Способ получения фосфоэстераз гриба РеNIсILLIUм вRеVI-сомрастUм Советский патент 1988 года по МПК C12N9/16 C12N9/16 C12R1/81 

ю

с

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности, в частности к способу получения фосфоэстераз (кислых фосфомоноэстераз ФМЭ-1 и ФМЭ-П, КФЗ 3.1.3.2, кислой и щелочной рибонуклеаз - КФ.3,1,4.2.2 и 3,1.4.2.3) гриба Penicilliura brevi- compactum, используемых в исследовательской биохимическ ой практике и в медицине.

Цель изобретения - более полное использование сырья за счет одновременного выделения кислой и щелочной рибонуклеаз и фосфомоноэстераз I и II.

Способ заключается в том, что по- лученный fe ходе ферментации фильтрат культуральной жидкости гриба Penicilрируют ультрафильтрацией и диализутот. Проводят хроматографию на КМ-целлюло- зе, концентрирование активных злюатов ультрафильтрацией и гель-хроматографию на гидрофильном геле ЭД-7,5, Разделенные при гель-хроматографии кислую и щелочную рибонуклеазы концентрируют ультрафильтрацией, диализуют. При диализе щелочной РНК-азы выпадают кристаллы. Отдиализованный раствор кислой РНК-азы и кристаллы щелочной РНК-азы лиофильно сушат. Несорбированные на анионообменном

волокне ЦМ-А2 фосфомоноэстеразы концентрируют ультрафильтрацией, диали- зуют и проводят гель-хроматографию на G-100 с целью очистки от примесных белков, мещающих разделению двух

Изобретение относится к микробиологической промьштенности, в частности к способу получения фосфоэсте- раз (кислых фосфомоноэстераз ФМЭ-1 и ФМЭ-11, кислой и щелочной рибонук- леаз) гриба, используемых в исследовательской биохимической практике, в медицине и пищевой промыщленности. С целью более полного использования сырья за счет одновременного выделения кислой и щелочной рибонуклеаз, ФМЭ-1 и ФМЭ-11 фильтрат культуральной жидкости с анионообменного волокна ЦМ-А2, содержащий фосфомоноэстеразы, концентрируют ультрафильтрацией, подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-100 с последующим диализом активных фракций, при хроматографии на КМ-целлюлозе разделяют фракции, со- держащие ФМЭ-1, которая выходит в свободном объеме колонки, и фракции, содержащие ФМЭ-11, элюируемую тем же буфером с возрастающей до 0,6 М концентрацией раствора хлористого нат- . рия; последующее концентрирование ультр афильтрацией осуществляют раздельно для ФМЭ-1 и (ШЭ-11, затем раствор ФМЭ-1 подвергают лиофильной сущ- ке, а раствор ФМЭ-П замораживают. S9 (Л

lium brevi-compactura ВКМ F-2464D под-20 фосфомоноэстераз на ионообменнике

вергают ионообменной хроматографии последовательно на анионите ЭДЭ-10П и анионообменном волокне ЦМ-А2, на котором сорбируются рибонуклеазы, а фосфомоноэстеразы выходят в свобод- ном объеме. Десорбцию рибонуклеаз с волокна проводят трис-ацетатным буферным раствором с возрастающей от О до 0,6 М концентрацией хлористого Натрия. Активные фракции, содержащие рибонуклеазы, нейтрализуют, концентСхема получения Penicilliue brev

Кг,пьтявироааяне гриба Penicil- liun bre i-cDiBpactuiB

Очистка иатнвкого растцора иа анноните ЭДЭ-10П

Вейтралкзация 9люагов 2 н.ПаОН Хроматография на анконите Ш1-А2

ЭЛЮ1ГНЯ РНК-аз 0.5 М Had в О, 1 К ацетатном буфере рН 5

I HeftrpantiaaiUfH 2 а. ЯаОН

I

Концентрация на мембране УАМ- 100ХрокатогрзФия на

1КМ-целлюлозе

Дналкэj

градиентом от О до 1 М Had в 0,01 трис-ацетатном буфере

рН 4.5I

,Концентрирование

ка мембране УАМ-30

j

Гель-яромзторрафия гидрофаны ком геле ЭД-7.5

X л

Элпоуя 0,05 ИЭлюция 0.05 Н

тт яс-НС1 рН 7.5трис-НСг рН 7,5

гриба im

КМцеллюлозе. Активные фракции, содержащие фосфомоноэстеразы, диализуют и подвергают хроматографии на КМ-целлюлозе. Полученные ФМЭ-азу I и ФМЭ-азу II концентрируют ультрафильт- рацией и .соответственйо лиофильно сушат и замораживают, так как ФМЭ-аза II в процессе лиофильной сушки теряет активность.;

