КОНСТРУКЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРОДУЦИРОВАНИЯ И СЕКРЕЦИИ ФЕРМЕНТОВ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ КЛЕТОЧНУЮ СТЕНКУ Российский патент 2014 года по МПК C12N9/42 C12N15/74 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данной заявке описаны молекулы, конструкции и способы продуцирования и секреции полипептидов, представляющих интерес, бактериальными клетками-хозяевами. В частности, настоящее изобретение относится к полинуклеиновым кислотам, кодирующим слитый белок, и к их применениям для секреции гетерологичного или гомологичного полипептида, представляющего интерес, бактериальной клеткой-хозяином. Далее изобретение относится к слитым белкам или к их участкам, кодируемым такой полинуклеиновой кислотой, и к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим эту полинуклеиновую кислоту. Далее настоящее изобретение относится к способам продуцирования и секреции гетерологичных или гомологичных полипептидов интересующих белков бактериальными клетками-хозяевами с использованием таких полинуклеиновых кислот и слитых белков.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Секреция гетерологичных белков является широко используемым методом в промышленности. Клетку можно трансформировать нуклеиновой кислотой, кодирующей интересующий гетерологичный белок, чтобы секретировать и посредством этого получить большие количества желаемых белков. Этот метод можно использовать для продуцирования огромного количества белка по сравнению с тем, которое продуцировалось бы естественным путем. Интересующими белками являются белки с широким разнообразием промышленных применений, включая терапевтические и сельскохозяйственные применения, а также применение в продуктах питания, косметике, моющих композициях, кормах для животных и т.д. Таким образом, повышение секреции белков, продуцируемых микроорганизмом, представляет общий интерес.

Достижения в клеточной и молекулярной биологии дали возможность в определенных случаях идентифицировать ген, кодирующий желаемый белок, выделить этот ген, встроить этот ген в клетку-хозяина и экспрессировать встроенный ген в клетке-хозяине для продуцирования желаемого белка. Бактерии интенсивно исследованы в качестве клеток-хозяев. Когда бактерии используют в качестве клеток-хозяев для экспрессии этого гетерологичного гена, часто встречающаяся проблема, однако, состоит в том, что большинство бактериальных экспрессионных систем продуцирует белки внутриклеточно и обычно необходимо разрушать клетки, чтобы обеспечить выделение продуктов.

Эта проблема может быть преодолена за счет того, чтобы бактерии секретировали желаемый белок в ростовую среду. Одним из особенно хорошо документально описанных способов направления секреции белков является использование секреторной сигнальной последовательности. Когда сигнальный пептид сливают с амино-концом гетерологичного белка, он направляет этот гетерологичный белок в секреторный аппарат на клеточной мембране. Затем гетерологичный белок перемещается через мембрану. Необязательно специфичная протеаза, иногда называемая "сигнальной пептидазой" или "лидерной пептидазой", удаляет сигнальный пептид и высвобождает гетерологичный белок.

Перемещение белков в периплазматическое пространство или секреция в их культуральную среду характеризуется рядом параметров. Типично векторы для секреции интересующего белка конструируют таким образом, чтобы расположить ДНК, кодирующую секреторную сигнальную последовательность, в 5'-положении к ДНК, кодирующей интересующий белок. Для повышения секреции можно следовать нескольким подходам: испытание нескольких различных сигнальных последовательностей, мутирование сигнальной последовательности или изменение секреторного биохимического пути внутри хозяина. Однако во многих случаях количество секретируемого гетерологичного белка при использовании только сигнального пептида для обеспечения секреции обычно очень мало и значительное количество гетерологичного белка часто деградирует после того, как он секретирован.

Clostridium является родом грамположительных бактерий, который представлен широким разнообразием штаммов. Бактерии Clostridium являются спорообразующими анаэробными бактериями. Этот род включает сольвентогенные Clostridia, такие как С.acetobutylicum, которые способны преобразовывать различные сахара и полисахариды в кислоты и растворители, и целлюлолитические Clostridia, такие как Clostridium cellulolyticum, которые способны эффективно расщеплять целлюлозу и родственные полисахариды клеточной стенки растений. Более конкретно, Clostridium cellulolyticum продуцирует и секретирует большие целлюлолитические комплексы, называемые целлюлосомами, которые эффективно расщепляют целлюлозу и родственные полисахариды клеточной стенки растений. Эти комплексы содержат различные ферменты, которые тесно связаны с большим белком, у которого отсутствует ферментативная активность, называемым "скаффолдин". Связывание ферментов на скаффолдине происходит посредством взаимодействия между когезионными модулями на скаффолдине и комплементарными докериновыми доменами на ферментах. Это высокоаффинное взаимодействие между докеринами и скаффолдинами предложено для биотехнологических применений, например очистки рекомбинантного белка (Craig et al. 2005, J. Biotechnol. 121:165-173).

