белков клеточных ядер растений [2], в котором был описан способ фракционирования гистонов с помощью ионообменной хроматографии на колонке с амберлитом ИРЦ-50.

Недостатком способа является то, что в полученных ядерных фракциях не были определены сайты чувствительности к Арг-Х протеолизу.

Известен способ получения фракции из клеток Escherichia coli [3], обладающей протеолитической активностью. Недостатком этого способа является то, что не было проведено разделение полученных белков на положительно заряженные (основные) и неосновные (отрицательно заряженные и нейтральные) с помощью ионообменной хроматографии на колонке с амберлитом ИРЦ-50.

Вышеуказанный способ получения фракции из клеток Escherichia coli [3], обладающей протеолитической активностью, был принят за основу, в нем первоначально проводят консервацию клеток в присутствии забуференного 80-90% глицерина с последующим снятием клеточных оболочек 3% тритоном Х-100, экстракцию возрастающими концентрациями солей: 0,14 М, 0,35 М; 2 М NaCl, 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% β-меркаптоэтанолом, аффинную хроматографию на сефарозе 4В с иммобилизованным ингибитором трипсина и последующей оценкой в элюатах протеолитической активности.

Цель изобретения - предлагается способ для получения положительно заряженных белковых фракций с сайтами чувствительности к Арг-Х протеолизу в растущей популяции Escherichia coli.

Указанная цель достигается тем, что в способе получения положительно заряженных белковых фракций с сайтами чувствительности к Арг-Х протеолизу в растущей популяции Escherichia coli первоначально проводят консервацию клеток в присутствии забуференного 80-90% глицерина с последующим снятием клеточных оболочек 3% тритоном Х-100, экстракцию возрастающими концентрациями солей: 0,14 М, 0,35 М; 2 М NaCl, 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделяют из вышеперечисленных фракций положительно заряженные белки с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8 и определяют в них сайты чувствительности к Арг-х протеолизу.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример. Опыты проводили на протяжении жизненного цикла клеток штамма Е. coli JC-158 (Hfr PO1, thi1, serA6, lacI22, relA1) [4], предоставленного Ступак И.В. и Ступак Е.Э., выращивание культуры проводилось Тропыниной Т.С. (Институт биологии УНЦ РАН, лаборатория математической и молекулярной генетики) и штамма E.coli 5а, предоставленного Маркушевой Т.В. (Институт биологии УНЦ РАН, группа генетики микроорганизмов). В работе для выращивания использовалась богатая питательная среда LB (Луриа-Бертани). В одном литре дистиллированной воды растворялись при помешивании (на магнитной мешалке типа MM 2А): бакто-триптон (Difco, США) - 10 г; дрожжевой экстракт (Difco, США) - 5 г; NaCl -10 г, рН до 7,5. Среда стерилизовалась при 120-123°С, при давлении пара 1 атм в стандартном автоклаве.

Бактериальные клетки, использованные в эксперименте, первоначально находились в агаризованных столбиках LB (на 1 литр среды 1,5 г агар-агара, Difco, США) и хранились при температуре 4°С. При такой температуре и практически полном отсутствии кислорода происходит замедление всех физиологических процессов в клетках. Для того чтобы перевести клетки в "нормальное физиологическое состояние", а именно аэробное дыхание, бактериальную культуру из агаризованного столбика в стерильных условиях переносили с помощью бактериологической петли в жидкую среду LB в объеме 5 мл, находящуюся в химической пробирке объемом 20 мл, закрывали ватно-марлевой пробкой и инкубировали при 37°С, 160 об/мин на лабораторном термостатируемом встряхивателе (П5.10-Э5960) в течение 16 часов. Отдельно выросшая хорошо сформировавшаяся колония бактерий с агаризованной средой LB пересевалась с помощью бактериологической петли в жидкую среду LB в объеме 5 мл и инкубировалась при 37°С, 160 об/мин 7 часов. Затем 100 мкл подросшей культуры клеток пересевалось в свежую жидкую среду LB в объеме 5 мл и инкубировалось при 37°С, 160 об/мин 16 часов. 2 мл культуры клеток вносилось в кювету с рабочей длиной 5,075 мм, и измерялась оптическая плотность на колориметре фотоэлектрическом концентрационном (КФК-2) при длине волны 590 нм. Это значение составляло 1,0. В свежую жидкую среду LB в объеме 120 мл в 500 мл колбе высевалось 120 мкл 16-часовой культуры и проводилось инкубирование при 37°С, 160 об/мин в течение 7 часов 10 минут. Первая проба была взята через 50 минут после начала инкубирования. Оптическая плотность первой пробы составляла 0,005. Для дальнейшего анализа отбирались образцы в объеме 1,5 мл. Клетки осаждались центрифугированием при 12 000 об/мин на центрифуге Эппендорф в течение 5 мин. Надосадочная жидкость удалялась, осадки подсушивались. К осадкам добавлялось по 50 мкл среды следующего состава: 80-90% глицерин на 0,01 М трис-HCl буфере рН 6.8 с добавлением 0.005 М MgCl₂; 0.025 М KCl; 0.003 М CaCl₂; 0.005 М NaCl для консервации клеток при минус 25°С. Последующие пробы отбирались через каждые 20 минут в течение 7 часов 10 минут. Далее осадки клеток промывали 3% тритоном Х-100 в среде следующего состава: 0.02М триэтаноламин (ТЭА)·HCl рН 6.8; 0.005 М MgCl₂; 0.025 М KCl; 0.003 М CaCl₂; 0.005 М NaCl рН 6,8; встряхивали в течение 30 мин на микрошейкере (Micro-shaker type 326 m, Польша), с последующим центрифугированием при 4000 об/мин (К-23, ГДР) в течение 20 мин для снятия клеточной оболочки, после чего осадок дважды промывали в среде следующего состава: 0.005 М MgCl₂; 0.025 М KCl; 0.003 М CaCl₂; 0.005 М NaCl; 0,01 М трис-HCl рН 6.8 с последующим центрифугированием при вышеуказанных условиях.

