ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ИНСУЛИНА, ОБЛАДАЮЩИЕ БЫСТРЫМ УСВОЕНИЕМ Российский патент 2014 года по МПК A61K9/08 A61K38/28 A61K47/12 A61K47/18 A61P5/50 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к области инъекционных лекарственных форм инсулина с быстродействующей доставкой лекарственного средства.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Общее представление о сахарном диабете

Глюкоза является моносахаридом, используемым всеми клетками организма для образования энергии и поддержания жизнедеятельности. Чтобы выжить, человеческий организм постоянно нуждается в минимальном уровне глюкозы в его крови. Основным способом образования глюкозы крови в организме является переваривание пищи. Когда человек не получает эту глюкозу при переваривании пищи, глюкоза образуется из тканевых запасов и высвобождается печенью. Уровни глюкозы в организме регулируются инсулином. Инсулин представляет собой пептидный гормон, который естественным путем секретируется поджелудочной железой. Инсулин помогает глюкозе проникать внутрь клеток организма для обеспечения жизненно важного источника энергии.

Когда здоровый человек начинает есть, поджелудочная железа обеспечивает естественный пиковый выброс инсулина, называемый первой фазой секреции инсулина. Помимо обеспечения достаточного количества инсулина для метаболизма глюкозы, появляющейся в крови при переваривании пищи, первая фаза секреции инсулина действует в качестве сигнала остановки синтеза глюкозы в печени по мере того, как происходит переваривание пищи. Поскольку печень не синтезирует глюкозу и имеется достаточное количество дополнительного инсулина для метаболизма глюкозы, образуемой при переваривании пищи, уровни глюкозы в крови здоровых индивидуумов остаются относительно постоянными, и их уровни глюкозы в крови не становятся слишком высокими.

Сахарный диабет является заболеванием, характеризуемым аномально высокими уровнями глюкозы в крови и неадекватными уровнями инсулина. Существует два основных типа сахарного диабета - Тип 1 и Тип 2. В случае сахарного диабета Типа 1 в организме не синтезируется инсулин. На ранних стадиях сахарного диабета Типа 2, хотя в поджелудочной железе синтезируется инсулин, либо в организме не синтезируется инсулин вовремя, либо клетки организма не распознают инсулин - состояние, известное под названием инсулинорезистентность.

Еще до появления любых других симптомов одним из первых проявлений сахарного диабета Типа 2 является исчезновение секреции инсулина первой фазы, индуцированной перевариванием пищи. В отсутствие секреции инсулина первой фазы в печень не поступает сигнал к прекращению синтеза глюкозы. В результате, печень продолжает продуцировать глюкозу в момент времени, когда организм начинает продуцировать дополнительную глюкозу посредством переваривания пищи. В результате, уровень глюкозы в крови пациентов с сахарным диабетом достигает слишком высоких значений после потребления пищи - состояние, известное как гипергликемия. Гипергликемия вызывает противоестественное связывание глюкозы с определенными белками в крови, препятствуя способности белков выполнять их нормальные функции сохранения целостности небольших кровеносных сосудов. В условиях возникновении гипергликемии после каждого потребления пищи малые кровеносные сосуды в конечном итоге разрушаются, и повышается их проницаемость. Отдаленные побочные эффекты гипергликемии включают слепоту, потерю функции почек, повреждение и потерю чувствительности нервов и плохую периферическую циркуляцию крови, потенциально требующую ампутацию конечностей.

В промежутке между двумя и тремя часами после потребления пищи уровень необработанной глюкозы крови при сахарном диабете становится настолько повышенным, что в поджелудочную железу поступает сигнал к секреции чрезмерно огромного количества инсулина. У пациента на ранних стадиях сахарного диабета Типа 2 поджелудочная железа все еще может отвечать на сигнал и секретировать большие количества инсулина. Однако это происходит в то время, когда переваривание пищи подходит к концу и уровни глюкозы в крови должны начать падать. Это чрезмерно большое количество инсулина влечет за собой два отрицательных эффекта. Во-первых, это предъявляет чрезмерные требования к поджелудочной железе с уже нарушенной функцией, что может привести к ее более быстрому истощению и, в конечном итоге, приводит к состоянию, когда поджелудочная железа неспособна продуцировать инсулин. Во-вторых, слишком много инсулина после переваривания пищи приводит к увеличению массы тела, что может дополнительно отягощать заболевание.

Современные методы лечения сахарного диабета и их ограничения

Поскольку у пациентов, страдающих сахарным диабетом Типа 1, не вырабатывается никакого инсулина, первичное лечение сахарного диабета Типа 1 заключается в ежедневной интенсивной терапии инсулином. Лечение сахарного диабета Типа 2, как правило, начинается с коррекции диеты и физических упражнений. Несмотря на целесообразность в течение короткого промежутка времени, лечение только лишь посредством соблюдения диеты и физических упражнений не является эффективным долгосрочным разрешением болезни для подавляющего большинства пациентов, страдающих сахарным диабетом Типа 2. Когда диета и физические упражнения больше не достаточны, лечение начинают с различных неинсулиновых пероральных лекарственных препаратов. Эти пероральные лекарственные препараты действуют путем увеличения количества инсулина, синтезируемого в поджелудочной железе, путем повышения чувствительности инсулин-чувствительных клеток, путем снижения продукции глюкозы в печени или путем какой-либо комбинации этих механизмов. Эти методы лечения ограничены в своей способности эффективно контролировать заболевание и, как правило, имеют выраженные побочные эффекты, такие как увеличение массы тела и гипертензия. Ввиду ограничений неинсулиновых методов лечения у многих пациентов, страдающих сахарным диабетом Типа 2, ухудшается самочувствие с течением времени, и, в конечном итоге, им требуется инсулиновая терапия для поддержания их метаболизма.

Инсулиновая терапия используется более 80 лет для лечения сахарного диабета. Эта терапия, как правило, заключается в назначении нескольких инъекций инсулина ежедневно. Эти инъекции состоят из применения базальной инъекции пролонгированного действия один или два раза в день и инъекции быстродействующего инсулина во время приема пищи. Хотя эта схема лечения считается эффективной, она имеет ограничения. Во-первых, пациенты, как правило, не любят сами себе вводить инъекции инсулина ввиду неудобства и боли от игл. В результате, пациенты склонны не следовать надлежащим образом назначенным схемам лечения и зачастую не должным образом проходят лечение.

Более того, инъекции инсулина не воспроизводят естественный профиль действия инсулина даже при правильном применении. В частности, естественный всплеск инсулиновой секреции первой фазы у человека, не страдающего сахарным диабетом, приводит к уровням инсулина в крови, нарастающим в пределах нескольких минут после появления в крови глюкозы из потребляемой пищи. Напротив, инъецируемый инсулин появляется в крови медленно с пиковыми уровнями инсулина, возникающими в пределах от 80 до 100 минут вслед за инъекцией простого инсулина человека.

Потенциальным решением является инъекция инсулина напрямую в вену больным сахарным диабетом непосредственно перед приемом пищи. В исследованиях внутривенных инъекций инсулина пациенты отмечали лучший контроль их глюкозы в крови в диапазоне от 3 до 6 часов после приема пищи. Однако по целому ряду медицинских причин внутривенная инъекция инсулина перед каждым приемом пищи не является практической терапией.

Одним из ключевых усовершенствований в методах лечения инсулином было введение в 1990х быстродействующих аналогов инсулина, таких как лизпро-инсулин (IL), инсулин аспарт (IA) и инсулин глулизин (IG). Однако, даже применяя быстродействующие аналоги инсулина, пиковые уровни инсулина, как правило, появлялись в диапазоне от 50 до 90 минут после инъекции. Поскольку быстродействующие аналоги инсулина не адекватно имитируют секрецию инсулина первой фазы, у больных сахарным диабетом при использовании инсулиновой терапии продолжают сохраняться неадекватные уровни инсулина, имеющиеся в начале приема пищи, и слишком много инсулина, имеющегося между приемами пищи. Эта задержка в доставке инсулина может приводить к гипергликемии в ближайшее время после начала приема пищи. Более того, избыточный инсулин между приемами пищи может приводить к аномально низкому уровню глюкозы в крови, известному как гипогликемия. Гипогликемия может приводить к потере ясности ума, спутанности сознания, повышенной частоте сердечных сокращений, чувству голода, потливости и обмороку. При очень низких уровнях глюкозы гипогликемия может привести к потере сознания, коме и даже смерти. Согласно Американской Ассоциации Диабетологов, или ADA, использующие инсулин больные сахарным диабетом имеют в среднем 1,2 серьезных гипогликемических события в год, многие из которых требуют размещения пациентов в отделение больницы скорой медицинской помощи.

Поскольку динамика доставки инсулина в кровь играет такую важную роль в общем контроле уровня глюкозы, есть существенная потребность использовать инсулин в виде инъецируемого инсулина, который достигает кровяного русла быстрее быстродействующих аналогов инсулина.

В связи с этим, объектом изобретения является предоставление композиций быстродействующего инъецируемого инсулина с оптимизированной стабильностью и быстрым началом действия.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Инъецируемые лекарственные формы инсулина с оптимизированной стабильностью и быстрым началом действия описаны в настоящем документе. Лекарственные формы могут быть для подкожного, внутрикожного или внутримышечного применения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения лекарственные формы применяют посредством подкожной инъекции. Лекарственные формы содержат инсулин в комбинации с хелатором и растворяющим агентом, и, в некоторых случаях, с дополнительными вспомогательными веществами. В предпочтительном варианте осуществления изобретения лекарственная форма содержит инсулин человека, хелатор цинка, такой как EDTA, и растворяющий агент, такой как лимонная кислота или ее соль, такая как лимоннокислый натрий. Эти лекарственные формы быстро абсорбируются в кровоток в случае применения подкожной инъекции. Примеры демонстрируют, что можно увеличить рН до физиологических значений рН и по-прежнему обеспечить растворение и быстрое накопление инсулина.

В одном варианте осуществления изобретения инсулин представлен в виде сухого порошка в стерильной ампуле. Он быстро смешивается с растворителем, содержащим фармацевтически приемлемый носитель, такой как вода, и, в некоторых случаях, хелатор цинка, такой как EDTA, и/или растворяющий агент, такой как лимонная кислота, перед применением или в момент применения. В другом варианте осуществления изобретения инсулин, как правило, со значением рН, равным приблизительно 4, хранится в виде замороженной смеси, готовой к использованию после размораживания. В предпочтительном варианте осуществления изобретения инсулин представлен в виде водного раствора со значением рН, равным 7, который хранится при 4°С.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фигуре 1 представлено трехмерное схематическое изображение инсулина, демонстрирующее экспонированные поверхностные заряды, покрытые молекулами («растворяющими и хелатирующими агентами») соответствующего размера для маскировки заряда.