Напротив, С.acetobutylicum, хотя она содержит в своем геноме большой кластер генов, кодирующих целлюлолитические ферменты и скаффолдин, неспособна расти на кристаллической целлюлозе.

Одной из стратегий объединения активности расщепления целлюлозы с продуцированием растворителей в одном организме стало введение генов, кодирующих целлюлосому С.cellulolyticum, в С.acetobutylicum. Mingardon et al. продемонстрировали продуцирование, сборку и секрецию миницеллюлосомы Clostridium acetobutylicum путем совместной экспрессии в ней гена маннаназы Мап5К из Clostridium cellulolyticum с геном cipd, кодирующим укороченный скаффолдин, также из С.cellulolyticum (Mingardon et al. Applied Environm. Microbiol. 2005, vol 71(3): 1215-1222).

Несколько групп исследователей изучило возможность повышения или улучшения целлюлолитической активности целлюлосомных комплексов путем действий с различными модулями, присутствующими в них, и комбинирования различных типов целлюлаз в так называемых "сконструированных целлюлосомах". Было продемонстрировано, что бифункциональные и трифункциональные сконструированные целлюлосомы, которые включают химерный скаффолдин с двумя или тремя когезинами различной специфичности и двумя или тремя целлюлазами, каждая из которых несет докерин, комплементарный одному из когезинов, образуют мультипротеиновый комплекс с усиленной синергической активностью на трудноразлагаемых субстратах, таких как солома (Fierobe et al. 2002, J. Biol. Chem. 277, 49621-19630; Fierobe et al. 2005, J. Biol. Chem. 280(16): 16325-16334). Кроме того, было обнаружено, что такие целлюлосомы могут включать комбинации ферментов бактерий и грибов (Mingardon et al. 2007, Appl. Environm. Microbiol. 73(12):3822-3832). В этих экспериментах целлюлосомы либо продуцировали путем совместной экспрессии векторов, кодирующих различные части целлюлосомы в Clostridium cellulolyticum, которая в природе секретирует эти белки, либо путем смешивания продуцированных рекомбинантным путем и очищенных скаффолдинов и ферментов in vitro.

Mingardon et al. описывают продуцирование "ковалентной целлюлосомы", которая включает в единой полипептидной цепи СВМ вместе с семейством 48 и семейством 9 каталитического модуля. Этот белок был выделен из E. соli, в котором осуществлялась его гиперэкспрессия, путем разрушения клеток в Френч-прессе и очистки рекомбинантного белка с использованием С-концевой His метки. Было обнаружено, что ковалентная целлюлосома значительно менее активна на субстрате Avicel, чем соответствующие гибридные целлюлосомы (Mingardon et al. 2007, Appl. Environm. Microbiol. 73(22): 7138-7149).

Клонирование гетерологичных или гомологичных генов, кодирующих секретируемые белки, и (сверх)продуцирование и секреция таких гетерологичных или гомологичных белков бактериальными клетками, такими как виды рода Clostridium, иные чем С.cellulolyticum, до сих пор не являются широко описанными, вероятно, в результате проблем, встречающихся при обеспечении секреции рекомбинантных белков этими хозяевами.

В свете вышеизложенного понятно, что в данной области техники существует необходимость в улучшении секреции белков бактериальными клетками.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является разработка подхода к продуцированию и секреции интересующих гетерологичных полипептидов бактериальной клеткой, более конкретно грамположительной бактериальной клеткой, и/или улучшения продуцирования и секреции интересующих гомологичных полипептидов грамположительной бактериальной клеткой, и, в частности, в бактерии Clostridium. В данной заявке также предложены новые молекулы и конструкции, полезные в способах секреции белка, предложенных в данной заявке, и способы получения таких молекул и конструкций.

