СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВМЫШЕЧНОЙ ТКАНИ Советский патент 1974 года по МПК G01N27/26 G01N33/12 

1

Изобретение относится к области биохимии белковых веществ, а именно к способам электрофоретического разделения белков мышечной ткани.

Известен способ электрофоретического разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков мышечной ткани, например, убойных животных, в крахмальном геле, включающий приготовление геля на буферном растворе, содержащем лимонную кислоту, трис и мочевину, и применение электродного буферного раствора, содержащего борную кислоту и гидроокись щелочного металла.

Недостатками известного способа являются низкая разрещающая способность (геля) даже в условиях вертикального электрофореза, длительность процесса разделения, сложность методики приготовления геля.

С целью ускорения процесса и упрощения методики разделения, а также повышения разрешающей способности геля, его готовят на буферном растворе с содержанием 88- 92 об.% смеси 0,0030-0,0035 М лимонной кислоты и 0,013-0,019 М триса, 8-12 об.% смеси 0,015-0,025 М гидроокиси лития и 0,065- 0,080 М борной кислоты, 0,75-4,60 М мочевины, а в качестве гидроокиси щелочного металла, входящей в состав электродного буфера, берут гидроокись лития.

При этом с целью обеспечения возможности разделения саркоплазматических белков гель готовят на буферном растворе, содержащем 0,75-1,50 М мочевины, а для разделения миофибриллярных белков гель готовят на буферном растворе, содержащем 3,2-4,6 М мочевины.

При этом электрофорез в предложенной буферной системе приводит к увеличению разрешающей способности геля и ускорению разделения белков мыщечной ткани, причем методика приготовления геля и проведения электрофореза упрощается в связи с возможностью использования горизонтального электрофореза.

Пример. Гель для разделения саркоплазматических белков готовят следующим образом: к 23 г частично гидролизованного крахмала в литровой колбе добавляют 250 мл буфера (90% смеси 0,0033 М лимонной кислоты, 0,016 М триса и 10% смеси 0,02 М гидроокиси лития и 0,076 М борпой кислоты, 1 М мочевины, рП 8,5) и. нагревая над газовой горелкой при помешивании, доводят до кипения в течение 30-40 сек. после чего удаляют воздух под вакуумом. Полученный продукт заливают в кювету из плексигласа (270x110X6 мм), выдерживают 1,5-2,0 час при комнатной температуре и используют в качестве гелевой пластины при горизонтальном электрофорезе.

Разделение миофибриллярных белков мышечной ткани проводят в гелевой пластине, полученной из 24,5 г частично гидролизованного крахмала и 220 мл буфера, содержащего 4 М мочевины.

3-4 мг исследуемого белка саркоплазмы растворяют в 0,04 мл трис-боратного буфера, содержащего 0,5 М сахарозы. При исследовании миофибриллярных белков используют раствор белка в 8 М мочевине. В раствор белка помещают полоску хроматографической бумаги ватман 3 мм (3X10 мм), которую затем вставляют в гель с прорезанными обычным путем лунками.

Крахмальную пластину покрывают смазанной силиконовым маслом полиэтиленовой пленкой так, чтобы закрыть гель и электродные камеры. Последние устанавливают по обоим концам гелевой пластины и заливают буферным раствором (0,38 М борной кислоты и 0,1 М гидроокиси лития, рН 8,5). Для подключения электродных ванн к блоку питания (типа ЭФА-1) используют платиновые электроды. Разделение проводят при силе тока 30 ма и напряжении 950 в, продолжительность электрофореза 2 час. Протеинограмму окращивают 0,0125%-ным раствором нигрозина в смеси, содержащей этанол, воду и уксусную кислоту (5:4: 1).

Предмет изобретения

1.Способ электрофоретического разделения белков мыщечной ткани, например, убойных животных, в крахмальном геле, включающий приготовление геля на буферном растворе, содержащем лимонную кислоту, трис и мочевину, и применение электродного буферного раствора, содержащего борную кислоту и гидроокись щелочного металла, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и упрощения методики разделения, а также повышения разрешающей способности геля, его готовят на буферном растворе с содержанием 88-92 об.% смеси 0,0030-0,0035 М лимонной кислоты и 0,013-0,019 М триса, 8-12. об.% смеси 0,015-0,025 М гидроокиси лития и 0,065-0,080 М борной кислоты, 0,75-4,60 М мочевины, а в качестве гидроокиси щелочного металла, входящей в состав электродного буферного раствора, берут гидроокись лития.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности разделения белков саркоплазмы, гель готовят на буферном растворе, содержащем 0,75-1,50 М мочевины.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности разделения белков миофибрилл, гель готовят на

буферном растворе, содержащем 3,2-4,6 М мочевины.