На Фигуре 2 представлено схематическое представление прибора системы Трансвелл 10, используемого для измерения абсорбции инсулина из донорной камеры 12 сквозь 4-5 слоев иммортализованных эпителиальных клеток ротовой полости 14 на 0,1 микронном фильтре 16 в приемную камеру 18.

На Фигурах 3а и 3b представлены графики, сравнивающие транспорт инсулина in vitro (суммарный инсулин в микроединицах) через эпителиальные клетки ротовой полости в системе Трансвелл Фигуры 2 в присутствии и в отсутствие 0,45 мг EDTA/мл в зависимости от кислоты, выбранной в качестве растворяющего агента. EDTA использовали в постоянной концентрации, равной 0,45 мг/мл, в то время как концентрации кислот варьировали следующим образом: Фигура 3а, аспарагиновая кислота (0,47 мг/мл), глутаминовая кислота (0,74 мг/мл), янтарная кислота (0,41 мг/мл), адипиновая кислота (0,73 мг/мл) и лимонная кислота (0,29 мг/мл и 0,56 мг/мл), диапазон значений рН 3,2-3,8. Фигура 3b, малеиновая (0,32 мг/мл), фумаровая кислота (1,28 мг/мл) и щавелевая кислота (0,32 мг/мл), диапазон значений рН 2-3. Два временных периода (10 и 30 мин) были выбраны для сравнительного анализа. Результаты представлены в виде среднего плюс или минус измеренная стандартная ошибка, n=4.

На Фигурах 4а и 4b представлены графики транспорта инсулина in vitro (суммарный инсулин в микроединицах) через эпителиальные клетки ротовой полости в системе Трансвелл, показанной на Фигуре 2, сравнивая различные растворяющие агенты в присутствии и в отсутствие 0,56 мг EDTA/мл и кислоты в следующих эквимолярных (1,50×10^-3 моль) концентрациях: аспарагиновая кислота (0,20 мг/мл), глутаминовая кислота (0,22 мг/мл) и лимонная кислота (0,29 мг/мл) (Фигура 4а) и лимонная кислота в концентрации 1,80 мг/мл (Фигура 4b). Два временных периода (10 и 30 мин.) были выбраны для сравнительного анализа.

На Фигуре 5 представлен график транспорта инсулина in vitro через эпителиальные клетки ротовой полости, используя систему Трансвелл Фигуры 2, для сравнения эффективности различных хелаторов. На Фигуре 5 представлен график транспорта инсулина (1 мг/мл) из раствора, содержащего глутаминовую кислоту, лимонную кислоту или HCl, к которому были добавлены различные хелаторы в одной и той же концентрации (4,84×10^-3 моль), через эпителиальные клетки ротовой полости (суммарный инсулин, микромоль). Хелаторы отсутствовали (контроль) представляли собой EDTA, EGTA, DMSA, CDTA и TSC.

На Фигуре 6 представлен график фармакодинамического действия инсулина in vivo, обработанного лимонной кислотой и EDTA (12 ед.), в человеческом организме в сравнении с IL (12 ед.) и RHI (12 ед.), измеренного как средняя скорость инфузии глюкозы (GIR)/кг.

На Фигуре 7 представлен график фармакокинетического действия инсулина in vivo, обработанного лимонной кислотой и EDTA, в человеческом организме в сравнении с RHI, концентрация инсулина (микроединицы/мл) в динамике по времени (минуты). Средние значения (±SEM, n=10). Доза инсулина составляла 12 ед/субъект.

На Фигуре 8 представлен график фармакодинамики инсулина in vivo, обработанного лимонной кислотой и EDTA у 16 пациентов, страдающих сахарным диабетом Типа 2; в сравнении с RHI и IL, представляя графически глюкозу в крови (мг/дл) в динамике по времени (минуты). Используемая доза при исследовании пациента была специфичной для пациента, подобранной для каждого пациента на основании проводимой инсулиновой терапии.

На Фигуре 9А представлен график коэффициентов седиментации RHI в концентрациях 0,17, 0,51, 1,68 и 3,62 мг/мл.

На Фигуре 9В представлен график коэффициентов седиментации IL в концентрациях 0,15, 0,56, 1,75 и 3,59 мг/мл.

На Фигуре 9С представлен график коэффициентов седиментации IA в концентрациях 0,16, 0,56, 1,66 и 3,56 мг/мл.

На Фигуре 9D представлен график коэффициентов седиментации СЕ100-4 в концентрациях 0,15, 0,55, 1,72 и 3,48 мг/мл.

На Фигуре 10А представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации для коэффициентов седиментации RHI в концентрациях 0,18, 0,55 и 1,72 мг/мл.

На Фигуре 10В представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации для коэффициентов седиментации IL в концентрациях 0,17, 0,57 и 1,82 мг/мл.

На Фигуре 10С представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации для коэффициентов седиментации IA в концентрациях 0,19, 0,54 и 1,84 мг/мл.

На Фигуре 10D представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации для коэффициентов седиментации CE100-4 в концентрациях 0,18, 0,40 и 0,84 мг/мл.

На Фигуре 11 представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации для коэффициентов седиментации контрольного инсулина со значением рН 7 в концентрациях 0,18, 0,57, 1,74 и 3,52 мг/мл.

На Фигуре 12 представлен график среднего размера частиц инсулина (нм) в зависимости от разведения для СЕ 100-4, СЕ 100-7 и CES 100-7.

На Фигуре 13 представлен график концентрации инсулина (микроединицы/мл) методом ELISA в динамике по времени (минуты) у карликовых свиней, больных сахарным диабетом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Лекарственные формы инсулина инъекционного человеческого инсулина, описанного в настоящем документе, применяются непосредственно до приема пищи или в конце приема пищи. В предпочтительном варианте осуществления изобретения лекарственная форма объединяет в себе рекомбинантный человеческий инсулин и специфические ингредиенты, как правило, считающиеся безопасными Управлением по контролю за лекарственными препаратами и пищевыми продуктами (FDA). Лекарственную форму создают таким образом, чтобы абсорбция в кровь проходила быстрее, чем у имеющихся в настоящий момент в продаже быстродействующих аналогов инсулина. Одним из ключевых свойств лекарственной формы инсулина является обеспечение разъединения, или разделения, состоящей из шести молекул, или гексамерной, формы инсулина до мономерной или димерной формы инсулина и удерживание его от реассоциации с образованием гексамерной формы. Считается, что предпочитая находиться в мономерной или димерной форме, эта лекарственная форма обеспечивает более быструю доставку инсулина в кровь, поскольку человеческому организму требуется инсулин в форме одной молекулы до того, как он сможет быть абсорбирован в организме для осуществления целевого биологического действия. Наибольшая часть человеческого инсулина, продаваемого для инъекции, представляет собой гексамерную форму. Это создает большие трудности для абсорбции в организме, поскольку гексамер инсулина должен сначала разделиться с образованием димеров и затем мономеров.

I. Определения

«Инсулин» в том смысле, в котором он здесь используется, относится к человеческому или не относящемуся к человеку рекомбинантному, очищенному или синтетическому инсулину или аналогам инсулина, если не указано иное.

«Человеческий инсулин» в том смысле, в котором он здесь используется, представляет собой человеческий пептидный гормон, секретируемый поджелудочной железой, либо выделенный из природного источника, либо образованный генетически измененными микроорганизмами. «Не относящийся к человеку инсулин» в том смысле, в котором он здесь используется, является тем же самым, что и человеческий инсулин, но животного происхождения как, например, свиного или коровьего.

Аналог инсулина в том смысле, в котором он здесь используется, представляет собой измененный инсулин, отличный от инсулина, секретируемого поджелудочной железой, но все же доступный для организма для выполнения тех же функций, что и инсулин природного происхождения. Посредством генетической инженерии, соответствующей ДНК может быть изменена аминокислотная последовательность инсулина для изменения ее характеристик ADME (абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции). Примеры включают лизпро-инсулин, инсулин гларгин, инсулин аспарт, инсулин глулизин, инсулин детемир. Инсулин может быть также модифицирован химически, например, путем ацетилирования. Аналоги человеческого инсулина в том смысле, в котором они здесь используются, представляют собой измененный человеческий инсулин, который способен выполнять те же биологические функции, что и человеческий инсулин.

«Хелатор» или «хелатирующий агент» в том смысле, в котором они здесь используются, относятся к химическому соединению, которое имеет способность образовывать одну или несколько связей с ионами цинка. Связи являются, как правило, ионными или координационными связями. Хелатор может являться неорганическим или органическим соединением. Хелатный комплекс представляет собой комплекс, в котором ион металла связан с двумя или более атомами хелатирующего агента.

«Солюбилизирующий агент» в том смысле, в котором он здесь используется, представляет собой соединение, которое повышает растворимость веществ в растворителе, например, инсулина в водном растворе. Примеры солюбилизирующих агентов включают поверхностно-активные вещества (TWEENS®); растворитель, такой как этанол; мицеллообразующие соединения, такие как оксиэтиленовый моностеарат; и рН-модифицирующие агенты.

«Растворяющий агент» в том смысле, в котором он здесь используется, представляет собой кислоту или соль, которые при добавлении к инсулину и EDTA, повышают транспорт и абсорбцию инсулина относительно HCl и EDTA при тех же значениях рН при измерении методом с использованием эпителиальных клеток в планшетах системы Трансвелл, описанного в примерах ниже. HCl не является растворяющим агентом, но может быть солюбилизирующим агентом. Лимонная кислота и лимоннокислый натрий являются растворяющими агентами при измерениях данным методом. Считается, что это достигается, по крайней мере, частично, путем маскировки зарядов на инсулине, некоторые из которых экспонированы во время диссоциации из гексамера.

«Вспомогательное вещество» в том смысле, в котором оно здесь используется, представляет собой неактивное вещество, отличное от хелатора или растворяющего агента, используемое в качестве носителя для инсулина или используемое, чтобы помочь процессу, посредством которого производят продукт. В таких случаях, активное вещество растворяют или смешивают со вспомогательным веществом.

«Физиологическое значение рН» в том смысле, в котором оно здесь используется, находится в диапазоне от 6,8 до 7,6, предпочтительно от 7 до 7,5, наиболее предпочтительно приблизительно равно значению 7,4.