Настоящая заявка по меньшей мере частично основана на открытии нового способа продуцирования и экспорта интересующего полипептида микроорганизмом, который позволяет избежать по меньшей мере некоторых проблем, связанных с секрецией, которые перечислены выше. Молекулы, конструкции и способы в соответствии с данным изобретением дают возможность (сверх)продуцировать и секретировать интересующие полипептиды бактериальной клеткой. В частности, в настоящем изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, который имеет домен-носитель, который обладает функциональным эффектом на секрецию интересующего слитого полипептида. Более конкретно авторы изобретения показали функциональный эффект домена-носителя слитого белка, то есть способность к контролю (индукции и/или улучшению) (внеклеточной) секреции интересующего гомологичного или гетерологичного полипептида рекомбинантной клеткой-хозяином, продуцирующей этот слитый белок. Этот домен-носитель включает углевод-связывающий модуль (СВМ, carbohydrate binding module) и гидрофильный модуль (модуль X) типично поддерживающего белка и более конкретно в комбинации с сигнальным пептидом секреции, который обеспечивает (улучшенную) секрецию интересующего полипептида. Таким образом, в самом настоящем изобретении предпочтительно также предложено применение по меньшей мере части поддерживающего белка и, в частности, по меньшей мере модулей, включающих СВМ, его гидрофильный модуль, в частности, в комбинации с сигнальным пептидом для контроля секреции в клетке-хозяине интересующего гомологичного или гетерологичного полипептида, слитого с указанной частью поддерживающего белка.

Таким образом, в первом аспекте в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает в данном конкретном порядке:

- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним гидрофильным доменом целлюлосомного поддерживающего белка;

- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом, и

- по меньшей мере один интересующий полипептид.

В конкретной форме осуществления изобретения полинуклеиновая кислота дополнительно включает в рамке считывания нуклеиново-кислотную последовательность для секреции кодируемого слитого белка, и предпочтительно эта нуклеиново-кислотная последовательность кодирует сигнальный пептид целлюлосомного поддерживающего белка.

Соответственно, в изобретении предложены полинуклеиновые кислоты, кодирующие слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает, и более конкретно в данном порядке:

- по меньшей мере один подходящий сигнальный пептид;

- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним Х модулем целлюлосомного поддерживающего белка;

- по меньшей мере один интересующий полипептид, и

- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом.

В конкретных формах осуществления изобретения пептидный линкер содержит сайт расщепления протеазы для отщепления интересующего полипептида от остальной части слитого белка.

В следующих конкретных формах осуществления полипептидная последовательность включает два или более чем два Х модуля, более конкретно два Х модуля.

В другом аспекте изобретение направлено на применение домена-носителя, как определено в данной заявке, более конкретно в комбинации с сигнальным пептидом, для контроля секреции интересующего полипептида, предпочтительно полипептида, как определено в данной заявке, клеткой-хозяином.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением. Предпочтительно предложен вектор, где полинуклеиновая кислота находится под контролем регуляторных последовательностей для экспрессии нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке.

Еще в одном другом аспекте в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая полинуклеиновую кислоту или вектор согласно изобретению.

Соответственно, конкретные формы осуществления изобретения относятся к рекомбинантным микроорганизмам, содержащим полинуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает, более конкретно в данном порядке: (1) по меньшей мере один сигнальный пептид; (2) домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) типа СВМ целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним Х модулем целлюлосомного поддерживающего белка; (3) по меньшей мере один интересующий полипептид и (4) по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом. Микроорганизмы по изобретению характеризуются тем, что они секретируют интересующий полипептид.

В следующих конкретных формах осуществления предложены микроорганизмы, где полинуклеиновая кислота кодирует полипептидную последовательность, которая включает два или более чем два модуля X.

В конкретных формах осуществления предложены микроорганизмы, где полипептидная последовательность включает сигнальный пептид, который представляет собой сигнальный пептид целлюлосомного поддерживающего белка. Наиболее конкретно этот сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum или сигнальный пептид поддерживающего белка CipA С.acetobutylicum.

В конкретных формах осуществления предложены микроорганизмы, где полипептидная последовательность включает по меньшей мере один углерод-связывающий модуль, который представляет собой углерод-связывающий модуль типа 3а (СВМ3а).

В конкретных формах осуществления предложены микроорганизмы, где полипептидная последовательность включает по меньшей мере один модуль X, который представляет собой модуль Х2 поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum или модуль Х2 поддерживающего белка CipA С.acetobutylicum.

Более конкретно клетки-хозяева, предложенные в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой грамположительные бактерии, более конкретно члены класса Clostridia. В следующих конкретных формах осуществления микроорганизмы в соответствии с изобретением представляют собой микроорганизмы из штамма Clostridium, выбранного из группы, включающей С.acetobutylicum и С.beijerinckii.

Микроорганизмы в соответствии с изобретением могут содержать одну или более чем одну нуклеиновую кислоту, где каждая нуклеиновая кислота содержит последовательность, кодирующую один или более чем один интересующий полипептид.

Еще в одном другом аспекте в изобретении предложен слитый белок, кодируемый полинуклеиновой кислотой по изобретению. Кроме того, в изобретении также предложен слитый белок, который слит с сигнальным пептидом, как определено в данной заявке.

