ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА Streptomyces lucensis - ПРОДУЦЕНТ ИНГИБИТОРА ГЛИКОЗИДАЗ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12N9/24 C12N9/26 C12R1/465 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм актиномицета Streptomyces lucensis, предназначенный для использования в качестве продуцента в микробиологическом производстве ингибитора гликозидаз для пищевой и химико-фармацевтической промышленности, биотехнологии и биохимии.

Известен штамм актиномицета Actinoplanaceen S/E 50/13 - продуцент ингибитора амилазы (Патент США №3855066, 1975).

Недостатком этого штамма является то, что он продуцирует ингибитор, подавляющий активность только амилазы, требует особых условий хранения и культивирования.

Известен штамм актиномицета Streptomyces species ВКПМ Ac-1328 - продуцент ингибитора α-гликозидаз (А.с. СССР №1748444 А1, 27.05.1996).

Недостатками этого штамма являются: сложный состав питательной среды для его культивирования, недостаточно высокая продуктивность биосинтеза ингибитора гликозидаз и активность ингибитора в отношении панкреатической свиной α-амилазы и α-амилазы Bacillus subtilis. Этот штамм выбран в качестве прототипа.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание нового штамма актиномицета, синтезирующего ингибитор в отношении гликозидаз животного, растительного и микробного происхождения (α-амилаза, глюкоамилаза, сахараза, мальтаза, декстирназа).

Сущность изобретения

В основу изобретения положена задача селекции нового штамма актиномицета рода Streptomyces, синтезирующего на среде несложного состава ингибитор, активный в отношении гликозидаз различного происхождения.

Задача изобретения решена тем, что получен новый генетически устойчивый штамм актиномицета Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 - продуцент ингибитора гликозидаз.

Штамм актиномицета Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 получен в лаборатории ГУ ВНИИПАКК селекционным путем (ступенчатый отбор) из штамма Streptomyces lucensis Arcamone et al. 1957 BKM Ac-1737.

Отбор актиномицетов проводили по качеству колоний и уровню ингибиторной активности в нативном растворе, полученном в результате их культивирования на среде, содержащей крахмал, и последующего отделения биомассы. Генетической устойчивости отбираемых штаммов достигали путем их неоднократных пересевов на плотные питательные среды. Выросшие на них колонии пересевали на питательную среду Чапека с крахмалом (для актиномицетов). В результате получен новый генетически устойчивый штамм актиномицетов рода Streptomyces.

Идентификацию микроорганизма проводили в соответствии с определителем «Определитель бактерий Берджи»: пер. с англ. В 2 т. / Р.Беркли, Э.Бок, Д.Буп и др. // Под ред. Дж.Хоулта и др., 9-е изд. (США) - М.: Мир, 1997.

Штамм Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки.

Культурально-морфологические признаки. Двухсуточная культура штамма имеет обильно разветвленный субстратный мицелий, образуемый вегетативными гифами размером d=0,2-2,0 мкн в поперечнике, нити без перегородок, длинные, ветвление нечастое. Характерно формирование цепочек спор. Споры овальные. Спороносные ветви глубинного мицелия на углеводсодержащей среде прямые или волнистые.

В зависимости от состава среды проявляются различия в морфологических признаках штамма. Штамм ВКПМ Ас-1743 имеет разветвленный субстратный мицелий, образуемый вегетативными гифами размером d=0,2-1,0 мкн в поперечнике, нити с перегородками, длинные, ветвление частое. Характерно формирование цепочек спор на воздушном мицелии. Споры овальные. Спороносные ветви глубинного мицелия на углеводсодержащей среде прямые или волнистые. Рост колоний на среде Чапека с крахмалом - обильный; субстратный мицелий отсутствует; колонии матового серого цвета, круглые, холмистые, лишайникообразные, крупные, d=3-4 мм; края колоний - неровные, более светлого оттенка (белый); воздушный мицелий - слабо выраженный; пигментация и жироподобные вещества отсутствуют. На среде с крахмалом (среда Гаузе 1) рост сплошной, плотный, газообразный; субстратный мицелий матовый, слабо выраженный; колонии диаметром около 1 мм; единичные колонии (боковые на косяке) - бледные, слабовыраженные; пигмент и жироподобные вещества отсутствуют. На питательной среде с глюкозой (среда 1) рост очень обильный, сплошной; колонии круглые, морщинистые, с неровными краями, d=2-3 мм; воздушный мицелий скудный, не диффундирующий в среду; пигмент и жироподобные вещества отсутствуют. На глюкозной среде (среда Чапека) и глюкозо-аспарагиновой (среда Краинского) рост отсутствует. На кукурузной среде рост умеренный, тонким слоем; субстратный мицелий скудный; колонии точечные, выпуклые, мелкие, d=1 мм; воздушный мицелий отсутствует. На овсяном агаре рост сплошной, газонообразный, плотный, умеренный; колонии матовые, выпуклые, звездочкообразные, с игольчатыми краями, d=2 мм, или в виде столбиков; пигмент и жироподобные вещества отсутствуют.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 - аэроб, хемоорганотроф. Рост культуры при (28-37)°С в жидкой среде, содержащей продукты гидролиза крахмала (декстрины, мальтоза, глюкоза), хороший с выделением в среду желто-зеленого пигмента, при 26°С - менее интенсивный, при 45°С - отсутствует.

