ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА STREPTOMYCES VIOLACEUS - ПРОДУЦЕНТ ИНГИБИТОРА ГЛИКОЗИДАЗ Российский патент 2009 года по МПК C12N9/24 C12N9/26 C12N1/20 C12R1/465 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм актиномицета Streptomyces violaceus, предназначенный для использования в качестве продуцента в микробиологическом производстве ингибитора гликозидаз для пищевой и химико-фармацевтической промышленности, биотехнологии и биохимии.

Известен штамм актиномицета Actinoplanaceen S/E 50/13 - продуцент ингибитора амилазы (Патент США №3855066, 1975).

Недостатком этого штамма является то, что он продуцирует ингибитор, подавляющий активность только амилазы, требует особых условий хранения и культивирования.

Известен штамм актиномицета Streptomyces species ВКПМ Ас-1328 - продуцент ингибитора α-гликозидаз (А.с. СССР №1748444 А1, 27.05.1996).

Недостатками этого штамма являются: сложный состав питательной среды для его культивирования, недостаточно высокая продуктивность биосинтеза ингибитора гликозидаз и активность ингибитора в отношении панкреатической свиной α-амилазы и α-амилазы Bacillus subtilis. Этот штамм выбран в качестве прототипа.

Техническими результатами заявленного изобретения являются: создание нового штамма актиномицета, синтезирующего ингибитор в отношении гликозидаз животного, растительного и микробного происхождения (α-амилаза, глюкоамилаза, сахараза, мальтаза, декстирназа).

Сущность изобретения

В основу изобретения положена задача селекции нового штамма актиномицета рода Streptomyces, синтезирующего на среде несложного состава ингибитор, активный в отношении гликозидаз различного происхождения.

Задача изобретения решена тем, что получен новый генетически устойчивый штамм актиномицета Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 - продуцент ингибитора гликозидаз.

Штамм Ас-1734 получен в лаборатории ГУ ВНИИПАКК селекционным путем (ступенчатый отбор) из штамма Streptomyces violaceus ВКМ АС 379.

Отбор актиномицетов проводили по качеству колоний и уровню ингибиторной активности в нативном растворе, полученном в результате их культивирования на среде, содержащей крахмал, и последующего отделения биомассы. Генетической устойчивости отбираемых штаммов достигали путем их неоднократных пересевов на плотные питательные среды. Выросшие на них колонии пересевали на питательную среду Чапека с крахмалом (для актиномицетов). В результате получен новый генетически устойчивый штамм актиномицетов рода Streptomyces.

Идентификацию микроорганизма проводили в соответствии с определителем «Определитель бактерий Берджи»: пер. с англ. В 2 т./ Р.Беркли, Э.Бок, Д.Буп, и др.// под ред. Дж.Хоулта и др., 9-е изд. (США) - М.: Мир, 1997.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика. Коллекционный номер ВКПМ Ас-1734.

Штамм Streptomyces violaceus Ac-1734 имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки.

Культурально-морфологические признаки.

Двухсуточная культура штамма имеет обильно разветвленный субстратный мицелий, образуемый вегетативными гифами размером d=0,2-2,0 мкм в поперечнике, нити без перегородок, длинные, ветвление нечастое. Характерно формирование цепочек спор. Споры овальные. Спороносные ветви глубинного мицелия на углеводсодержащей среде прямые или волнистые.

В зависимости от состава среды проявляются различия в морфологических признаках штамма. Рост колоний на средах с крахмалом - обильный, колонии холмистые с неровными краями. На средах Чапека с крахмалом и крахмалоаммиачном агаре образуется воздушный мицелий в виде сероватого налета, растворимый пигмент - фиолетовый. Колонии на поверхности твердой питательной среды с крахмалом лишайникоподобные, имеют слабо-фиолетовое окрашивание, с возрастом цвет колоний культуры переходит в красноватый или розоватый, частично в устойчивый фиолетовый. На границе мицелия со средой - крахмалоаммиачным агаром образуется пигмент, окрашенный в ярко-пурпурный цвет, среда окрашивается слабо. На минеральной среде Гаузе 1 с крахмалом пигмент отсутствует, среда не окрашена. На питательных средах с глюкозой или сахарозой цвет колоний сначала светло-розовый, далее красный, потом становится красно-синим, фиолетовым и пурпурно-фиолетовым. Образует диффундирующий в среду пигмент, окрашенный в красновато-фиолетовый цвет в зависимости от условий культивирования. На среде Чапека с глюкозой рост умеренный, образуется налет сероватого цвета, субстратный мицелий темно-фиолетового цвета, не диффундирует в среду. На среде 1 с глюкозой рост обильный, сплошной, субстратный мицелий белый, среду окрашивает в цвет от бордового до темно-фиолетового. Воздушный мицелий отсутствует. На глюкозо-аспарагиновой среде (среда Краинского) рост в виде мелкого газона, субстратный мицелий - малиновый, воздушный - белый, развит слабо. На кукурузной среде и овсяном агаре рост хороший, воздушный мицелий сероватого цвета, образует фиолетовый диффундирующий мицелий. На овсяном агаре рост сплошной, образуются блестящие капли жироподобных веществ, на кукурузной среде - в основном обособленные морщинистые колонии с игольчатыми краями, d=8 мм, капли жироподобных веществ отсутствуют. На сусло-агаре рост отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки

Streptomyces violaceus Ac-1734 - аэроб, хемоорганотроф. Рост культуры при (28-37)°С в жидкой среде, содержащей продукты гидролиза крахмала (декстрины, мальтоза, глюкоза), хороший, при 26°С - менее интенсивный, при 45°С -отсутствует.

Молоко пептонизириует и разжижает желатину медленно. Нитраты восстанавливает до нитритов. Гидролизует крахмал, быстро инвертирует сахарозу. Рост на среде с глюкозой или рафинозой в качестве единственного источника углерода хороший. На средах в присутствии D-мелецитозы, L-рамнозы рост хороший, в присутствии D-мелибиозы, декстрана - умеренный. На клетчатке и на среде в присутствии ксилитола рост слабый. Культура образует меланоидный пигмент.

Газообразные продукты из крахмала глюкозы не образуют.

Проявляет антибиоз против Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Micrococcus enteus, Candida albicans, Streptococcus muinus. Устойчивость к пенициллину высокая. Рост микроорганизма в присутствии олеандомицина и неомицина частично подавляется. Штамм каталазоположительный.

Рост в присутствии хлорида натрия (7,0 мас.%), азида натрия (0,01 мас.%), фенола (0,1 об.%) соответственно неактивный, умеренный, активный.

Рост штамма на средах, содержащих L-валин, L-фенилаланин, хороший. При использовании в среде L-цистеина, L-гистидина рост менее активный. Липолиз умеренный. Гидролиз пектина слабый.

рН-оптимум штамма Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1743 соответствует 5,0-7,0.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма

Штамм хранится на плотной среде Чапека в пробирках на скошенном слое. Плотную среду Чапека приготавливают из жидкой среды Чапека, содержащей растворимый крахмал в количестве 20 г на 1 дм³ жидкой среды, агар-агар в количестве 20 г на 1 дм³ жидкой среды, калий фосфорнокислый однозамещенный трехводный в количестве 1 г на 1 дм³ жидкой среды, натрий азотнокислый в количестве 3 г на 1 дм³ жидкой среды, калий хлористый в количестве 0,5 г на 1 дм³ жидкой среды, магний сернокислый семиводный в количестве 0,5 г на 1 дм³ жидкой среды, железо (II) сернокислое семиводное в количестве 0,015 г на 1 дм³ жидкой среды, (рН среды после стерилизации 6,8-7,0). Стерильную жидкую среду Чапека разливают в пробирки по 5 см³, охлаждают в скошенном виде до полного застывания и подсушивают. Плотную среду засевают чистой культурой актиномицетов в боксе над пламенем горелки. Пробирки выдерживают в термостате при температуре 26-30°С в течение 7-8 сут, после чего направляют на хранение.

Температура хранения на плотной среде Чапека от плюс 4°С до плюс 6°С. Сроки пересевов - 1 раз в три месяца.

Спектр действия ингибитора

При глубинной ферментации культура Streptomyces violaceus Ac-1734 выделяет в нативный раствор ингибитор гликозидаз, а именно панкреатической свиной α-амилазы (препарат «Панкреатин»), α-амилазы Bacillus subtilis, α-амилазы ячменного солода, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназы Aspergillus niger, сахаразы Saccharomyces cerevisiae при культивировании на среде, содержащей растворимый крахмал или гидролизат крахмала (кукурузный, картофельный). При использовании предлагаемого штамма по сравнению со штаммом Streptomyces species ВКПМ Ас-1328 ингибиторные активности в отношении панкреатической свиной α-амилазы и α-амилазы Bacillus subtilis выше в среднем соответственно в 1,6 и 2,2 раза, и ингибитор, синтезируемый предлагаемым штаммом, активен в отношении α-амилазы ячменного солода.