Далее настоящее изобретение относится к способу редуцирования и секреции клеткой-хозяином, более конкретно бактериальной клеткой-хозяином, еще более конкретно клеткой-хозяином Clostridium, наиболее конкретно клеткой-хозяином нецеллюлолитических Clostridium, по меньшей мере одного интересующего гетерологичного или гомологичного полипептида в биологически активной форме, включающему введение в клетку-хозяина полинуклеиновой кислоты или вектора в соответствии с изобретением в условиях, эффективных, чтобы вызвать экспрессию кодируемого слитого белка, где кодируемый слитый белок секретируется клеткой-хозяином в окружающую среду этой клетки-хозяина. Во время секреции сигнальный пептид необязательно отщепляется от слитого белка. Интересующий полипептид необязательно одновременно или дополнительно отщепляется от домена-носителя.

Соответственно, в конкретных формах осуществления в изобретении предложены способы продуцирования и секреции рекомбинантным микроорганизмом по меньшей мере одного интересующего гетерологичного или гомологичного полипептида, включающие введение в микроорганизм полинуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает, более конкретно в данной порядке (1), по меньшей мере один сигнальный пептид; (2) домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) типа СВМ целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним Х модулем целлюлосомного поддерживающего белка; (3) по меньшей мере один интересующий полипептид и (4) по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом в условиях, эффективных, чтобы вызвать экспрессию кодируемого слитого белка, где кодируемый слитый белок секретируется рекомбинантным микроорганизмом в окружающую среду этого рекомбинантного микроорганизма.

Следующий аспект изобретения включает применение полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для продуцирования и секреции интересующего полипептида в биологически активной форме.

В конкретных формах осуществления различных аспектов изобретения интересующие полипептиды включают фермент, такой как фермент, расщепляющий клеточную стенку растений, и предпочтительно целлюлазу. Наиболее конкретно фермент представляет собой целлюлазу С.cellulolyticum, такую как Cel48F или Cel9G. Дополнительно или альтернативно интересующий полипептид включает целлюлазу CelH S. degradans штамма 2-40.

В другой форме осуществления интересующие полипептиды в соответствии с изобретением могут включать терапевтический белок. Такой терапевтический белок может представлять собой, но не ограничен им, белок, выбранный из группы, включающей терапевтические ферменты, цитокины и антитела и предпочтительно цитокины, такие как IL-2 или TNFα.

Еще в одном другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения рака, содержащей одно из полинуклеиновой кислоты, слитого белка, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Более конкретно фармацевтическая композиция содержит клетку-хозяина, более конкретно клетку-хозяина Clostridium, экспрессирующую полинуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением.

Далее изобретение относится к полинуклеиновой кислоте, слитому белку, вектору или клетке-хозяину в соответствии с изобретением для применения в качестве лекарства.

Кроме того, изобретение направлено на полинуклеиновую кислоту, слитый белок, вектор или клетку-хозяина в соответствии с изобретением для лечения рака.

В следующем аспекте в изобретении предложены способы лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение этому субъекту полинуклеиновой кислоты, слитого белка, вектора или клетки-хозяина либо фармацевтической композиции в соответствии с изобретением и предпочтительно включающие инъекцию полинуклеиновой кислоты, слитого белка, вектора или клетки-хозяина либо фармацевтической композиции в сайт опухоли этого субъекта. Более конкретно в изобретении предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение этому субъекту клетки-хозяина, экспрессирующей полинуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, необязательно эту клетку-хозяина инъецируют в сайт опухоли субъекта.

Дополнительные аспекты настоящего изобретения будут очевидны в свете подробного описания, которое следует далее.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1 представляет собой схематическое представление различных конструкций в соответствии с конкретными формами осуществления изобретения. Эти конструкции включают интересующий полипептид (целлюлазу Cel48F или Cel9G), слитый с доменом-носителем и сигнальным пептидом. Домен-носитель включает углевод-связывающий модуль (СВМ3а) из целлюлосомного поддерживающего белка, слитый с одним или с двумя гидрофильными доменами (Хc или Ха), имеющими происхождение из того же или другого целлюлосомного поддерживающего белка (белков). На фиг.1 дополнительно показана секреция этих конструкций С.acetobutylicum.