VIAJECT™ в том смысле, в котором он здесь используется, является торговой маркой рекомбинантного человеческого инсулина, составленного вместе с растворяющим агентом, таким как лимонная кислота, и хелатором, таким как EDTA. Viaject 25 ед/мл (СЕ 25-4) содержит 25 ед/мл простого рекомбинантного человеческого инсулина, 1,8 мг/мл лимонной кислоты, 1,8 мг/мл двунатриевой EDTA, 0,82% NaCl (изотонического) и 3 мг/мл м-крезола. Он поставляется в виде водного раствора, который хранится замороженным, или в виде набора, состоящего из двух частей, включающих в себя сухой порошок инсулина и растворитель, по крайней мере, один из которых содержит лимонную кислоту и EDTA. Значение рН как ресуспендированной смеси, так и замороженного раствора приблизительно равно значению рН 4. Viaject 100 ед/мл (СЕ 100-4) содержит 100 ед/мл простого рекомбинантного человеческого инсулина, 1,8 мг/мл лимонной кислоты, 1,8 мг/мл двунатриевой EDTA, 22 мг/мл глицерина, 3 мг/мл м-крезола. Он также поставляется либо в виде замороженного водного раствора, либо в виде набора, состоящего из двух частей, включающих в себя сухой порошковый инсулин и растворитель. Значение рН как ресуспендированной смеси, так и замороженного раствора приблизительно равно 4. Viaject 100 ед/мл (СЕ 100-7) содержит 100 ед/мл простого рекомбинантного человеческого инсулина, 1,8 мг/мл лимонной кислоты, 1,8 мг/мл двунатриевой EDTA, 22 мг/мл глицерина, 3 мг/мл м-крезола. Он поставляется в виде водного раствора, имеющего значение рН, приблизительно равное 7,4, который может храниться при 4°С. VIAject с кислыми солями (CSE 100-7) изготавливают путем добавления 1,8 мг/мл как EDTA, так и тринатриевого цитрата к воде, затем добавляя 100 ед/мл инсулина, снижая рН до 6, затем повышая рН до 7,4.

Лекарственные формы

Лекарственные формы включают инсулин, хелатор и растворяющее(ие) вещество(а) и, в некоторых случаях, один или несколько других вспомогательных веществ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения лекарственные формы пригодны для подкожного применения и быстро абсорбируются жировой подкожной тканью. Выбор растворяющего агента и хелатора, концентрации, как растворяющего агента, так и хелатора, и значение рН, до которого доводят лекарственную форму, оказывают значительное влияние на эффективность системы. Хотя многие комбинации обладают эффективностью, предпочтительный вариант осуществления изобретения выбран по многим причинам, включая безопасность, стабильность, регуляторный профиль и степень эффективности.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, по крайней мере, один из ингредиентов лекарственной формы выбран для маскировки зарядов на активном веществе. Это может облегчить трансмембранный транспорт инсулина и, тем самым, ускорить как начало действия, так и увеличить биодоступность инсулина. Ингредиенты также выбирают для создания композиций, которые растворяются быстро в водной среде. Предпочтительно инсулин абсорбируется и транспортируется в плазму крови быстро, приводя к быстрому началу действия (предпочтительно, начиная в пределах приблизительно 5 минут после применения и достигая максимальных концентраций приблизительно на 15-30 минуте после применения).

Хелатор, такой как EDTA, образует хелатное соединение с цинком в инсулине, устраняя цинк из раствора инсулина. Это обусловливает принятие инсулином димерной или мономерной формы и сдерживает повторный переход в гексамерное состояние. Исследования, описанные в примерах, указывают на то, что общий размер диссоциирующего гексамера больше комплекса цинка с инсулиновым гексамером, который затем образует меньшие по размеру молекулы. Поскольку гексамеры, димеры и мономеры существуют в зависящем от концентрации равновесии, по мере того, как абсорбируются мономеры, образуется больше мономеров. Таким образом, по мере того как мономеры инсулина абсорбируются через подкожную ткань, дополнительные димеры распадаются с образованием большего количества мономеров. Полностью диссоциированная мономерная форма имеет молекулярный вес, который меньше одной шестой молекулярного веса гексамерной формы, тем самым значительно повышая как скорость, так и уровень абсорбции инсулина. В тех случаях, когда хелатор (такой как EDTA) и/или растворяющий агент (такой как лимонная кислота) образует водородную связь с инсулином, считается, что это маскирует заряд на инсулине, облегчая его трансмембранный транспорт и, следовательно, ускоряя как начало действия, так и повышая биодоступность инсулина.

Инсулин

Инсулин может быть рекомбинантным или очищенным из природного источника. Инсулин может быть человеческим или не относящимся к человеку. Предпочтительнее человеческий инсулин. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения инсулин является человеческим рекомбинантным инсулином. Рекомбинантный человеческий инсулин доступен из целого ряда источников. Инсулин также может быть инсулиновым аналогом, в основе которого лежит аминокислотная последовательность человеческого инсулина, но имеющим одно или несколько аминокислотных отличий, или химически модифицированным инсулином или аналогом инсулина.

Дозировка инсулина зависит от его биодоступности и пациента, подлежащего лечению. Инсулин, как правило, включает в себя диапазон доз, равный 1,5-100 МЕ, предпочтительно 3-50 МЕ на дозу, допустимую для человеческого организма. Как правило, инсулин поставляется в 100 МЕ ампулах.

Растворяющие агенты

Определенные кислоты, или их соли, по-видимому, маскируют заряды на инсулине, повышая накопление и транспорт, как показано на Фигуре 1. Те кислоты, которые эффективны в качестве растворяющих агентов, включают уксусную кислоту, аскорбиновую кислоту, лимонную кислоту, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, янтарную, фумаровую, малеиновую и адипиновую кислоту относительно соляной кислоты, согласно измерениям методом с использованием системы Трансвелл, описанным в приведенных ниже примерах. Например, если активным веществом является инсулин, предпочтительным растворяющим агентом является лимонная кислота. Соляная кислота и гидроокись натрия являются предпочтительными агентами для регулирования значения рН. HCl может быть использована в комбинации с любой из лекарственных форм, но не является растворяющим агентом.

Соли кислот включают ацетат натрия, аскорбат, цитрат, глутамат, аспартат, сукцинат, фумарат, малеат и адипинат. Соли органических кислот могут быть приготовлены, используя целый ряд оснований, включая, в числе прочего, гидроокиси металлов, оксиды металлов, карбонаты и бикарбонаты металлов, амины металлов, а также аммонийные основания, такие как хлорид аммония, карбонат аммония и т.п. Пригодные металлы включают моновалентные и поливалентные ионы металлов. Иллюстративные ионы металлов включают металлы Группы 1, такие как литий, натрий и калий; металлы Группы 2, такие как барий, магний, кальций и стронций; металлоиды, такие как алюминий. Поливалентные ионы металлов могут быть пригодными для органических кислот, содержащих более одной карбоксильной группы, поскольку эти ионы могут одновременно образовывать комплекс с более чем одной карбоксильной группой.

Область значений растворяющего агента соответствует эффективному количеству лимонной кислоты в комбинации с инсулином и EDTA величиной от 9,37×10^-4 М до 9,37×10^-2 М лимонной кислоты.

Хелаторы

В предпочтительном варианте осуществления изобретения хелатор цинка смешивают с инсулином. Хелатор может быть ионным или неионным. Пригодные хелаторы включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), EGTA, альгиновую кислоту, альфа-липоевую кислоту, димеркаптоянтарную кислоту (DMSA), CDTA (1,2-диаминциклогексантетрауксусную кислоту), тринатриевый цитрат (TSC). Соляная кислота используется в сочетании с TSC для регулирования значения рН и в процессе, приводящем к образованию лимонной кислоты, которая является растворяющим агентом.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения хелатором является EDTA. Хелатор захватывает цинк из инсулина, тем самым, способствуя образованию димерной формы инсулина, нежели гексамерной формы, и облегчая абсорбцию инсулина тканями, окружающими сайт его введения (например, слизистая оболочка или жировая ткань). Кроме того, водород хелатора может связываться с активным веществом, тем самым, способствуя маскировке заряда мономеров инсулина и облегчая трансмембранный транспорт мономеров инсулина.

Область значений хелатора соответствует эффективному количеству EDTA в комбинации с инсулином и лимонной кислотой величиной от 2,42×10^-4 М до 9,68×10^-2 М EDTA.

Вспомогательные вещества

Фармацевтические композиции могут быть составлены общепринятым способом, используя один или несколько физиологически приемлемых носителей, включающих вспомогательные вещества и добавки, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически. Технология приготовления лекарственных средств описана, например, в Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1975), and Liberaian, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y. (1980).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения один или несколько солюбилизирующих веществ, включены в состав инсулинового вещества для активизации быстрого растворения в водной среде. Пригодные солюбилизирующие вещества включают увлажняющие вещества, такие как полисорбаты, глицерин и полоксамеры, неионные и ионные поверхностно-активные вещества, пищевые кислоты и основания (например, бикарбонат натрия), и спирты, и буферные соли для контроля значения рН.

Стабилизаторы используют для ингибирования или замедления реакций распада лекарственного средства, которые включают, как пример, окислительные реакции. Целый ряд стабилизаторов может быть использован. Пригодные стабилизаторы включают полисахариды, такие как целлюлоза и производные целлюлозы, и простые спирты, такие как глицерол; бактериостатические вещества, такие как фенол, м-крезол и метилпарабен; изотонические вещества, такие как хлорид натрия, глицерол и глюкоза; лецитины, например, такие как природные лецитины (например, лецитин яичного желтка или соевый лицитин) и синтетические или полусинтетические лецитины (например, димиристоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин или дистеароилфосфатидилхолин; фосфатидные кислоты; фосфатидилэтаноламины; фосфатидилсерины, такие как дистеароилфосфатидилсерин, дипальмитоилфосфатидилсерин и диарахидоилфосфатидилсерин; фосфатидилглицеролы; фосфатидилинозитолы; кардиолипины; сфингомиелины. В одном примере, стабилизатор может представлять собой комбинацию глицерола, бактериостатических веществ и изотонических веществ.

II. Методы создания лекарственных форм

Инъекционная лекарственная форма содержит инсулин, хелатор и растворяющий агент. В предпочтительном варианте осуществления изобретения инъекционная лекарственная форма содержит инсулин, EDTA, лимонную кислоту, солевой раствор и/или глицерин.

В одном варианте осуществления изобретения лекарственную форму для подкожных инъекций создают смешиванием солевого раствора и глицерина, лимонной кислоты и EDTA для образования раствора и стерилизации раствора (именуемый «разбавитель»). Инсулин добавляют отдельно к стерильной воде с образованием раствора, фильтрованного, и определенное количество вносят в каждый из целого ряда отдельных стерильных флаконов для инъекций. Раствор инсулина лиофилизируют для получения порошка, и его следует хранить отдельно от разбавителя для сохранения его стабильности. Перед применением разбавитель добавляют к содержащему инсулин флакону для инъекций. После подкожной инъекции заданного количества инсулина пациенту, оставшийся раствор инсулина может быть сохранен, предпочтительно рефрижерацией.