Молоко пептонизирует и разжижает желатину медленно, слабо. Нитраты восстанавливает до нитритов. Активно гидролизует крахмал. Рост на среде с глюкозой, или рафинозой, или сахарозой в качестве единственного источника углерода в присутствии кальция (карбонат) хороший; в его отсутствие - роста нет. На средах в присутствии D-мелецитозы, L-рамнозы рост хороший, в присутствии D-мелибиозы, декстрана - умеренный. На клетчатке и на среде в присутствии ксилитола рост слабый.

Газообразные продукты из крахмала, глюкозы не образует.

Проявляет антибиоз против Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Micrococcus enteus, Candida albicans, Streptococcus muinus. Устойчивость к пенициллину высокая. Рост микроорганизма в присутствии олеандомицина и неомицина частично подавляется. Штамм каталазоположительный.

Рост в присутствии хлорида натрия (7,0 мас.%), азида натрия (0,01 мас.%), фенола (0,1 об.%) соответственно неактивный, умеренный, активный.

Рост штамма на средах, содержащих L-валин, L-фенилаланин, умеренный. При использовании в среде L-цистеина, L-гистидина рост менее активный. На среде с аспарагином рост отсутствует. Липолиз умеренный. Гидролиз пектина слабый.

рН-оптимум штамма Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 соответствует 6,0-7,0.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма.

Штамм хранится на плотной среде Чапека в пробирках на скошенном слое. Плотную среду Чапека приготавливают из жидкой среды Чапека, содержащей растворимый крахмал в количестве 20 г на 1 дм³ жидкой среды, агар-агар в количестве 20 г на 1 дм³ жидкой среды, калий фосфорнокислый однозамещенный трехводный в количестве 1 г на 1 дм³ жидкой среды, натрий азотнокислый в количестве 3 г на 1 дм³ жидкой среды, калий хлористый в количестве 0,5 г на 1 дм³ жидкой среды, магний сернокислый семи водный в количестве 0,5 г на 1 дм³ жидкой среды, железо (II) сернокислое семиводное в количестве 0,015 г на 1 дм³ жидкой среды (рН среды после стерилизации 6,8-7,0). Стерильную жидкую среду Чапека разливают в пробирки по

5 см³, охлаждают в скошенном виде до полного застывания и подсушивают. Плотную среду засевают чистой культурой актиномицетов в боксе над пламенем горелки. Пробирки выдерживают в термостате при температуре 26-30°С в течение 7-8 сут, после чего направляют на хранение.

Температура хранения на плотной среде Чапека от плюс 4°С до плюс 6°С. Сроки пересевов - 1 раз в три месяца.

Спектр действия ингибитора. При глубинной ферментации культура Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 выделяет в нативный раствор ингибитор гликозидаз, а именно панкреатической свиной α-амилазы (препарат «Панкреатин»), α-амилазы Bacillus subtilis, α-амилазы ячменного солода, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger, сахаразы Saccharomyces cerevisiae, глюкоамилазы Aspergillus awamori при культивировании на среде, содержащей растворимый крахмал, или гидролизат крахмала (кукурузный, картофельный), или гидролизат рисовой муки. При использовании предлагаемого штамма по сравнению со штаммом Streptomyces species ВКПМ Ac-1328 ингибиторные активности в отношении панкреатической свиной α-амилазы и α-амилазы Bacillus subtilis выше в среднем соответственно в 2,0 и 2,5 раза, и ингибитор, синтезируемый предлагаемым штаммом, активен в отношении α-амилазы солода.

Контроль образования ингибитора проводили спектрофотометрическим методом по наличию ингибиторной активности, которую определяли в отношении панкреатической свиной α-амилазы, α-амилазы Bacillus subtilis, α-амилазы ячменного солода, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus awamori согласно автореферату диссертации на соискание уч. ст. к.б.н. по специальности 03.00.04. - биохимия «Ингибиторы α-глюкозидаз из Streptomyces. Выделение и свойства» / Акулова Н.Ю. - Санкт-Петербург, 1993, с.5-6.