Фиг.2 представляет собой схематическое представление различных конструкций в соответствии с конкретными формами осуществления изобретения. Эти конструкции включают интересующий полипептид (целлюлазу "Сеl5Н"), слитый с доменом-носителем и сигнальной последовательностью. Домен-носитель включает углевод-связывающий модуль (СВМ3а) из целлюлосомного поддерживающего белка, слитый с одним или с двумя модулями Х (Ха). Целлюлаза Сеl5Н содержит домен семейства 5 гликозидгидролазы ("5"), полисериновый линкер ("sss"), домен углевод-связывающего модуля семейства 6 ("б"), участок, обогащенный глутаминовой кислотой - пролином ("eppv"), и С-концевой домен, идентифицированный авторами настоящего изобретения как предполагаемый углевод-связывающий модуль ("DZ").

На фиг.3 продемонстрирована секреция Се15Н дикого типа и Сеl5Н, слитой с доменом-носителем, по сравнению с контрольным штаммом. Домен-носитель включает углевод-связывающий модуль (СВМ3а) из целлюлосомного поддерживающего белка, слитый с двумя гидрофильными доменами (Ха). Активность надосадочной жидкости культуры измеряли на растворимом субстрате пара-нитрофенилцеллобиозе.

На фиг.4 продемонстрирована активность различных белков, включающих слитые белки в соответствии с конкретными формами осуществления изобретения, на целлюлозе: активность белков, включающих CelQG, на кристаллической целлюлозе Avicel по сравнению с Cel9G дикого типа. Подписи являются такими же, как на фиг.1.

На фиг.5 продемонстрирована активность различных белков, включающих слитые белки в соответствии с конкретными формами осуществления изобретения, на различных субстратах, представляющих собой целлюлозные полимеры; (а) активность белков, включающих Сеl5Н, на растворимом субстрате пара-нитрофенилцеллобиозе; Сеl5Н дикого типа (сплошная линия), слитый белок с одним модулем Х (СВМ-Ха-5Н; точечная линия), слитый белок с двумя модулями Х (СВМ-Ха-Ха-5Н, пунктирная линия); (б) активность белков, включающих Се15Н, на кристаллической целлюлозе Avicel.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Общие определения

Как используют в данной заявке, формы единственного числа включают объекты как единственного, так и множественного числа, если контекст явно не требует иного. Например, "клетка" относится к одной или более чем одной клетке.

Термины "содержащий", "содержит" и "состоящий из", как используют в данной заявке, являются синонимами "включающий", "включает" или "входящий", "входит" и являются включающими или не исчерпывающими и не исключающими дополнительные не указанные члены, элементы или стадии способа.

Термин "примерно", как используют в данной заявке при ссылке на измеримую величину, такую как параметр, количество, продолжительность времени и тому подобное, подразумевают как включающий вариации ±20% или менее, предпочтительно ±10% или менее, более предпочтительно ±5% или менее, даже более предпочтительно ±1% или менее и еще более предпочтительно ±0,1% или менее от указанной величины, если такие вариации пригодны для осуществления в раскрытом изобретении.

Указание численных интервалов конечными точками включает все числа и дроби, включенные в этот интервал, а также указанные конечные точки.

Все документы, цитируемые в настоящем описании, полностью включены в данную заявку посредством ссылки. В частности, положения всех документов в данной заявке конкретно относятся к включенным посредством ссылки.

Настоящее изобретение в целом направлено на полинуклеиновые кислоты, конструкции, молекулы и способы продуцирования и секреции полипептидов клетками-хозяевами.

В данном контексте термин "секреция" относится к внеклеточной доставке интересующего полипептида, то есть к доставке вне клетки-хозяина. В частности, это означает, что интересующий полипептид высвобождается или накапливается вне клетки-хозяина и, например, в "окружающей среде", где растет или находится эта клетка-хозяин. В том же контексте перемещение относится к доставке интересующего полипептида в периплазматическое пространство.

Термины "полипептид" и "белок" в данной заявке используют взаимозаменяемо и в целом относят к полимеру аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, и не ограничивают минимальной длиной продукта. Таким образом, пептиды, олигопептиды, полипептиды, димеры (гетеро- и гомо-), мультимеры (гетеро- и гомо-) и тому подобное включены в это определение. Этим определением охвачены как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Эти термины также включают модификации полипептида после экспрессии, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.д. Кроме того, для целей настоящего изобретения эти термины также относят к модификациям, которые включают делеции, добавления и замены (например, консервативные по природе), в последовательности нативного белка или полипептида.

Термин "пептид", как используют в данной заявке, предпочтительно относится к полипептиду, как используют в данной заявке, состоящему по существу из ≤50 аминокислот, например ≤45 аминокислот, предпочтительно ≤40 аминокислот, например ≤35 аминокислот, более предпочтительно ≤30 последовательных аминокислот, например ≤25, ≤20, ≤15, ≤10 или ≤5 аминокислот.