В другом варианте осуществления изобретения инсулин объединяют с разбавителем, рН 4, фильтруют в стерильных условиях в инъекционные ампулы или картриджи для многократного использования и замораживают до использования.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения инсулин приготавливают в виде водного раствора, при рН 7,0, в ампулах или картриджах и хранят при 4°С.

III. Методы использования лекарственных форм

Лекарственные формы могут быть введены путем подкожной или внутримышечной инъекции. Лекарственную форму создают для быстрой абсорбции и транспорта в плазму крови для системной доставки.

Лекарственные формы, содержащие инсулин в качестве активного вещества, могут быть назначены пациенту, страдающему сахарным диабетом типа 1 или типа 2 до еды или во время еды. Вследствие быстрой абсорбции композиции могут останавливать преобразование гликогена в глюкозу в печени, тем самым предотвращая гипергликемию, основную причину осложнений сахарного диабета и первый симптом сахарного диабета типа 2. В настоящее время, стандартные подкожные инъекции человеческого инсулина должны быть введены приблизительно за 30-60 минут до еды, чтобы не превышать желаемый эффект, поскольку инсулин абсорбируется слишком медленно, чтобы остановить образование глюкозы в печени. Кроме того, если о прогрессировании заболевания известно заблаговременно, то подкожные композиции инсулина способны замедлить или остановить прогрессирование сахарного диабета типа 2.

Преимущество лекарственной формы с низким значением рН в том, что она может быть смешана с BYETTA® (эксенатидом), SYMLIN® (прамлинтида ацетатом) и LANTUS® (инсулиновым аналогом пролонгированного действия), ни один из которых не может быть смешан с другими типами имеющегося в продаже инсулина вследствие разделения фаз и преципитации.

Преимущество инсулина с более высокими значениями рН в том, что он более стабилен за время хранения, нежели инсулин с более низким значением рН.

Настоящее изобретение будет в дальнейшем понятным на основе нижеперечисленных неограниченных примеров. Нижеперечисленные виды инсулина были использованы в примерах.

HUMULIN® (RHI) является рекомбинантным человеческим инсулином. Каждый миллилитр содержит 100 единиц простого рекомбинантного человеческого инсулина, 0,22% м-крезола, 1,4-1,8% глицерина, рН 7. Он имеется в продаже из нескольких источников.

HUMALOG® из Eli Lilly (IL), инъекционный раствор лизпро-инсулина, является аналогом рекомбинантного человеческого инсулина, представляющий собой аналог Lys(B28), Pro(B29) человеческого инсулина, созданного обменом месторасположения аминокислот в позициях 28 и 29 в В-цепи инсулина. Каждый миллилитр инъекционного раствора IL содержит 100 единиц лизпро-инсулина, 16 мг глицерина, 1,88 мг двухосновного фосфата натрия, 3,15 мг метакрезола, количество оксида цинка, доведенное до уровня 0,0197 мг ионов цинка, следовые количества фенола, и воду для инъекционного раствора. Лизпро-инсулин имеет значение рН в диапазоне от 7,0 до 7,8. 10% соляная кислота и/или 10% гидроокись натрия могут быть добавлены для регулирования значения рН. Одна единица IL имеет тот же самый эффект снижения уровня глюкозы, что и одна единица простого человеческого инсулина, но его эффект действия оказывается быстрее и с более короткой продолжительностью.

NOVOLOG® (IA) является аналогом рекомбинантного инсулина, поставляемого Novo Nordisk A/S. Аналог содержит единичную замену аминокислоты пролина на аспарагиновую кислоту в позиции В28 и продуцируется рекомбинантными дрожжами. Поставляется в стерильном водном растворе, содержащим 100 единиц инсулина аспарт/мл, 16 мг/мл глицерина, 1,50 мг фенола/мл, 1,72 мг метакрезола/мл, 19,6 мг цинка/мл, 1,25 мг двузамещенного фосфорнокислого натрия дигидрата/мл, 0,58 мг хлорида натрия/мл, имеющего значение рН в диапазоне от 7,2 до 7,6, доведенное 10% HCl или NaOH.

VIAJECT™ является рекомбинантным человеческим инсулином, составленным в виде смеси с лимонной кислотой и EDTA. Viaject 25 ед/мл (СЕ 25-4) содержит 25 ед/мл простого рекомбинантного человеческого инсулина, 1,8 мг/мл лимонной кислоты, 1,8 мг/мл двунатриевой EDTA, 0,82% NaCl (изотонического) и 3 мг/мл м-крезола. Он поставляется в виде водного раствора, который хранится замороженным, или в виде набора, состоящего из двух частей, включающих в себя сухой порошковый инсулин и растворитель, по крайней мере, один из которых содержит лимонную кислоту и EDTA. Значение рН как ресуспендированной смеси, так и замороженного раствора приблизительно равно значению рН 4. Ресуспендированный порошок - это то, что использовалось в примерах. Viaject 100 ед/мл (СЕ 100-4) содержит 100 ед/мл простого рекомбинантного человеческого инсулина, 1,8 мг/мл лимонной кислоты, 1,8 мг/мл двунатриевой EDTA, 22 мг/мл глицерина, 3 мг/мл м-крезола. Он также поставляется либо в виде замороженного водного раствора, либо в виде набора, состоящего из двух частей, включающих в себя сухой порошковый инсулин и растворитель. Значение рН как ресуспендированной смеси, так и замороженного раствора приблизительно равно 4. Только замороженный водный раствор был использован в аналитических данных центрифугирования и анализаторах Malvern. Viaject 100 ед/мл (СЕ 100-7) содержит 100 ед/мл простого рекомбинантного человеческого инсулина, 1,8 мг/мл лимонной кислоты, 1,8 мг/мл двунатриевой EDTA, 22 мг/мл глицерина, 3 мг/мл м-крезола. Он поставляется в виде водного раствора, имеющего значение рН, приблизительно равное 7,4, который может храниться при 4°С. Он был использован в исследованиях на свиньях. VIAject с кислыми солями (CSE 100-7) изготавливают с использованием 1,8 мг/мл как EDTA, так и тринатриевого цитрата в воде, с использованием 100 ед/мл инсулина и глицерина (22 мг/мл). Конечное значение рН доводят до 7,4 с помощью гидроокиси натрия. Он был использован в последнем примере для сбора информации в анализаторе Malvern.

Пример 1: Сравнительный анализ in vitro накопления и транспорта инсулина методом с использованием эпителиальных клеток в системе Трансвелл в зависимости от растворяющего агента.

Материалы и методы

Эпителиальные клетки ротовой полости были выращены во вкладышах системы Трансвелл в течение двух недель, пока множественные клеточные слои (4-5 слоев) не были образованы, как показано на Фигуре 2. Исследования транспорта проводили добавлением соответствующих растворов в донорную лунку и удалением образцов из приемной лунки, спустя 10 минут. Растворы состояли из воды, +/- EDTA (0,45 мг/мл), NaCl (0,85% вес/объем), 1 мг/мл инсулина и достаточного количества кислоты для поддержания рН на уровне 3,8. Количество инсулина в приемных лунках было проанализировано методом ELISA.

Результаты

Результаты, представленные на Фигурах 3а и 3b, демонстрируют, что некоторые кислоты более эффективны в повышении накопления и транспорта инсулина через эпителиальные клетки. Они могут быть легко проверены и сравнены с результатами, полученными с использованием HCl, тем самым создавая стандарт, против которого любая кислота может быть протестирована и определена как растворяющий агент (т.е., повышающий накопление и транспорт относительно HCl) или нет.

Результаты, полученные на кислотах со значениями рН в диапазоне 3,2-3,8 расположены группами на Фигуре 3а. Более сильные кислоты (рН<3) расположены группами на Фигуре 3b.

Результаты показывают, что выбор кислоты с одной и той же концентрацией хелатора, имеет существенное влияние на транспорт инсулина через клеточную культуру. Предпочтительной является лимонная кислота.

Пример 2: Сравнительный анализ in vitro накопления и транспорта инсулина методом с использованием эпителиальных клеток в системе Трансвелл в зависимости от концентрации растворяющего агента.

Материалы и методы

Материалы и методы Примера 1 были использованы с различными концентрациями реагентов. В данном исследовании эквимолярные концентрации кислоты и хелатора были добавлены. Растворы состояли из воды, +/- EDTA (0,56 мг/мл), NaCl (0,85% вес/объем), 1 мг/мл инсулина и кислоты: аспарагиновой кислоты (0,20 мг/мл), глутаминовой кислоты (0,22 мг/мл) или лимонной кислоты (0,20 мг/мл). Лимонная кислота была протестирована при более высокой концентрации, равной 1,8 мг/мл, в присутствии и в отсутствие хелатора. Эти данные представлены в двух временных периодах, 10 и 30 минутах, после дозирования исследуемого препарата в клеточной донорной камере.

Результаты

Результаты, полученные с использованием аспарагиновой кислоты (0,20 мг/мл), глутаминовой кислоты (0,22 мг/мл) или лимонной кислоты (0,29 мг/мл), представлены на Фигуре 4а. В этом случае, не наблюдали значительной разницы при добавлении хелатора.

Напротив, исследование с использованием более высокой концентрации лимонной кислоты, равной 1,80 мг/мл, действительно показывает значительное увеличение (сравнительный анализ с использованием критерия Стьюдента, одностороннего) при добавлении хелатора к раствору. Смотри Фигуру 4b. Она демонстрирует, что концентрация обоих компонентов важна в оптимизации накопления и транспорта.

Пример 3: Сравнительный анализ in vitro накопления и транспорта инсулина методом с использованием эпителиальных клеток в системе Трансвелл в зависимости от хелатора

Материалы и методы

Эпителиальные клетки ротовой полости были выращены во вкладышах системы Трансвелл в течение двух недель, пока не были образованы множественные клеточные слои (4-5 слоев). Исследования транспорта проводили добавлением соответствующих растворов в донорную лунку и удалением образцов из приемной лунки, спустя 10, 20 и 30 минут.

Растворы были приготовлены непосредственно перед проведением экспериментов в системе Трансвелл следующим способом: лимонная кислота в концентрации 1,8 мг/мл была разведена в 0,85% (вес/объем) солевом растворе, и затем один из нижеперечисленных хелаторов был добавлен к этому раствору в указанной концентрации: 1,80 мг/мл EDTA, 1,84 мг/мл EGTA, 0,88 мг/мл DMSA и 1,42 мг/мл TSC. Поскольку CDTA была использована в ее жидкой форме, лимонная кислота была добавлена непосредственно к CDTA. В каждом из этих случаев концентрация хелатора была постоянной, равной 4,84×10^-3 молей.