Бактериоплазматические белки экстрагировали 0,14 М NaCl, 0.01 М трис-НС1 рН 6.8 буфером. Фракцию непрочносвязанную с клеточным остатком выделяли путем экстракции осадка 0,35 М NaCl, 0.01 М трис-HCl рН 6.8 буфером. Далее осадок фракционировали суспендированием в трис-HCl буфере с 2 М NaCl, получая фракцию прочносвязанную с клеточным остатком. В осадке оставалась фракция, содержащая клеточный остаток с клеточной оболочкой.

Последующую экстракцию проводили 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% β-меркаптоэтанолом на трис-HCl буфере. В вышеуказанном буфере осадок растворялся полностью. Клеточные фракции хранили при -196° в азоте.

Количество белка определяли по связыванию белка с кумасси ярко-синим G (Loba, Австрия) [1]. Метод использовался в случае микро-наноколичественного определения белка. Полученные фракции пропускали через колонку с амберлитом ИРЦ-50 (полиментакриловая синтетическая смола со свободными карбоксильными группами). Смола использовалась в виде порошка, получаемого при размалывании в шаровой мельнице. Размельченная смола просеивалась через сито 200 меш, после чего многократно промывалась водой для удаления мельчайших частиц, высушивалась и промывалась ацетоном. Для достижения большей хроматографической эффективности проводили циклизацию. К 100 г смолы добавляли 500 мл 4 н. NaOH, перемешивали в течение 3 ч с последующим отмыванием на фильтре водой до нейтральной реакции и переводили в кислую форму, пропуская через нее 500 мл 4 М HCl, избыток HCl удаляли промыванием водой. Этой смолой заполняли колонку размером 0,4×4,5 см. На колонку наносили белок в количестве 20-50 мкг, растворенный в 6% гуанидин гидрохлориде на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8. Скорость элюции составляла 6 мл/ч. Препаративное отделение основных белков протеома клеток Е. coli проводили в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8. Содержание белка в элюатах определяли методом Бредфорд в нашей модификации [1]. В работе использовался отечественный препарат гуанидин гидрохлорида («Реахим»), который предварительно был очищен. Неперекристаллизованный препарат имеет высокое поглощение в ультрафиолете. Перекристаллизация проводилась по методу, описанному Луком [5]. Концентрацию гуанидин гидрохлорида определяли рефрактометрически при комнатной температуре. Расчет концентрации велся исходя из рефрактометрического индекса [6], используя следующее соотношение:

где n²⁵ Gu HCl - показатель преломления гуанидин гидрохлорида (величина, зависящая от концентрации препарата); n²⁵ 0,1 М натрий-фосфатный буфер - показатель преломления этого буфера (величина постоянная для данной концентрации); показатель 25 указывает на температуру, при которой проводились рефрактометрические исследования.