ПРИМЕР 1

В колбу вместимостью 750 см³ вносили 2 г растворимого крахмала, 0,5 г соевой муки, 0,3 г натрия хлористого, 0,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,05 г магния сернокислого семиводного и воду дистиллированную до 100 см³. Среду в колбе стерилизовали при температуре 120-130°С и давлении 0,8 ати, охлаждали до температуры 30°С в течение 40 мин и вносили в колбу 10 см³ двухсуточной культуры актиномицета. Колбу термостатировали при температуре 30°С в течение 96 ч при перемешивании 180 об./мин.

Ингибиторная активность составила: в отношении панкреатической свиной α-амилазы 3000 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis - 220 ИЕ/см³, α-амилазы солода - 60 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger - 1000 ИЕ/см³, глюкоамилазы Aspergillus awamori - 1000 ИЕ/см³.

ПРИМЕР 2

В колбу вместимостью 750 см³ вносили 2 г гидролизата кукурузного крахмала, 0,5 г соевой муки, 0,3 г натрия хлористого, 0,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,05 г магния сернокислого семиводного и воду дистиллированную до 100 см³. Среду в колбе стерилизовали при температуре 120-130°С и давлении 0,8 ати, охлаждали до температуры 30°С в течение 40 мин и вносили в колбу 10 см³ двухсуточной культуры актиномицета. Колбу термостатировали при температуре 30°С в течение 96 ч при перемешивании 180 об./мин.

Ингибиторная активность составила: в отношении панкреатической свиной α-амилазы 3700 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis - 400 ИЕ/см³, α-амилазы солода - 70 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger - 1200 ИЕ/см³, глюкоамилазы Aspergillus awamori - 1500 ИЕ/см³.

ПРИМЕР 3

В колбу вместимостью 750 см³ вносили 1,5 г гидролизата картофельного крахмала, 0,25 г соевой муки, 0,3 г натрия хлористого, 0,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,05 г магния сернокислого семиводного и воду дистиллированную до 100 см³. Среду в колбе стерилизовали при температуре 120-130°С и давлении 0,8 ати, охлаждали до температуры 28°С в течение 40 мин и вносили в колбу 8 см³ двухсуточной культуры актиномицета. Колбу термостатировали при температуре 28°С в течение 96 ч при перемешивании 180 об./мин.

Ингибиторная активность составила: в отношении панкреатической свиной α-амилазы 2350 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis - 260 ИЕ/см, α-амилазы солода - 70 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger - 1300 ИЕ/см³, глюкоамилазы Aspergillus awamori - 1400 ИЕ/см³.

ПРИМЕР 4

В колбу вместимостью 750 см³ вносили 1,5 г гидролизата рисовой муки, 0,5 г соевой муки, 0,3 г натрия хлористого, 0,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,05 г магния сернокислого семиводного и воду дистиллированную до 100 см³ Среду в колбе стерилизовали при температуре 120-130°С и давлении 0,8 ати, охлаждали до температуры 28°С в течение 40 мин и вносили в колбу 8 см³ двухсуточной культуры актиномицета. Колбу термостатировали при температуре 28°С в течение 96 ч при перемешивании 180 об./мин.

Ингибиторная активность составила: в отношении панкреатической свиной α-амилазы 2000 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis - 300 ИЕ/см³, α-амилазы солода - 40 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа AspergiMus niger - 1200 ИЕ/см³, глюкоамилазы Aspergillus awamori - 1200 ИЕ/см³.

Как следует из примеров, полученный штамм актиномицетов Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 - продуцент ингибитора гликозидаз - обеспечивает на среде несложного состава высокие ингибиторные активности в отношении гликозидаз различного происхождения. Общая ингибиторная активность в отношении панкреатической свиной α-амилазы составляет 2000-3700 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis -220-400 ИЕ/см³, α-амилазы солода - 40-70 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger - 1000-1300 ИЕ/см³, глюкоамилазы Aspergillus awamori - 1000-1500 ИЕ/см³.

Штамм актиномицета Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 выделен из штамма Streptomyces lucensis Arcamone et al. 1957 BKM Ac-1737 путем проведения ступенчатого отбора. Штамм характеризуется высокими ингибиторными активностями в отношении гликозидаз различного происхождения. Общая ингибиторная активность в отношении панкреатической свиной α-амилазы составляет 2000-3700 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis - 220-400 ИЕ/см³, α-амилазы солода - 40-70 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger - 1000-1300 ИЕ/см³, глюкоамилазы Aspergillus awamori - 1000-1500 ИЕ/см³.

Штамм актиномицета Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1743 - продуцент ингибитора гликозидаз.