Контроль образования ингибитора проводили спектрофотометрическим методом по наличию ингибиторной активности, которую определяли в отношении панкреатической свиной α-амилазы, α-амилазы Bacillus subtilis, α-амилазы ячменного солода, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus awamori согласно автореферату диссертации на соискание уч. ст.к.б.н. по специальности 03.00.04. - биохимия «Ингибиторы α-глюкозидаз из Streptomyces. Выделение и свойства»/ Акулова Н.Ю. - Санкт-Петербург, 1993, с.5-6.

ПРИМЕР 1

В колбу вместимостью 750 см³ вносили 2 г растворимого крахмала, 0,5 г соевой муки, 0,3 г натрия хлористого, 0,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,05 г магния сернокислого семиводного и воду дистиллированную до 100 см³. Среду в колбе стерилизовали при температуре 120-130°С и давлении 0,8 ати, охлаждали до температуры 30°С в течение 40 мин и вносили в колбу 10 см³ двухсуточной культуры актиномицета. Колбу термостатировали при температуре 30°С в течение 96 ч при перемешивании 180 об./мин.

Ингибиторная активность составила: в отношении панкреатической свиной α-амилазы 2500 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis - 130 ИЕ/см³, α-амилазы солода - 50 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger - 1000 ИЕ/см³.

ПРИМЕР 2

В колбу вместимостью 750 см³ вносили 2 г гидролизата кукурузного крахмала, 0,5 г соевой муки, 0,3 г натрия хлористого, 0,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,05 г магния сернокислого семиводного и воду дистиллированную до 100 см³. Среду в колбе стерилизовали при температуре 120-130°С и давлении 0,8 ати, охлаждали до температуры 30°С в течение 40 мин и вносили в колбу 10 см³ двухсуточной культуры актиномицета. Колбу термостатировали при температуре 30°С в течение 96 ч при перемешивании 180 об./мин. Ингибиторная активность составила: в отношении панкреатической свиной α-амилазы 2400 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis - 160 ИЕ/см³, α-амилазы солода - 60 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger - 1200 ИЕ/см³.

ПРИМЕР З

В колбу вместимостью 750 см³ вносили 1,5 г гидролизата картофельного крахмала, 0,25 г соевой муки, 0,3 г натрия хлористого, 0,1 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,05 г магния сернокислого семиводного и воду дистиллированную до 100 см³. Среду в колбе стерилизовали при температуре 120-130°С и давлении 0,8 ати, охлаждали до температуры 28°С в течение 40 мин и вносили в колбу 8 см³ двухсуточной культуры актиномицета. Колбу термостатировали при температуре 28°С в течение 96 ч при перемешивании 180 об./мин.

Ингибиторная активность составила: в отношении панкреатической свиной α-амилазы 2250 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis - 200 ИЕ/см³, α-амилазы солода - 70 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger - 1400 ИЕ/см³.

Как следует из примеров, полученный штамм актиномицетов Streptomyces violaceus Ac-1734 - продуцент ингибитора гликозидаз -обеспечивает на среде несложного состава высокие ингибиторные активности в отношении гликозидаз различного происхождения. Общая ингибиторная активность в отношении панкреатической свиной α-амилазы составляет 2250-2500 ИЕ/см³, α-амилазы Bacillus subtilis - 130-200 ИЕ/см³, α-амилазы солода - 50-70 ИЕ/см³, комплекса ферментов - α-амилаза, глюкоамилаза, мальтаза, декстриназа Aspergillus niger - 1000-1400 ИЕ/см³.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм актиномицета Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 - продуцент ингибитора гликозидаз может быть использован в качестве продуцента ингибитора гликозидаз в микробиологическом производстве ингибитора гликозидаз для пищевой, химико-фармацевтической промышленности, биотехнологии и биохимии. Изобретение позволяет повысить выход ингибитора гликозидаз.

Штамм актиномицета Streptomyces violaceus ВКПМ Ac-1734 - продуцент ингибитора гликозидаз.