Как используют в данной заявке, термин "гетерологичный полипептид" относится к полипептиду, который в природе не встречается в клетке-хозяине. Термин "гомологичный полипептид" относится к полипептиду, нативному или встречающемуся в природе в клетке-хозяине. В одной форме осуществления изобретение включает клетки-хозяева, продуцирующие гомологичный полипептид посредством технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантный белок относится к любому белку, кодируемому полинуклеиновой кислотой, которая введена в хозяина.

Термины "полинуклеиновая кислота" и "нуклеиновая кислота" в данной заявке используют взаимозаменяемо и в целом относят к полимеру любой длины, состоящему по существу из нуклеотидов, например дезоксирибонуклеотидов и/или рибонуклеотидов. Нуклеиновые кислоты могут содержать пуриновые и/или пиримидиновые основания, и/или другие природные, химически или биохимически модифицированные (например, метилированные), неприродные или производные нуклеотидные основания. Структура нуклеиновых кислот может включать сахара и фосфатные группы, которые можно типично обнаружить в ДНК или РНК, и/или один или более чем один модифицированный или замещенный (такой, как 2'-O-алкилированный, например 2'-O-метилированный или 2'-О-этилированный; либо 2'-O,4'-С-алкинилированный, например, 2'-O,4'-С-этилированный) сахар или одну или более чем одну модифицированную или замещенную фосфатную группу. Например, структурные аналоги нуклеиновых кислот могут включать фосфодиэфирные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, метилфосфонатные, фосфорамидатные, алкилфосфотриэфирные, сульфаматные, 3'-тиоацеталевые, метиленовые (метилимино), 3'-N-карбаматные, морфолинокарбаматные и пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК).

Термин "полинуклеиновая кислота" более конкретно включает ДНК, РНК и гибридные молекулы ДНК/РНК, конкретно включающие ПпРНК, пре-мРНК, мРНК, кДНК, геномную ДНК, ген, продукты амплификации, олигонуклеотиды и синтетические (например, химически синтезированные) ДНК, РНК или гибриды ДНК/РНК. Термины "рибонуклеиновая кислота" и "РНК", как используют в данной заявке, означают полимер любой длины, состоящий из рибонуклеотидов. Термины "дезоксирибонуклеиновая кислота" и "ДНК", как используют в данной заявке, означают полимер любой длины, состоящий из дезоксирибонуклеотидов. Термин "гибрид ДНК/РНК", как используют в данной заявке, означают полимер любой длины, состоящий из одного или более чем одного из дезоксирибонуклеотидов и одного или более чем одного из рибонуклеотидов.

Нуклеиновая кислота может быть встречающейся в природе, например присутствующей или выделенной из природы, может быть рекомбинантной, то есть полученной посредством технологии рекомбинантных ДНК, и/или может быть частично или полностью химически или биохимически синтезированной. Нуклеиновая кислота может быть двунитевой, частично двунитевой или однонитевой. Где нуклеиновая кислота является однонитевой, она может представлять собой смысловую нить или антисмысловую нить. Кроме того, нуклеиновая кислота может быть кольцевой или линейной.

Термин "олигонуклеотид", как используют в данной заявке, обозначает однонитевые нуклеиновые кислоты (нуклеотидные мультимеры) более чем 2 нуклеотида в длину и предпочтительно вплоть до 200 нуклеотидов в длину, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 100 нуклеотидов в длину, даже более предпочтительно от примерно 12 до примерно 50 нуклеотидов в длину. Олигонуклеотиды могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области техники, например путем химического или биохимического синтеза, например твердофазного фосфорамидитного химического синтеза, либо путем экспрессии in vitro или in vivo с рекомбинантных молекул нуклеиновой кислоты, например бактериальных или ретровирусных векторов.

Как используют в данной заявке, "рекомбинантная нуклеиновая кислота" представляет собой молекулу, где молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует интересующий полипептид, модифицирована in vitro, так что ее последовательность не является встречающейся в природе или соответствует встречающимся в природе последовательностям, которые не расположены так, как были бы расположены в геноме, который не модифицирован.

Термин "сигнальная последовательность", или "секреторная сигнальная последовательность", или "секреторный сигнальный пептид" или "сигнальный пептид" означает полипептид, который в виде компонента полипептида большего размера направляет этот полипептид большего размера через секреторный биохимический путь клетки-хозяина, в которой он синтезируется. Полипептид большего размера обычно расщепляется с удалением секреторного сигнального пептида в процессе прохождения через секреторный биохимический путь. Таким образом, когда сигнальный пептид слит с амино-концом гетерологичного белка, он направляет этот белок в секреторный аппарат клетки-хозяина. Затем гетерологичный белок перемещается через мембрану, и специфичная протеаза, иногда называемая "сигнальной пептидазой", удаляет сигнальный пептид и высвобождает белок, в настоящем случае слитый белок в соответствии с изобретением.

