Способ выделения двухферментного биокатализатора для получения нуклеозидов Советский патент 1992 года по МПК C12N9/22 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения ферментов-фосфодиэстеразы и 5 -нуклеотидазы из яда кобры с целью производства с их помощью нуклеозидоз.

Известен способ выделения фосфоди- эстеразы и 5 -нуклеотидазы из яда кобры, осуществляемый путем диализа раствора 1,5 г яда с последующей гель-фильтрацией диализата на колонке (3x117 см) с сефадек- сом G-75 (сверхмелким), при этом диализ идет 18 часов, гель-фильтрация 35 ч (скорость элюции 6,9 мл/час) 1. Выход фосфоди- эстеразы 7%; удельная активность в 2-х ферментном биокатализаторе 5 -нуклеотидазы равна 1350 ед/мг белка, фосфодиэсте- разы - 220 ед/мг белка. Недостатки: невысокий выход лимитирующего фермента - фосфодиэстеразы, длительность процесса.

Целью изобретения является увеличение выхода фосфодиэстеразы и сокращение времени процесса.

Поставленная цель достигается предлагаемым способом выделения двухфермент- ного биокатализатора (фосфодиэстеразы и 5 -нуклеотидазы) из яда кобры, по которому очистку буферного раствора сухого яда кобры проводят методом гель - фильтрации на колонке, заполненной сефадексом в два слоя, причем нижний слой имеет толщину не менее 1 см и состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 40-120 мкм, а верхний - толщиной 8,4-9,4 диаметра колонки, состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 10-40 мкм.

Чертеж поясняет предлагаемый способ.

Отличительные признаки от прототипа:

-гель-фильтрацию проводят без предварительного диализа;

-колонку для гель-фильтрации заполняют гелем на высоту, равную 8.4- 9,4 ее диаметров;

-перед наполнением в колонке предварительно подслаивают тонкую (1 см) поN vi

Ь 00

W

душку из крупного сефадекса G-75 (с диаметром гранул 40-120 мкм).

Предлагаемый способ иллюстрируется примерами.

Пример 1. Выделение фосфодиэсте- разы и 5 -нуклеотидазы проводят при 4-6°С. 1,5 г сухого яда кобры растворяют в 20 мл буфера А (0,05 М трис-сукцинат, рН 5,6) и наносят на колонку К 50/60 (Pharmacia, Швеция), заполненную на 47 см (1:9,4) сефа- дексом G-75 (сверхмелким), наслоенным на 1 см подушку из сефадекса G-75 с диаметром гранул 40-120 мкм, уравновешенную буфером А. Элюцию осуществляют буфером А со скоростью 24 мл/час. Во фракциях, собираемых каждые 15 мин,, определяют активность фосфодиэетеразы и 5 -нукле- отизады по методу (1). Фракции 32-39, содержащие элюирующиеся совместно фосфодиэстеразу и 5 -нуклеотидазу, объе- диняют(объем 48 мл), измеряют в них содержание ферментов и белка (см. таблицу) и концентрируют диализом против 50% глицерина или лиофилизуют.

.Пример 2. При соблюдении условий примера 1 заполняют на 42 см (1:8,4). Выход целевых объектов аналогичен примеру 1.

Пример 3. При уменьшении высоты заполнения до 41 см (1:8,2) и соблюдении других условий по примеру 1 снижается степень очистки ферментов на 10 %.

Пример 4. При увеличении высоты до 48 см (1:9,6) выход ферментов снижается на 5 %, степень очистки сохраняется аналогично примеру 1.

Пример 5. При соблюдении условий примера 1 подушку наслаивают толщиной 1.5 см. Результаты аналогичны примеру 1.

Пример 6. Декарибоадениловую кислоту (рА)10 инкубировали с двухфермен- тным биокатализатором, выделенным из яда кобры, как описано в примере 1. Реакцию проводили в объеме 0,5 мл при комнатной температуре, в течение 5 мин.

Концентрации компонентов полученной реакционной смеси: (рА)ю - 5,0

ав2бо/мл; трис-НОбуфера (рН 8,5) - 0,1 М, MgCIa - 5 мМ, биокатализатора - 8,9 мкг/мл. Реакцию останавливали кипячением реакционной смеси в течение 2 мин. Пробу

анализировали методом микроколоночной хроматографии (см. чертеж).

Как видно из чертежа, за 5 мин гидроли- зуется 20.7% фосфодиэфирных связей субстрата (активность фосфодиэетеразы). За

0 это же время 47,7% рА превращается в А (активность 5 -нуклеотидэзы).

Таким образом, активность содержащейся Ё двухферментном биокатализаторе 5 -нуклеотидазы в 2,3 раза выше активности

5 фосфодиэетеразы, т.е. лимитирующим ферментом является фосфодиэстераза.

Технико-экономические преимущества перед базовым объектом (1). Указанные отличительные признаки в совокупности с из0 вестными обеспечивают: увеличение выхода фосфодизстеразы до 86%, т.е. в 12,3 раза; сокращение времени выделения ферментов с 53 до 10 ч. (т.е. в 5,3 раза); исключена стадия диализа; а скорость элюции при

5 гель-фильтрации увеличивается до 24 мл/ч. Двухферментный биокатализатор содержит в 12,3 рази больше лимитирующего фермен- та-фосфодиэстеразы, что позволяет гидро- лизовать до нуклеозидов е 12,3 раза больше РНК (ДНК).

Ф о р м у л а л з о б р е т е н и я Способ выделения двухферментного биокат лизатора для получения нуклеози5 дов, включающий очистку буферного раствора сухого яда кобры, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода по активности, очистку проводят методом гельфильтрации на ко0 лонке, заполненной сефадексом в два слоя, причем нижний слой имеет толщину не менее 1 см и состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 40-120 мкм, а верхний слой толщиной 8,4-9,4 от диаметра колонки

5 состоит из сефадекса G-75 с размером частиц 10-40 мкм.

Использование: биохимия, очистка белков. Сущность изобретения: очистку лиофи- лизата яда кобры осуществляют методом колоночной гель-фильтрации на сефадексе G-75, упакованном в два слоя - верхний основной слой, состоящий из сефадекса марки сверхмелкий, и нижний вспомогательный слой толщиной не менее 1 см, состоящий из сефадекса с размером частиц 40-120 мкм. 1 табл., 1 фиг.

Выделение ферментов из яда кобры

QO

W.I 91 7:54 0

тг

260м-280мм-

НШ.5 /ЮТШСЕ

ЮО200

тг

iL