Инсулин затем был добавлен в концентрации 1 мг/мл, и значение рН было вторично доведено до уровня 3,8 по мере необходимости. Контрольный набор образцов, используя только HCl для корректировки значения рН, включены в сравнительный анализ. Эксперименты в системе Трансвелл были выполнены путем добавления 0,2 мл каждого раствора в донорные лунки.

Количество инсулина в приемных лунках было проанализировано методом ELISA.

Результаты

На Фигуре 5 показано графическое представление 30 минутных данных по инсулину. Выявлено значительно больше инсулина, доставленного через клетки, при использовании лимонной или глутаминовой кислот, кроме тех случаев, когда сравнивали с результатами, полученными с использованием TSC (тринатриевого цитрата). В случае TSC, HCl была использована для корректировки значения рН. Корректировка значения рН, создаваемого лимонной кислотой, объясняет эти результаты.

Как показывают эти результаты, увеличение накопления и транспорта зависит от выбора хелатора.

Пример 4: Доклиническая оценка хелаторов в основанной на лимонной кислоте лекарственной форме инсулина на свиньях.

Материалы и методы

Вместе с опубликованным исследованием, A. Plum, H. Agerso and L. Andersen. Pharmacokinetics of the rapid-acting insulin analog, insulin aspart, in rats, dogs, and pigs, and pharmacodynamics of insulin aspart in pigs. Drug Metab. Dispos., 28(2): 155-60 (2000), было выявлено, что период полувыведения является хорошей детерминантой абсорбции инсулина, поскольку задержка выведения означает более медленную абсорбцию из участка инъекции. В связи с этим, анализ исследования карликовых свиней без использования камерной модели был выполнен для изучения параметров РК и PD, в частности, периода полувыведения.

Свиньям, больным сахарным диабетом, подкожно инъецировали одну из четырех лекарственных форм инсулина. Три лекарственные формы содержали хелатор (EDTA, EGTA или TSC) и четвертый контроль содержал только простой человеческий инсулин RHI, без хелатора. Лимонная кислота (1,8 мг/мл) была использована в качестве кислоты во всех лекарственных формах с хелаторами в их составе, и NaCl и м-крезол были добавлены для изотоничности и стерильности лекарственной формы во всех случаях. Все хелаторы находились в одной и той же молярной концентрации, равной 4,84×10^-3 молей.

Свиней не кормили всю ночь, и им подкожно вводили дозу величиной 0,125 ед/кг человеческого инсулина, содержащего EDTA (n=3), или 0,08 ед/кг человеческого инсулина, содержащего EGTA или TSC (n=2). Дозы были снижены вследствие чрезмерного снижения глюкозы в крови при использовании более высоких доз. Уровни глюкозы и инсулина в крови были определены во всех временных точках вплоть до 8 часов после введения дозы.

Фармакокинетическое моделирование было выполнено с помощью WinNonlin, используя бескамерную модель с равномерным взвешиванием. Периоды полувыведения сравнены в Таблице 1:

Таблица 1
Сравнительный анализ глюкозы в крови свиней в зависимости от хелатора Инсулин Период полувыведения «лямбда z» (мин+/-sd)
Конечный период полувыведения RHI/без хелатора 120 Инсулин/EDTA 39,1+/-15,8 Инсулин/EGTA 37,5+/-8,0 Инсулин/TSC 30,1+/-9,0

Период полувыведения простого человеческого инсулина (120 мин) в этом пилотном исследовании на свиньях соответствует тому, что встречается в литературных данных, и был использован в качестве контрольной точки для оценки данных. Так как он значительно длиннее по продолжительности, нежели после внутривенного введения, подтверждается тот факт, что существует продолжительная медленная абсорбция из сайта инъекции вслед за инъекцией. Хелаторы в лекарственной форме с лимонной кислотой в ее составе отчетливо демонстрируют снижение этого параметра, указывая на то, что эти три хелатора эффективны в повышении абсорбции простого человеческого инсулина, хотя в разной степени.

Пример 5: Сравнение лекарственной формы инсулина, содержащей EDTA-лимонную кислоту, с простым человеческим инсулином в клинических испытаниях на людях.

Материалы и методы

Целью настоящего исследования являлась оценка фармакодинамических (PD) свойств контрольной лекарственной формы, содержащей инсулин в комбинации с лимонной кислотой и EDTA, «СЕ 25-4». Пять эугликемических глюкозных клэмп-тестов (Biostator; целевой уровень глюкозы в крови 90 мг/дл) были выполнены натощак у 10 здоровых добровольцев (средний возраст 40 (диапазон от 20 до 62 лет); BMI 22,5 (19,2-24,9) кг/м²). Используя перекрестный дизайн с фиксированным порядком лечения, 12 IU простого инсулина и 12 IU лекарственной формы инсулина СЕ были подкожно инъецированы в абдоминальную область.

Результаты

Результаты представлены на Фигурах 6 и 7. Результатом SC инъекции СЕ 25-4 был профиль действия, который формировал значительно более быстрый подъем в потреблении глюкозы под действием простого человеческого инсулина (Фигура 6). Средние фармакокинетические данные подтверждают PD результаты (Фигура 7).

Данное исследование показывает, что добавление лимонной кислоты и EDTA к простому человеческому инсулину улучшает скорость абсорбции инсулина, о чем свидетельствует более быстрое достижение максимальной концентрации (Фигура 7) и более быстрое начало действия (Фигура 6) по сравнению с обычным человеческим инсулином в чистом виде.

Пример 6: Фармакокинетика и фармакодинамика инсулина СЕ, лизпро-инсулина и обычного человеческого инсулина после подкожного введения непосредственно перед приемом пищи у пациентов, страдающих сахарным диабетом Типа 1.

Уровень техники и цели:

Целью данного исследования была оценка действия СЕ 25-4, RHI и IL на постпрандиальную амплитуду колебаний уровня глюкозы в крови (BG) после стандартного приема пищи у пациентов, страдающих диабетом Типа 1.

Материалы и методы

BG 9 пациентов (5 мужчин и 4 женщины; возраст 40±10 лет, BMI 24,0±2,0 кг/м²) были стабилизированы посредством глюкозного клэмп-теста (целевой BG 120 мг/дл) до приема пищи. Инфузия глюкозы была остановлена до стандартного приема пищи и введения дозы инсулина. Используя перекрестный дизайн с фиксированным порядком лечения, одна и та же специфичная для пациента доза VIAject™ (CE25-4) IL или RHI была введена подкожно непосредственно перед приемом пищи. Следующим шагом было непрерывное мониторирование постпрандиальной амплитуды колебания уровня глюкозы в течение 8 часов, и инфузия глюкозы была повторно запущена, если BG был менее 60 мг/дл. Уровни инсулина в плазме определяли на протяжении всего исследования.

Результаты

Результаты представлены в Таблице 2 в виде среднего значения плюс или минус стандартное отклонение, сравнивая Тмакс после подкожного введения пациентам, страдающим сахарным диабетом Типа 2, после приема пищи простого человеческого инсулина, инсулина с лимонной кислотой и EDTA (СЕ) и лизпро. В Таблице 3 представлены результаты сравнения уровня глюкозы в крови для тех же исследуемых субъектов.

Таблица 2
Сравнение Тмакс(мин) инсулина Фармакокинетика RHI IL (CE25-4) Тмакс(мин) инсулина 143±29* 62±37 43±36* * p<0,001, парный t-тест

Таблица 3
Сравнение фармакокинетики инсулина по уровню глюкозы в крови Фармакодинамика (0-180 мин) RHI IL CE 25-4 BG Тмакс (мин) 93±56* 47±28 41±26* BG макс (мг/дл) 185±44 158±33 157±27 BG мин (мг/дл) 103±21 73±31 87±24 BG макс-BG мин (мг/дл) 82±30 84±11* 70±18* *p<0,05, парный t-тест

Общее число гипогликемических событий (часов, требующих инфузию глюкозы) спустя 3-8 часов после инъекции было равно 13 с использованием RHI, 11 с использованием IL и 4 с использованием СЕ 25-4 лекарственной формы. Усредненное общее количество глюкозы, введенной путем инфузии для предотвращения гипогликемии в течение этого времени, было в шесть раз выше для RHI и в два раза больше для IL, чем с CE 25-4. Области выше и ниже нормального гликемического допустимого диапазона (BG AUC выше 140 и ниже 80 мг/дл), просуммированные для всех пациентов в каждой группе, составляли 81895 для RHI, 57423 для IL и 38740 мг/дл*мин для СЕ 25-4. Средние уровни глюкозы в крови представлены на Фигуре 8.

СЕ 25-4 был самым быстрым в снижении подъема уровня глюкозы в крови после стандартного приема пищи. У пациентов, леченных СЕ 25-4, обнаруживали сниженные постпрандиальные амплитуды колебания уровня глюкозы. Напротив, RHI обусловливал наивысшие амплитуды колебания уровня глюкозы, что соответствует его более медленной скорости абсорбции. Дисперсия уровней глюкозы (средняя разница между максимальным и минимальным значениями) была значительно меньше для СЕ 25-4, чем для IL, демонстрируя лучший гликемический контроль СЕ 25-4 у этих пациентов, страдающих сахарным диабетом Типа 1.

Пример 7: Характеристика размера инсулинов методом светорассеяния.

СЕ 100-4 обладал очень быстрым началом действия у пациентов. Чтобы понять основы появления профиля быстрой абсорбции, были выполнены эксперименты in vitro с использованием СЕ 100-4 в сравнении с другими имеющимися в продаже рекомбинантными человеческими инсулинами и быстродействующими аналогами инсулина. Была применена техника светорассеяния к исходным продуктам, а также к серии разведений в искусственном внеклеточном буферном растворе. Результаты показывают, что в отличие от простого рекомбинантного инсулина и быстродействующих аналогов, СЕ 100-4 уменьшается в размере приблизительно до размера димера после разведения 1:3, что соответствует его профилю быстрой абсорбции.

Материалы и методы

Чтобы выяснить механизм данного быстрого начала действия, были спланированы эксперименты in vitro для исследования эффекта разведения общепринятой лекарственной формы в искусственном внеклеточном буферном растворе как способа моделирования, что происходит в естественных условиях после подкожной инъекции. Техника светорассеяния была использована для оценки распределения среднего размера молекул (нм). Имеющиеся в продаже лекарственные формы инсулина быстрого действия или прандиального инсулина, которые были использованы для сравнительного анализа в данных экспериментах in vitro, были следующие: IL, IA, RHI и CE 100-4. Для сравнительного анализа размера стандартные препараты мономерного (рН 2,0) и гексамерного цинксодержащего инсулина (рН 7) были использованы в качестве стандартов.