Схема получения ферментов гриба Penicillium brevi-compactum следующая

Несорбированные «а волокне фосфомоноэстервяы

Концектрирование яа ультрафильтрате с мекбраной УАМ-100

Диализ Гель-яроилтография иа

Элюция 0,0 трис-ЙС рН 7,5

Диализ

i

Хроматография на КМ-целл о поэе

0,02 н. трис-ацет, буфером рН 4,6, пелес градиентом 0-0,6 М в тон же буфере

Кокцентрярованйе ФНЭ-ат II на мембране УАМ-100

Заиоражнвзлне

Приме p. Исходным посевныт- материалом для получения внеклеточных фосфомоноэстераз служит культура Penicillium brevi-compactum ВКМ F-2464D, растущая на скошенном агаре Засев партий среды производят водной суспензией конидий. Выращивание посевного материала в маточных колбах проводят на качалке, делающей 190 об/мин, при в течение 20- 24 ч на среде следующего состава, %: Глюкоза5

Пептон1

Аммоний серно-

кисльш0,2

Кальций хлористый0,02 Мука соеваяО, 5 Магний серно- кисльш 0.05 Вода дистиллированная До 1 л Полученную культуру в виде густой взвеси мицелия используют для засева питательной среды в ферментере- емкостью 30 л (полезная емкость до 20 л). Объем посевного мицелия для засева ферментера 10% от объема среды возраст 24 ч. Для выращивания посевного инокулята Penicillium brevi-compactum применяется среда того же состава, что и для проведения ферментации в колбах на качалке. Процесс выращивания посевного материала в фер- ментере проводят при следующем режиме: температура 24+1°С; расход воздуха 0,6:1 (л/мин по ротаметру); мешалка 200 об/мин; продолжительность 24 ч.

Полученную культуру в виде густой в.звеси мицелия используют для засева питательной среды в ферментере емкостью 100 л (10% к объему засеваемой среды). Биосинтез фосфоэстераз Peni- cillium brevi-compactum проводится на среде такого же состава, что и дл выращивания посевного материала в ферментере (емкостью 30 л) для выращивания инокулята. Ферментацию ведут при следующих условиях: температура в ферментере 24+1°С; давление 0,2- 0,3; расход воздуха 0,6:1 (л/мин по ротаметру); растворенный кислород поддержива ется около 20%; рН культу ральной жидкости не ниже 3,0; продолжительность ферментации 72 ч.

По окончании ферментации судят по совокупности следующих показателей:

повышение рИ культурплыияЧ жидкости выше 3,0; активность фосфоэстераз максимальная; полное исчерпание углеводов .

Ферментер охлаждают до , куль- туральн то жидкость отфильтровывают, нативный раствор после фильтрации должен удовлетворять след тошим требованиям: температура раствора 6-8°С; рН 3,2-3,6; прозрачный.

70 л нативного раствора пропускаю через колонку с анионитом ЭДЭ-10П со скоростью 100 л/ч. Элюаты нейтралзуют 2 н. NaOH при перемещивании до рН 7,0-7,5 и подают на колонку с ЦМ-А2 волокном со скоростью 100 л/ч. На анионообменном волокне Ш-А2 происходит сорбция РНК-аз, кислые фосфо моноэстеразы проходят через колонку. Десорбцию РНК-аз ведут 0,5 М NaCl в 0,1 н, ацетатном буфере, рН 5,0. Собирают элюаты по 5 л и определяют активность РНК-аз. Активность ферментов определяют по интенсивности поглщения при 260 ммк кислорастворимых продуктов разрущения РНК после ее инкубации с раствором фермента. Активные фракции (30 л) объединяют для дальнейшей очистки и нейтрализуют 2 н. NaOH до рН 6,8-7,2.

Фракции, содержащие фосфомонозсте разы (несвязавпшеся с волокном объемом 70 л подвергают дальнейшей очистке.

Вьиеление РНК-аз.

Активные фракции (30 л) после хроматографии на ЦМ-А2 волокне концентрируют ультрафи-пьтрацией на пленке УА 1-100 до объема 0,5 л и диализуют против 0,01 н. трис-ацетатного буфера рН 4,5 (на 1 л концентрата берется 20 л диализующего раствора). Отдиали- зованный концентрат (0,7 л) наносят на колонку с КМ-целлюлозой (10.120 см со скоростью 100 мл/ч, предварительно уравновешенную 0,01 н. трис-ацетат ным буфером, рН 4,5. Элюцию ферментов с колонки ведут линейным градиентом концентрации NaCl от О до I М, объединенные активные фракции (V 2,4 л) концентрир тат ультрафильтрацией на мембране У М-100 до объема 30 мл и диализуют против 10 л 0,05 н. трис-НС1, рН 7,5. Отдиализованный концентрат (40 мл) наносят на колонку с гидрофильным гелем ЭД-7,5 (10i см), уравновешенную 0,05 М трис- НС1 буфером, рН 7,5.