Термин "целлюлосомный поддерживающий белок" или "скаффолдин", как используют в данной заявке, следует относить к поддерживающему белку, содержащемуся в целлюлосоме. "Целлюлосомы" представляют собой внеклеточные мультиферментные комплексы, которые присутствуют у некоторых целлюлолитических микроорганизмов и содержат множественные копии ферментов, требуемых для расщепления углеводов. В частности, целлюлосомы состоят из поддерживающего белка, который присоединен к различным целлюлазам, гемицеллюлазам и пектиназам, которые действуют синергически по расщеплению комплексных молекул клеточной стенки, этот комплекс дает возможность организмам очень эффективно расщеплять клеточные стенки растений. Эти поддерживающие белки приводят в контакт различные другие белки в биохимическом пути передачи сигнала и дают возможность их взаимодействия.

Термин "сайт расщепления протеазы" или "последовательность-мишень протеазы", которая содержится внутри последовательности полипептидного линкера, как определено в данной заявке, относится к аминокислотной последовательности, которая может распознаваться специфичными протеазами. Расщепление в этом сайте приводит в результате к высвобождению интересующего полипептида. Следует отметить, что линкерный полипептид может представлять собой любой синтетический полипептид, содержащий сайт расщепления протеазы, если расщепление в этом сайте приводит в результате к удалению оставшихся доменов из интересующего полипептида. Подходящие последовательности-мишени протеазы, которые можно использовать в полинуклеиновых кислотах, кодирующих слитые белки, как описано в данной заявке, включают, но не ограничены ими, последовательности, которые могут распознаваться сериновыми протеазами, такими как плазмин, тромбин, фактор Ха или трипсин.

Как используют в данной заявке, термин "домен-носитель" или "модуль-носитель" следует относить к полипептидной последовательности, с которой может быть слит функциональный домен в соответствии с настоящим изобретением. Термин "функциональный домен" или "функциональный модуль" используют в данной заявке для отнесения к полипептидной последовательности, содержащей интересующий полипептид, который должен продуцироваться и секретироваться в соответствии с настоящим изобретением. Слияние между этим доменом-носителем и функциональным доменом можно осуществить посредством линкерного модуля.

Выражение "по меньшей мере один" в контексте настоящего изобретения означает по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть и т.д. и вплоть до по меньшей мере десяти, а также включает один.

2. Нуклеотидные последовательности

В первом аспекте изобретение относится к полинуклеиновой кислоте, кодирующей слитый белок для облегчения продуцирования и секреции интересующего полипептида клеткой-хозяином, предпочтительно бактериальной клеткой-хозяином, а также к ее различным применениям. Конкретно обнаружено, что полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, как определено в данной заявке, дает возможность эффективного продуцирования полипептидов клеткой-хозяином и их внеклеточной доставки.

В конкретных формах осуществления в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает:

- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним модулем Х или гидрофильным модулем целлюлосомного поддерживающего белка;

- по меньшей мере один интересующий полипептид, и

- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом.

В следующих конкретных формах осуществления в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает:

- подходящий секреторный сигнальный пептид;

- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним модулем Х или гидрофильным модулем целлюлосомного поддерживающего белка;

- по меньшей мере один интересующий полипептид, и

- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом.

В конкретных формах осуществления в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает:

i) по меньшей мере один подходящий секреторный сигнальный пептид,

ii) по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка,

iii) по меньшей мере один модуль Х или гидрофильный модуль целлюлосомного поддерживающего белка, который слит с СВМ (ii),

iv) по меньшей мере один интересующий полипептид,

v) по меньшей мере один пептидный линкер для связывания модуля Х или гидрофильного модуля (ii) с интересующим полипептидом (iv).

Полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, как описано в данной заявке, таким образом в конкретных формах осуществления содержит в рамке считывания нуклеиново-кислотную секреторную последовательность для направления кодируемого слитого белка из клетки-хозяина. Секреция таким образом может приводить в результате к присутствию или накоплению продукта, то есть полноразмерного слитого белка (например, СВМ-Х-фермент) в окружающей среде, например в культуральной среде, содержащей клетку-хозяина.

Таким образом, в более конкретной форме осуществления в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает:

- подходящий секреторный сигнальный пептид,

- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним модулем Х или гидрофильным модулем целлюлосомного поддерживающего белка;

- по меньшей мере один интересующий полипептид, и

- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом.