Была дана характеристика размеров имеющихся в продаже инсулинов с помощью Zetasizer nano (Malvern Inst, UK). Один мл образцов был помещен в стеклянную кювету и был проанализирован с целью определения усредненного объемного распределения инсулина по размеру (нм) в растворе. Среднее значение 3 образцов (каждый образец анализировали несколько раз) было использовано в качестве основы для сравнительного анализа. После первоначального анализа полного состава была сделана серия разведений от 1:2 до 1:16 в буфере, имеющем такое же значение рН и такую же буферную емкость, что и внеклеточная жидкость (ECF, 0,7 мМ MgCl₂, 1,2 мМ CaCl₂, 0,2 мМ KCl, 0,5 мМ Na₂SO₄, 104 мМ NaCl, 28,3 мМ NaHCO₃). Средний размер был определен для всех разведений с каждым из имеющихся в продаже инсулинов и СЕ 100-4, чтобы понять распределение частиц мономер/димер/гексамер по размеру для каждой лекарственной формы.

Инсулины

RHI, IL, IA и CE 100-4.

Разбавители

ECF, 0,7 мМ MgCl₂, 1,2 мМ CaCl₂, 2 мМ KH₂PO₄, 2 мМ KCl, 0,5 мМ Na₂SO₄, 104 мМ NaCl, 28,3 мМ NaHCO₃ в стерильной воде.

Результаты

В исследованиях по измерению размеров частиц неразведенный СЕ 100-4 был больше IL, IA и RHI. Однако в разведении 1:3 средний размер СЕ 100-4 уменьшился на 2 нм до размера мономера/димера, хотя другие исследованные инсулины оставались размером с гексамер величиной приблизительно 5 нм. Размер СЕ 100-4, но не IL, IA и RHI, и дальше уменьшался с увеличением разведения. Неразведенный RHI оказался меньшим по размеру, но увеличивался в размере более чем на 5 нм при однократном разведении 1:1 и оставался данного размера вплоть до разведения 1:16.

Неразведенный СЕ 100-4 вначале оказался большего размера, чем другие исследованные инсулины, возможно по причине наличия лимонной кислоты и EDTA, слабо взаимодействующих с поверхностью, которые могут содействовать дальнейшему увеличению скорости абсорбции из подкожных участков путем маскировки поверхностного заряда. Заряд может быть препятствием для абсорбции. Вскоре после подкожного введения ввиду того, что инъецируемый материал разводится ECF, СЕ 100-4 имеет меньший средний размер, чем быстродействующие инсулиновые аналоги и RHI в идентичных разведениях.

Пример 8: Аналитическое ультрацентрифугирование инсулина

Материалы и методы

Был разработан ряд экспериментов, используя аналитическое ультрацентрифугирование, которое определяет возможное значение средневзвешенного коэффициента седиментации (Сведберг 20°С, вода S(20,w)), пропорционального определяемой по плавучести эффективной молекулярной массе. Методика для данного анализа несколько отличалась от определения размера светорассеянием. Во-первых, каждый образец разводили разбавителем, который идентичен по составу таковому коммерческого продукта. Для этого приспособление с мембранным фильтром Centriprep® Ultracel-3 (Millipore Inc, MA, USA) с пороговым значением пропускания, равным MW 3 кДа, было использовано для отделения инсулина от разбавителя. Исходный разбавитель был извлечен и проанализирован на наличие какого-либо содержания инсулина. Верифицированные, не содержащие инсулин разбавители были использованы для разбавления коммерческого продукта.

Эти первые наборы данных были использованы для характеристики инсулина либо как стабильного соединения одного типа, либо как такового, изменяющегося от гексамера, димера до мономера в собственном разбавителе. Два набора данных были получены, используя аналитическое ультрацентрифугирование. Первый набор данных был получен путем разбавления, точно таким же разбавителем, как в лекарственной форме. В случае коммерческих препаратов эти данные были получены с использованием пробирок Centriprep, которые отделили инсулин или аналог от разбавителя. Фильтрат был проверен на содержание белка и после подтверждения был использован для разбавителя в первом цикле экспериментов.

Второй набор образцов был приготовлен, заменяя ECF буфер вместо разбавителя. Для того, чтобы это работало, самый концентрированный образец был разбавлен сначала с помощью ECF 1:2. Дальнейшие разведения были выполнены с помощью ECF. В случае СЕ 100-4, начальное разведение с помощью ECF было 1:4, чтобы быть уверенным в том, что изоэлектрическая точка пройдена для исключения любых случаев преципитации. Эти эксперименты были предназначены для имитации условий окружающей среды после подкожной инъекции.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой вводимой концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице. Анализ скоростей был проведен при 20°С и 55000 об/мин, используя интерференционную оптическую систему, оснащенную аналитической ультрацентрифугой Beckman-Coulter XL. Двухсекторные искусственные контурные ячейки, оборудованные сапфировыми волноводными окнами, были использованы для сопоставления менисков образца и контроля. Ротор был уравновешен под вакуумом при 20°С и спустя приблизительно 1 час при 20°С ротор был разогнан до 55000 об/мин. Интерференционные изображения были получены с 60 секундными интервалами в течение 5 часов.

Несколько аналитических программ было запущено применительно к данным (DcDt+ версия 2.1.02 и Sedfit версия 11.3b3) для извлечения информации, специфичной для каждого образца. Данные, полученные с помощью программы Sedfit, представлены в нижеприведенных результатах. DcDt является независимой от модели программой, распределения коэффициента седиментации g(s*), которая использует производную по времени профиля распределения концентрации. Если не наблюдается сдвига к более высоким значениям S по мере увеличения концентрации, то это свидетельство того, что не происходит обратимых реакций (т.е. мономер, димер, гексамер). Если размер и форма изменяются при разведении (превращение из гексамера в димер в мономер), то невозможно дать оценку молекулярному весу, но полезная информация может быть получена с помощью программы Sedfit по коэффициенту седиментации S(w). Кроме того, эта программа создает прямую граничную модель для индивидуального набора данных, используя модель, основанную на численном решении уравнения Ламма.³ Она графически представляет зависимость непрерывного коэффициента седиментации с(s) от коэффициента седиментации (s) для построения кривых, которые описывают относительные размеры оседающих молекул.

Разбавление каждого вида инсулина инсулин-специфичным разбавителем:

А. RHI

RHI был подвергнут анализу методом ультрацентрифугирования для определения скорости седиментации. Заданная концентрация стокового раствора составляла 3,745 мг/мл. Разбавитель имел характеристики как описано выше.

Нижеперечисленные физические константы были вычислены из аминокислотного состава белка, используя программу Sednterp.⁵

RHI: MW_seq = 5792 Да. N₂₀°=0,726 мл/г

Вычисленные значения плотности и вязкости разбавителя составляли 1,00231 г/мл и 0,01041 пуаз при 20°С, соответственно, используя Sednterp.

Результаты

На Фигуре 9А представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации RHI^TM. Данные, представленные для нормированного графика c(s), согласуются с данными g(s*) из DcDt+. Наблюдается значительный сдвиг к более низким значениям S седиментации при увеличении концентрации.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице.

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 3,05 0,168 2 3,00 0,561 3 3,00 1,678 4 2,84 3,624

Выводы:

Проведенные анализы указывают на то, что RHI в условиях эксперимента существует преимущественно в виде гексамера. Существует небольшое количество вещества с более медленной седиментацией, присутствующего в образцах с более низкой концентрацией, а также того, что, по-видимому, является димерами гексамера.

В. IL

Материалы и методы, как описано выше.

Результаты

Фигура 9В представляет собой график средневзвешенных коэффициентов седиментации для каждой концентрации. Белок диссоциирует при разведении. Кроме того, предполагают наличие небольшого количества (<5%) соединения с более быстрой седиментацией, которое, по-видимому, является димером гексамера.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице.

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 2,78 0,151 2 3,02 0,558 3 3,09 1,755 4 3,10 3,595

Выводы:

Проведенные анализы указывают на то, что IL, в условиях эксперимента, существует преимущественно в виде гексамера. Существуют данные о диссоциации IL при разведении, и существует небольшое количество того, что, по-видимому, является димерами присутствующих гексамеров. Значения исследуемых концентраций составляли приблизительно 30 мкМ, 100 мкМ, 300 мкМ и 600 мкМ (мономерные звенья).

С. IA

Материалы и методы, как описано выше.

Результаты

На Фигуре 9С представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации. Данные, представленные для нормированного графика c(s), согласуются с данными g(s*) из DcDt+. Кривые c(s) при низких концентрациях демонстрируют вклад соединения меньшего размера (мономера), количество которого уменьшается с увеличением концентрации. Также существует небольшой сдвиг к более низким значениям S седиментации с увеличением концентрации. Предполагают наличие небольшого количества (<5%) соединения с более быстрой седиментацией, которое, по-видимому, является димером гексамера.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице.

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 2,72 0,158 2 3,05 0,561

3 3,19 1,655 4 3,14 3,563

Выводы:

Проведенные анализы указывают на то, что IA, в условиях эксперимента, существует преимущественно в виде гексамера. Существуют данные о диссоциации IA при разведении, и существует небольшое количество того, что, по-видимому, является димерами присутствующих гексамеров. Значения исследуемых концентраций составляли приблизительно 30 мкМ, 100 мкМ, 300 мкМ и 600 мкМ (мономерные звенья).

D. CE 100-4

Материалы и методы, как описано выше.

Результаты

Базы данных для СЕ 100-4 были проанализированы, используя Sedfit и модель с(s). Строго говоря, эта модель применима только к невзаимодействующим смесям, но в случае взаимодействующих соединений она, тем не менее, может всё же давать представление о том, какие соединения присутствуют в растворе. На Фигуре 9D представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации. График c(s) согласуется с данными g(s*) из DcDt+ в том, что существует значительный сдвиг в направлении более низких значений S при разведении. Графики c(s) из более высоких концентраций отчетливо демонстрируют, что CE 100-4 может быть большего размера, чем гексамер.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице.

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 1,85 0,153 2 2,41 0,548 3 3,05 1,722 4 3,56 3,484

Выводы:

Проведенные анализы указывают на то, что образец белка, СЕ 100-4, в условиях данного эксперимента, существует в равновесном состоянии среди мономеров, димеров, гексамеров и, возможно, олигомеров большего размера. Значения исследуемых концентраций составляли приблизительно 30 мкМ, 100 мкМ, 300 мкМ и 600 мкМ (мономерные звенья).