5140

Активные фракции, содержащие кислую РНК-азу (1,2 л), концентрируют ультрафильтрацией до объема 50 мл, диализ тот против дистиллированной воды, лиофильно сушат. Удельная активность кислой РНК-азы 500 ед/мг, вьгход 51%.

Активные фракции, содержащие щелочную РНК-азу (1,2 л), концентрируют до объема 10 мл, диализугот против 0,01 н. ацетатного буфера, рН 3,5, i при этом щелочная РНК-аза кристалли- ;зуется, кристаллы отделяют центрифу- гированием и лиофильно сушат. Удель- нал активность щелочной РНК-азы 800 ед/мг, выход 37%.

Выделение ФМЭ-аз.

: Фракции, несорбировавшиеся на :ЦМ-А2 волокне, содержащие кислые фос|фомоноэстеразы (70 л), концентрируют |на ультрафильтрате с мембраной УАМ-100 о объема 170 мл и наносят на колонку ;с сефадексом G-100 (7,5x150 см), пред- -|варительно уравновешенную 0,02 н. трис- НС1 буфером, рН 7,5. Хроматографию ведут тем же буфером со скоростью 100 мл/ч. Активные фракции, содержа- .щие фосфомоноэстеразы (250 мл), диа- Лизутот .против 5 л 0,02 н. трис-аце- гатного буфера, рН 4,6 в течение.12ч. ОтдиализованнЫй раствор (270 мл) наносят со скоростью 100 мл/ч на ко- Лонку с КМ-целлюлозой (5x100 см), йредварительно уравновешенную 0,02 н. Трис-ацетатным буфером,- 4,6, колонку г)(ромывают 1,4 л 0,02 М трис-ацетатно- to буфера, рН 4,6, со скоростью iOO мл/ч, затем ведут элюцюо раствором с линейным градиентом концентра- ции NaCl (0-0,6 м) в том же буфере (2,5 л) и с той же скоростью, ФМЭ-аза I выходит с колонки со свободным объемом, а ФМЭ-аза II выходит при градиентной элюции. Фракции, содержащие ФМЭ-азу I (560 мл) и ФМЭ-азу II ) (320 мл), концентрируют ультрафильтрацией на мембране УАМ-100 до 30 и 20 мл соответственно.

Концентрат ФМЭ-азы I лиофильно су- шат и получают 300 мг белого порошка с удельной активностью 800 ед/мг белка. Выход ФМЭ-азы I составляет 45% от общего содержания фосфомонозстераз в культуральной жидкости.

I Концентрат ФМЭ-азы II с удельной активностью 670 ед/мг белка заморажи- и хранят при 20°С. Выход ФМЭ-азы

96

II составляет 10% от содержания фос- фомоноэстераз в исходной культуральной жидкости.

Таким образом, предлагаемьш способ позволяет получать сразу четыре фермента из культуральной жидкости Peni- cillium brevi-compactum после одной ферментации, причем с сохранением высокого выхода и высокой удельной активности ФМЭ-аз по сравнению с указанными в известном способе.

Формула изоб Ьетения

Способ получения фосфозстераз гриба Penicillium brevi-compactum ВКМ F 2464D,предусматривающий культивирование гриба, анионообменную хроматографию культуральной жидкости последовательно на анионите ЭДЭ-ЮП и анионообменном волокне ЦМ-А2, десорбцию рибонуклеаз с волокна трис-аце- татным буферным раствором с возрастающей концентрацией NaCl, хроматографию на гидрофильном геле с получением двух фракций,-концентрирование ультрафильтрацией после каждой стадии хроматографии, диализ и лиофильную сушку фракции, содержащей кислую ри- бонуклеазу, ультрафильтрацию фракции содержащей щелочную рибонуклеазу, и последующую ее кристаллизацию диализом, отличающийся тем, что с целью более полного использования сырья за счет одновременного вьщеления кислой и щелочной рибонуклеаз и фосфомоноэстераз I и II, фильтрат культуральной жидкости с анионообменного волокна ЦМ-А2, содержащий кислые фосфомонозстеразы, концентрируют ультрафильтрацией и подвергают хроматографии на сефадексе G-100 с диализом активных фракций, при последующей хроматографии на КМ- целлюлозе разделяют фракции, содержащие фосфомонозстеразу I, которая выходит в свободном объеме колонки, и фракции, содержащие Фосфомоноэстера- зу II, элюируемую линейным градиентом концентрации хлористого натрия до 0,6 М, последующее концентрирование ультрафильтрацией осуществляют раздельно для фосфомонозстеразы I и фосфомонозстеразы II, затем раствор фосфомоноэстеразы I подвергают лиофиль- ной сушке, а раствор фосфомонозстеразы II замораживают.