Описанным методом удалось отделить положительно заряженные белки от отрицательно заряженных и нейтральных в полученных, как описано выше, супрамолекулярных структурах (Бп, HC-I НС-II, КО). Было получено 4 фракции: фракция, незадержавшихся (отрицательно заряженных и нейтральных) белков и 3 фракции белков, полученных элюцией 8,9%, 10,6% и 13% концентрации гуанидин гидрохлорида (положительно заряженные белки). В полученных фракциях белков из супрамолекулярных структур растущей популяции Escherichia coli были определены сайты чувствительности к Арг-Х протеолизу. Арг-х протеазочувствительность определяли по расщеплению низкомолекулярного белка протамина («Calbiochem», США) [1]. Количество освободившегося аргинина рассчитывали, пользуясь калибровочным графиком. В качестве стандарта использовали D,L-apгинин («Reanal», Венгрия). Активность выражали в нмоль аргинина на 1 мг/с.

На фиг.1 представлена кривая роста штамма Е. coli JC-158. На оси ординат показана оптическая плотность периодической культуры. На оси абсцисс показан возраст периодической культуры в мин, измеряемой в течение 7 часов 10 минут в растущей культуре клеток на фоне фаз роста растущей популяции E.coli.

На фиг.2 показано содержание белка в ступенчато-градиентных фракциях гуанидин гидрохлорида (6%, 8,9%, 10,6%, 13% GuHCl), элюированных из бактериаплазмы растущей популяции E.coli. На оси абсцисс показано время роста популяции E.coli с обозначением фаз роста, мин. На оси ординат - содержание белка на 1 клетку, фермитограмм.

На фиг.3 показано содержание белка в ступенчато-градиентных фракциях гуанидин гидрохлорида (6%, 8,9%, 10,6%, 13% GuHCl), элюированных из супраструктур, непрочносвязанных с клеточным остатком растущей популяции E.coli. На оси абсцисс показано время роста популяции E.coli с обозначением фаз роста, мин. На оси ординат - содержание белка на 1 клетку, фермитограмм.

На фиг.4 показано содержание белка в ступенчато-градиентных фракциях гуанидин гидрохлорида (6%, 8,9%, 10,6%, 13% GuHCl), элюированных из супраструктур, прочносвязанных с клеточным остатком растущей популяции E.coli. На оси абсцисс показано время роста популяции E.coli с обозначением фаз роста, мин. На оси ординат - содержание белка на 1 клетку, фермитограмм.

На фиг.5 показано содержание белка в ступенчато-градиентных фракциях гуанидин гидрохлорида (6%, 8,9%, 10,6%, 13% GuHCl), элюированных из клеточного остатка растущей популяции E.coli. На оси абсцисс показано время роста популяции E.coli с обозначением фаз роста, мин. На оси ординат - содержание белка на 1 клетку, фермитограмм.

Анализ фиг.2-5 показывает, что фракции положительно заряженных белков выделяются при следующих концентрациях гуанидин гидрохлорида: 8,9%, 10,6%, 13%, на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8; пик, полученный элюцией 6% гуанидингидрохлорида, - это незадержавшиеся (отрицательно заряженные и нейтральные) белки супрамолекулярных структур.

Эффективность последовательной ступенчатой экстракции положительно заряженных белков из бактериоплазмы, обладающих сайтами чувствительности к Арг-Х протеолизу, показана на фиг.6. На оси ординат показана активность, выраженная в нмоль аргинина на 1 мг белка/с. На оси абсцисс показано время роста популяции E.coli с обозначением фаз роста, мин.

На фиг.7 представлена эффективность последовательной ступенчатой экстракции положительно заряженных белков из супраструктур, непрочносвязанных с клеточным остатком, обладающих сайтами чувствительности к Арг-Х протеолизу. На оси ординат показана активность, выраженная в нмоль аргинина на 1 мг белка/с. На оси абсцисс показано время роста популяции E.coli с обозначением фаз роста, мин.

На фиг.8 представлена эффективность последовательной ступенчатой экстракции положительно заряженных белков из супраструктур, прочносвязанных с клеточным остатком, обладающих сайтами чувствительности к Арг-Х протеолизу. На оси ординат показана активность, выраженная в нмоль аргинина на 1 мг белка/с. На оси абсцисс показано время роста популяции E.coli с обозначением фаз роста, мин.

На фиг.9 представлена эффективность последовательной ступенчатой экстракции положительно заряженных белков из клеточного остатка, обладающих сайтами чувствительности к Арг-Х протеолизу. На оси ординат показана активность, выраженная в нмоль аргинина на 1 мг белка/с. На оси абсцисс показано время роста популяции E.coli с обозначением фаз роста, мин.