Разведение буфером ECF:

Коммерческие препараты были сначала разведены 1:2 с использованием ECF за исключением СЕ 100-4, который был разведен 1:4. Обработка должна была быть проведена иначе для предотвращения преципитации при прохождении изоэлектрической точки, поскольку она начинает возникать при рН 4. Значение рН других коммерческих инсулинов уже было равно 7, таким образом, начальным разведением было 1:2.

A. RHI

RHI был подвергнут анализу методом ультрацентрифугирования для определения скорости седиментации. Заданная концентрация стокового раствора составляла 1,87 мг/мл после разведения равным объемом прилагаемого ECF.

Нижеприведенные физические константы были вычислены из аминокислотного состава белка, используя программу Sednterp.⁵

RHI: MW_seq = 5792 Да, N₂₀°=0,726 мл/г

Вычисленные значения плотности и вязкости разбавителя составляли 1,00273 г/мл и 0,01043 пуаз при 20°С, соответственно, используя Sednterp.

Схема разведения, используя стоковый раствор, для трех ячеек, примененная в исследовании, представлена в нижеприведенной таблице:

Ячейка# Объем стокового раствора (мкл) Объем буфера (мкл) Расчетная концентрация (мг/мл) 1 45 405 0,19 2 150 300 0,62 3 450 -- 1,87

Sedfit, версия 11.71, была использована с программой по прямому граничному моделированию для индивидуального набора данных, используя модель, основанную на численном решении уравнения Ламма.³

Была вычислена модель непрерывного распределения коэффициента седиментации, с(s). Графики распределения c(s) заостренные по сравнению с другими аналитическими методами, поскольку расширяющие эффекты диффузии удаляют путем использования среднего значения фрикционного коэффициента.

Результаты

На Фигуре 10А представлен график распределений c(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации. Данные, представленные для нормированного графика c(s), согласуются с данными g(s*) из DcDt+. Графики c(s) практически совпадают, но наблюдается небольшой сдвиг к более низким значениям S седиментации с увеличением концентрации.

По-видимому, существует небольшое количество (<1%) вещества с более медленной седиментацией в двух образцах с наименьшими концентрациями и небольшое количество (<3%) соединения с более быстрой седиментацией, которое, вероятно, является димером гексамера. Уменьшение количества соединения с более медленной седиментацией и увеличение количества соединения с более быстрой седиментацией при увеличении концентрации предполагает, что существует лишь очень незначительный сдвиг в самоассоциации RHI в диапазоне исследуемых концентраций.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице:

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 3,25 0,176 2 3,24 0,552 3 3,35 1,721

Выводы:

Проведенные анализы указывают на то, что RHI, в условиях данного эксперимента, существует преимущественно в виде гексамера. Существует очень небольшое количество вещества с более медленной седиментацией, присутствующего в образцах с более низкой концентрацией, а также того, что, по-видимому, является димерами гексамеров. Значения исследуемых концентраций составляли приблизительно 30 мкМ, 100 мкМ и 300 мкМ (мономерные звенья).

IL

Методы, как описано выше.

Результаты

На Фигуре 10В представлен график распределений c(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации. Данные, представленные для нормированного графика c(s), согласуются с данными g(s*) из DcDt+. Кривые c(s) при низкой концентрации показывают существенный вклад соединения меньшего размера (возможно, димера), количество которого снижается с увеличением концентрации. Также существует небольшой сдвиг к более низким значениям S седиментации с увеличением концентрации.

По-видимому, существует небольшое количество (<2%) соединения с более быстрой седиментацией, особенно заметное в двух образцах с более высокой концентрацией.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице:

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 3,17 0,167

2 3,12 0,568 3 3,17 1,820

Выводы:

Проведенные анализы указывают на то, что IL, в условиях данного эксперимента, существуют преимущественно в виде гексамера. Существуют данные о диссоциации IL при разведении, и существует небольшое количество того, что, по-видимому, является димерами присутствующих гексамеров. Значения исследуемых концентраций составляли приблизительно 30 мкМ, 100 мкМ и 300 мкМ (мономерные звенья).

Инсулин аспарт (IA)

Методы, как описано выше.

Результаты

На Фигуре 10С представлен график распределений c(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации. Данные, представленные для нормированного графика c(s), согласуются с данными g(s*) из DcDt+. Кривые c(s) при низких концентрациях показывают небольшое количество соединения меньшего размера (мономера/димера), которое снижается по мере увеличения концентрации. Также существует небольшой сдвиг к более низким значениям S седиментации при увеличении концентрации. На графике отчетливо видно, что белок в незначительной степени диссоциирует при разведении. Кроме того, по-видимому, существует небольшое количество (приблизительно 3% в образце с наибольшей концентрацией) соединения с более быстрой седиментацией, которое может быть димером гексамера.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице:

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 3,10 0,186 2 3,23 0,544 3 3,24 1,848

Выводы:

Проведенные анализы указывают на то, что IA, в условиях эксперимента, существует преимущественно в виде гексамера. Существуют данные о диссоциации IA при разведении, и существует небольшое количество того, что, по-видимому, является димерами присутствующих гексамеров. Значения исследуемых концентраций составляли приблизительно 30 мкМ, 100 мкМ и 300 мкМ (мономерные звенья).

D. CE 100-4

Материалы

Расчетная концентрация стокового раствора составляла 0,936 мг/мл после разведения одного объема раствора тремя объемами прилагаемого ECF.

Метод

Схема разведения, используя стоковый раствор, для четырех ячеек, примененная в исследовании, показана в нижеприведенной таблице:

Ячейка# Объем стокового раствора (мкл) Объем буфера (мкл) Расчетная концентрация (мг/мл) 1 90 360 0,19 2 200 250 0,42 3 450 -- 0,94

Результаты

Набор данных для СЕ 100-4 был проанализирован, используя Sedfit и модель с(s). Строго говоря, эта модель применима только к невзаимодействующим смесям, но в случае взаимодействующих соединений она, тем не менее, может всё же давать представление о том, какие соединения присутствуют в растворе. На Фигуре 10D представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации. График c(s) согласуется с данными g(s*) из DcDt+ в том, что существует значительный сдвиг в направлении более низких значений S при разведении. График c(s) из самой высокой концентрации отчетливо демонстрирует, что CE 100-4 может быть большего размера, чем гексамер.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице.

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 1,61 0,178 2 1,95 0,40 3 3,14 0,84

Проведенные анализы указывают на то, что СЕ 100-4, в условиях данного эксперимента, существует в равновесном состоянии среди мономеров, димеров, гексамеров и, возможно, олигомеров большего размера при наибольшей концентрации. Значения исследуемых концентраций составляли приблизительно 30 мкМ, 70 мкМ и 145 мкМ (мономерные звенья).

Контроли в воде, значения рН которых доведены с помощью HCl рН 2 или NaOH рН 7

Приведенные ниже физические константы были вычислены для аминокислотного состава белка, используя программу Sednterp.⁵

IC-рН7: MW_seq = 5792 Да, N₂₀°=0,726 мл/г

Вычисленные значения плотности и вязкости разбавителя составляли 0,99823 г/мл и 0,01002 пуаз при 20°С, соответственно, используя Sednterp.

Внутренний контроль IC рН 7

Метод

Схема разведения, используя воду с NaOH, рН 7 в качестве разбавителя для четырех ячеек, примененная в исследовании, показана в нижеприведенной таблице:

Ячейка# Объем стокового раствора (мкл) Объем буфера (мкл) Расчетная концентрация (мг/мл) 1 25 475 0,19 2 75 375 0,62 3 250 250 1,87 3 450 -- 3,745

Непрерывное распределение коэффициента седиментации, с(s).

Графики распределения c(s) заостренные по сравнению с другими аналитическими методами, поскольку расширяющие эффекты диффузии удаляют путем использования среднего значения фрикционного коэффициента.

Результаты

Набор данных для IC-рН7 был проанализирован, используя Sedfit и модель с(s). Строго говоря, эта модель применима только к невзаимодействующим смесям, но в случае взаимодействующих соединений она, тем не менее, может всё же давать представление о том, какие соединения присутствуют в растворе. На Фигуре 11 представлен график распределений с(s), нормированных по отношению к загрузочной концентрации. График c(s) согласуется с данными g(s*) из DcDt+ в том, что существует значительный сдвиг в направлении более низких значений S при разведении.

Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, с поправкой на стандартные условия, приведены ниже в таблице.

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 2,43 0,18 2 2,90 0,57 3 3,04 1,74 4 3,10 3,52

Исследования указывают на то, что образец, IC-рН7, в условиях данного эксперимента, существует в равновесном состоянии димер-гексамер в наименьшем разведении со сдвигом в сторону гексамерного состояния при трех наибольших использованных здесь концентрациях. Значения исследуемых концентраций составляли приблизительно 30 мкМ, 100 мкМ, 305 мкМ и 620 мкМ (мономерные звенья).

Внутренний контроль IC рН 2

Метод:

Инсулин был разведен 0,01 Н HCl, как описано выше.

Результаты:

Набор данных для IC-рН2 был проанализирован, используя Sedfit и модель с(s), главным образом, для получения надлежащей оценки загрузочных концентраций. Значения, полученные для средневзвешенного коэффициента седиментации для каждой загрузочной концентрации, довольно хорошо совпадали со значениями, полученными путем использования DcDt+. Таблица значений S_20.w, полученных путем использования Sedfit, приведена ниже.

Ячейка# S(20,w)
(единицы Сведберга) Конц.
(мг/мл) 1 1,26 0,17 2 1,28 0,56 3 1,28 1,77 4 1,28 3,61

Проведенные исследования указывают на то, что IC-pH2, в условиях эксперимента, существует преимущественно в виде соединения одного типа (предположительно мономера инсулина), демонстрируя тенденцию к дальнейшей самоассоциации. Характеристики растворителя были крайне неидеальными из-за отсутствия какого-либо поддерживающего электролита. Значения исследуемых концентраций составляли 30 мкМ, 97 мкМ, 305 мкМ и 620 мкМ (мономерные звенья).

Общие выводы, седиментационный анализ

Оценка молекулярного веса RHI, используя программное обеспечение DcDt, установила, что его молекулярный вес соответствует гексамеру (35,6±1,6 кДа) внутри всего диапазона разведений. Контрольное значение для инсулина рН2, который является стандартом для мономерного инсулина (2,29 нм), имеет значение коэффициента седиментации, равное 1,28 S(20,w), которое оставалось фактически неизменным в пределах серии разведений, подтверждая его мономерное состояние. Контрольный нестабилизированный инсулин, рН 7 при стопроцентной концентрации, является гексамерным, но находится в динамическом равновесии с димерными формами меньшего размера, о чем свидетельствует уменьшение размера при разведении в разбавителе рН 7. IA и IL вначале находятся в диапазоне размеров гексамера и имеют небольшую популяцию мономерных/димерных форм после разведения до 1:16 в ECF. Более высокая доля мономерных/димерных частиц при анализе СЕ 100-4 согласуется с его более быстрым профилем абсорбции.