Анализ фиг.6-9 показывает, что в период роста периодической культуры активно происходят процессы Арг-Х протеолиза как в положительно заряженных белках, так и белках, имеющих отрицательные и нейтральные заряды. Известно, что аргинин в составе белков активно участвует в процессах структурирующих упаковку ДНК, особенно при модификации гуанидиновой группы. Сжатие или растяжение нуклеопротеидных супраструктур способно экранировать гидрофобные или гидрофильные поверхности белка для межмолекулярных взаимодействий и тем самым влиять на плотность упаковки ДНК и ее транскрипционную активность.

Метод [2] позволил получить фракции, обогащенные гистоном H1, гистонами Н2А и Н2В, гистонами НЗ и Н4. Мы полагаем, что заявленный подход позволит идентифицировать гистоноподобные белки в прокариотической клетки, определить их роль в метаболизме клетки, участие в укладке и структурировании нуклеоида в процессе роста бактериальной популяции и определение аминокислотного состава полученных белков. Знание биохимических процессов, происходящих на разных фазах роста популяции бактерий позволяет раскрыть пути регулирования механизмов воздействия макро- и микроорганизмов, а также способствует поиску новых мишеней для лекарственных средств, что дает возможность управления бактериальными сообществами, населяющими человеческий организм.

Источники информации

1. Иванова Э.А., Вафина Г.Х. Способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью. Авторское свидетельство 1733471 // БИ 1992. Т.18, С.96.

2. Иванова Э.А.. Вафина Г.Х. Способ препаративного выделения основных белков из супраструктур клеточных ядер растений. Патент №2408602 // Опубликовано: 10.01.2011. Бюл. №1.

3. Иванова Э.А., Вафина Г.Х., Тропынина Т.С. Способ получения фракции из клеток E.coli, обладающей протеолитической активностью. Патент №2410428 // Опубликовано: 27.01.2011. Бюл. №3.

4. Myrphy D.B., Pembroke J.T. Transfer of the IncJ plasmid R391 to recombination deficient E.coli K12; evidence that R391 behaves as a conjugal transposon // FEMS Microbiology Letters, 1995, V.134, P.153-158.

5. Luck J.M., Rasmussen P.S., Satake K., Tsvetikov A.N. Further studies on the fractionation of calf thymus histone //The J. of Biological Chemistry. 1958, V.233, N 6, P.1407-1414.

6. Bonner J., Chalkley G.R., Dahmus M., Fambrough D., Fujimura F., Huang R.C., Huberman J., Jensen R., Marushige K., Ohlenbusch H., Olivera В., Widholm J. Isolation and characterization of chromosomal nucleoproteins // Methods Enzymology. 1968, Acad. Press. New York. V. XII, part B, sec. V, ch. VII, P.25-31.

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии и касается способа анализа процесса Арг-Х протеолиза в положительно заряженных фракциях белков супрамолекулярных структур в растущей популяции Escherichia coli. Представленный способ включает следующие стадии: консервация клеток в присутствии забуференного 80-90% глицерина, снятие клеточных оболочек 3% тритоном Х-100, экстракция возрастающими концентрациями солей: 0,14 М, 0,35 М; 2 М NaCl, 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% β-меркаптоэтанолом, выделение из вышеперечисленных фракций положительно заряженных белков с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8 и определение в них сайтов чувствительности к Арг-Х протеолизу. Представленное изобретение может быть использовано при анализе молекулярно-генетических механизмов формирования структуры клетки прокариот и роли белковых компонентов в их организации, а также при изучении особенностей ремоделирования генома, что является необходимым для раскрытия путей регулирования механизмов воздействия макро- и микроорганизмов. 9 ил., 1 пр.

Способ анализа процесса Арг-Х протеолиза в положительно заряженных фракциях белков супрамолекулярных структур в растущей популяции Escherichia coli, включающий консервацию клеток в присутствии забуференного 80-90%-ного глицерина с последующим снятием клеточных оболочек 3% тритоном Х-100, экстракцию возрастающими концентрациями солей: 0,14 М, 0,35 М; 2 М NaCl, 6 М гуанидин гидрохлоридом с 0,1% β-меркантоэтанолом, выделением из вышеперечисленных фракций положительно заряженных белков с помощью ионообменной хроматографии с амберлитом ИРЦ-50 в прерывистом градиенте гуанидин гидрохлорида: 6%, 8,9%, 10,6%, 13% на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 6,8 и определением в них сайтов чувствительности к Арг-Х протеолизу.