Пример 10: Определение воздействия на размер инсулина при добавлении лимоннокислого натрия и EDTA к инсулину, рН 7,4

Поскольку подъем значения рН до 7 у CES 100-4 демонстрировал быструю абсорбцию на свиной модели и уменьшение размера с использованием анализатора Malvern, альтернативный метод был создан, чтобы проследить будет ли замена лимонной кислоты на тринатриевый цитрат также работать при рН 7,4.

Материалы и методы

Двунатриевый EDTA (1,8 мг/мл) и тринатриевый цитрат (1,8 мг/мл) были разведены в воде с глицерином (22 мг/мл). Инсулин был добавлен в раствор в концентрации 3,8 мг/мл. Едкий натр был добавлен по каплям, чтобы повысить значение рН до 7,4. Неразведенный материал был затем проанализирован в анализаторе Malvern для определения среднего размера частиц и затем был разведен внеклеточным жидкостным буфером (ECF), определяя размер частиц в каждой точке всей серии разведений.

Результаты

CSE 100-7, содержащий лимоннокислый натрий инсулин рН 7,4, разведенный буфером ECF, сравнивали с лимоннокислой лекарственной формой в кислой и нейтральной среде. Результаты показаны на Фигуре 12. Фигура 12 представляет собой график среднего размера частиц инсулина (нм) как функция разведения для СЕ 100-7 рН 7,5 и CSE 100-7, содержащего лимоннокислый натрий вместо лимонной кислоты, рН 7,4.

Результаты показывают, что быстро диссоциирующий инсулин может быть получен путем смешивания лимоннокислого натрия, EDTA и инсулина в растворе с нейтральным значением рН. Вначале средний размер частиц больше стандартного гексамера, предположительно указывая на то, что данный гексамер диссоциирует и находится в форме слабо связанного мультимера из молекул инсулина. При разведении 1:2 в условиях после инъекции (разведение в ECF) инсулин быстро диссоциирует до меньших единиц, наиболее вероятно димеров инсулина. Новые лекарственные формы ведут себя точно также как лекарственная форма инсулина, содержащая лимонную кислоту/EDTA, вначале приготовленная при рН 4 и затем доведенная до значения рН 7.

Пример 11: Содержащий лимонную кислоту и EDTA Инсулин рН 7 у карликовых свиней, больных сахарным диабетом

Материалы и методы

Инсулин был приготовлен путем смешивания инсулина (3,8 мг/мл), динатриевой EDTA (1,8 мг/мл), лимонной кислоты (1,8 мг/мл), глицерина и м-крезола (3 мг/мл) и доведения значения рН до 4 с помощью HCl. Значение рН раствора затем было поднято до рН 7 путем добавления NaOH. Это привело к быстрому прохождению лекарственной формой изоэлектрической точки инсулина, образуя мутную смесь, которая стала прозрачной при достижении конечного значения рН, равного 7,4. СЕ 100-7 вводили свиньям в качестве прандиального инсулина перед едой.

Шести самцам карликовых свиней, больных сахарным диабетом, (30-50 кг) сначала вводили 0,25 ед/кг изучаемого инсулина, сразу после этого им скармливали 500 гр стандартного корма для свиней. Образцы крови были получены перед кормлением на -30, -20, -10, 0 минуте, затем на 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 240, 300, 360, 420, 480 минуте после введения дозы. Два мл образца крови были собраны через катетер в яремной вене, из которых одна капля была использована для проверки измерения уровня глюкозы, используя стандартный глюкозный стрип-метод, и оставшийся образец был обработан K₂EDTA, и образец плазмы был заморожен для дальнейшего анализа.

Результаты

Фармакокинетический профиль лекарственной формы рН 7 показан на Фигуре 13. Этот крайне скоротечный профиль согласуется с данными, продемонстрированными у пациентов, страдающих сахарных диабетом, в примере 6. Подъем значения рН до 7 у кислой лекарственной формы, содержащей лимонную кислоту и EDTA, был удачно осуществлен у карликовых свиней, больных сахарным диабетом. Это изменение рН привело к образованию лимоннокислого натрия из лимонной кислоты. Следовательно, солевая форма кислой лекарственной формы должна работать также как и кислая форма.

Модификации и вариации настоящего изобретения очевидны специалистам в данной области техники из вышеизложенного описания и предназначены находиться в рамках формулы изобретения.

Группа изобретений относится к медицине и касается лекарственной формы инсулина, включающей инсулин, растворяющий агент и хелатор цинка, где лекарственная форма имеет значение рН между более чем рН 7 и рН 7,6, представляет собой прозрачный водный раствор; инъекционной лекарственной формы инсулина; способа лечения больного сахарным диабетом, включающего инъецирование больного с помощью указанной лекарственной формы. Группа изобретений обеспечивает повышенное накопление и транспорт через эпителиальные клетки по сравнению с инсулином в комбинации с НСl и указанным хелатором цинка. 4 н. и 23 з.п. ф-лы, 11 пр., 13 ил., 3 табл.

1. Лекарственная форма инсулина, включающая инсулин, растворяющий агент и хелатор цинка, где лекарственная форма имеет значение рН между более чем рН 7 и рН 7,6, представляет собой прозрачный водный раствор, причем инсулин имеет повышенное накопление и транспорт через эпителиальные клетки по сравнению с инсулином в комбинации с НСl и указанным хелатором цинка, и где инсулин представляет собой единственный активный агент белковой природы в данной лекарственной форме.

2. Лекарственная форма по п.1, где хелатор цинка выбран из группы, состоящей из этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), этилен-бис(оксиэтилен нитро) тетрауксусной кислоты (EGTA), тринатриевого цитрата (TSC), альгиновой кислоты, альфа-липоевой кислоты, димеркаптоянтарной кислоты (DMSA) и CDTA (1,2-диаминциклогексантетрауксусной кислоты).

3. Лекарственная форма по п.2, где хелатором цинка является этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA).

4. Лекарственная форма по п.1, где растворяющий агент является кислотой, выбранной из группы, состоящей из уксусной кислоты, аскорбиновой кислоты, лимонной кислоты, глутаминовой кислоты, янтарной, аспарагиновой, малеиновой, фумаровой и адипиновой кислоты или их солей, предпочтительно лимонная кислота или цитрат натрия, или соли, выбранной из группы, состоящей из ацетата, аскорбата, цитрата, глутамата, аспартата, сукцината, фумарата, малеата и адипината, и металлов группы I и группы II, предпочтительно натрия или калия, аскорбата, цитрата, глутамата, аспартата, сукцината, фумарата, малеата и адипината.

5. Лекарственная форма по п.4, где растворяющий агент является солью магния.

6. Лекарственная форма по п.1, где рН находится в пределах между 7 и 7,5, предпочтительно где рН составляет приблизительно 7,4.

7. Лекарственная форма по п.1, где лекарственную форму создают повышением значения рН раствора инсулина приблизительно от рН 4 до значения рН между 7 и 7,6.

8. Лекарственная форма по п.1, где инсулин выбран из группы, состоящей из человеческого инсулина, аналогов инсулина и их комбинаций.

9. Лекарственная форма по п.8, где инсулин является рекомбинантным человеческим инсулином.

10. Лекарственная форма по п.1, где инсулин представлен в первом контейнере и, по меньшей мере, один из хелаторов цинка и растворяющих агентов представлен во втором контейнере, содержащем разбавитель.

11. Лекарственная форма по п.1, представленная в виде замороженной фармацевтически приемлемой лекарственной формы для лечения больного сахарным диабетом.

12. Лекарственная форма по п.1, представленная в виде прозрачного водного раствора при 4°С.

13. Инъекционная лекарственная форма инсулина по любому из пп.1-12, включающая инсулин и эффективное количество растворяющего агента и хелатора цинка для применения для повышения накопления и транспорта инсулина через эпителиальные клетки по сравнению с инсулином в комбинации с НС1 и указанным хелатором цинка для лечения больного сахарным диабетом.

14. Лекарственная форма инсулина, включающая инсулин, растворяющий агент и хелатор цинка, где лекарственная форма имеет значение рН между более чем рН 7 и приблизительно рН 7,6, представляет собой прозрачный водный раствор и в которой инсулин имеет повышенный транспорт и абсорбцию через эпителиальные клетки по сравнению с инсулином в комбинации с НСl и указанным хелатором цинка, и где растворяющий агент представляет собой соль.

15. Лекарственная форма по п.14, где хелатор выбран из группы, состоящей из этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), этилен-бис(оксиэтилен нитро) тетрауксусной кислоты (EGTA), тринатриевого цитрата (TSC), альгиновой кислоты, альфа-липоевой кислоты, димеркаптоянтарной кислоты (DMSA), CDTA (1,2-диаминциклогексантетрауксусной кислоты).

16. Лекарственная форма по п.14, где хелатор является этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA).

17. Лекарственная форма по п.14, где растворяющий агент является солью металла Группы I или металлов Группы II, выбранной из группы, состоящей из ацетата, аскорбата, цитрата, глутамата, аспартата, сукцината, фумарата, малеата и адипината.

18. Лекарственная форма по п.17, где металлом Группы 2 является магний.

19. Лекарственная форма по п.17, где растворяющий агент выбран из группы, состоящей из аскорбата, цитрата, глутамата, аспартата, сукцината, фумарата, малеата и адипината натрия или калия.

20. Лекарственная форма по п.17, где растворяющий агент является лимоннокислым натрием.

21. Лекарственная форма по п.14, где значение рН находится в пределах между 7 и 7,5.

22. Лекарственная форма по п.14, где инсулин выбран из группы, состоящей из человеческого инсулина, аналогов инсулина и их комбинаций.

23. Лекарственная форма по п.14, где инсулин является рекомбинантным человеческим инсулином.

24. Лекарственная форма по п.14, где инсулин представлен в первом контейнере и как минимум один из хелаторов и растворяющих агентов представлен во втором контейнере, содержащем разбавитель.

25. Лекарственная форма по п.14, представленная в виде замороженной фармацевтически приемлемой лекарственной формы для лечения больного сахарным диабетом.

26. Лекарственная форма по п.14, представленная в виде прозрачного водного раствора при 4°С.

27. Способ лечения больного сахарным диабетом, включающий инъецирование больного с помощью лекарственной формы, как определено в любом из предшествующих пунктов.