Наиболее конкретно последовательности расположены в том порядке, в котором они перечислены выше.

Более конкретно в изобретении предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает:

i) по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка,

ii) по меньшей мере один модуль Х или гидрофильный модуль целлюлосомного поддерживающего белка, который слит с СВМ (i),

iii) по меньшей мере один сигнальный пептид, например сигнальный пептид из бактериального поддерживающего белка,

iv) по меньшей мере один интересующий полипептид,

v) по меньшей мере один пептидный линкер для связывания модуля Х или гидрофильного модуля (ii) с интересующим полипептидом (iv).

Соответственно, в изобретении предложены последовательности полинуклеиновой кислоты, включающие индивидуальные последовательности, кодирующие каждый из модулей, описанных выше, оперативно сцепленных, более конкретно ковалентно связанных, так что экспрессия этих последовательностей полинуклеиновой кислоты приводит в результате к слитому белку, как описано в данной заявке.

Подходящие нуклеиново-кислотные последовательности секреторных сигнальных последовательностей, которые можно использовать в полинуклеиновых кислотах, кодирующих слитые белки, как описано здесь, описаны в другом месте данной заявки и включают, но не ограничены ими, сигнальный пептид целлюлосомного поддерживающего белка, такой как, например, сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum ATCC 35319 (банк генов U40345) или сигнальный пептид поддерживающего белка CipA С.acetobutylicum ATCC 824 (банк генов АЕ007606 или АЕ001437).

В конкретных формах осуществления слитый белок, как определено в данной заявке, может расщепляться во время секреции, так что секреция приводит в результате к присутствию или накоплению интересующего полипептида в окружающей среде, например в культуральной среде, содержащей клетку-хозяина. С этой целью слитые белки по изобретению могут быть также сконструированы таким образом, что содержат сайт расщепления, чтобы способствовать выделению белка. Поэтому в конкретных формах осуществления изобретения предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, как описано в данной заявке, пептидный линкер которого содержит сайт расщепления протеазы.

3. Слитый белок

В другом аспекте настоящее изобретение относится к слитому белку, который кодируется полинуклеиновой кислотой в соответствии с изобретением.

Настоящий слитый белок может быть также обозначен как химерный белок. "Слияние" относится к соединению вместе полинуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий полипептид, и полинуклеиновой кислоты, кодирующей домен-носитель, содержащий один или более чем один модуль, в рамке считывания. Экспрессия соединенных полинуклеиновых кислот приводит в результате к химерному белку, также названному здесь далее "слитым белком". Слитый белок по настоящему изобретению может содержать ферментативный или химический сайт расщепления выше и предпочтительно по соседству с N-концом интересующего полипептида и/или ферментативный или химический сайт расщепления ниже и предпочтительно по соседству с С-концом домена, представленного выше интересующего полипептида, обеспечивая за счет этого средства выделения интересующего полипептида из слитого белка посредством использования расщепляющего агента.

Как правило, слитый белок в соответствии с изобретением состоит из полипептидной последовательности, которая включает:

- домен-носитель, который предпочтительно содержит по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним гидрофильным доменом целлюлосомного поддерживающего белка; и

- функциональный домен, который содержит по меньшей мере один интересующий полипептид.

Более конкретно слитый белок в соответствии с изобретением состоит из полипептидной последовательности, которая включает:

- последовательность подходящего сигнального пептида,

- домен-носитель, который предпочтительно содержит по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним гидрофильным доменом целлюлосомного поддерживающего белка; и

- функциональный домен, который содержит по меньшей мере один интересующий полипептид.

Домен-носитель связан с функциональным доменом посредством линкерного модуля.

Кроме того, следует отметить, что в соответствии с конкретными формами осуществления настоящего изобретения слитый белок представляет собой белковую конструкцию, которая отщеплена от сигнального пептида и, следовательно, более не включает сигнальный пептид. В этих формах осуществления сигнальный пептид, который слит со слитым белком, отщепляется от этого слитого белка во время секреции. Необязательно в случае, когда полипептидный линкер, упомянутый выше, содержит сайт расщепления протеазы, интересующий полипептид может быть дополнительно отщеплен от остальной части слитого белка под действием подходящей протеазы (протеаз), которая способна распознавать этот сайт расщепления протеазы и расщеплять полипептидную последовательность в этом сайте. Соответственно, термин "слитый белок", как используют в данной заявке, может относиться либо к полипептидной последовательности, которая синтезируется внутри клетки (то есть содержащей сигнальную последовательность), либо после секреции, где сигнальная последовательность необязательно высвобождена или отщеплена от нее.

Цель продуцирования интересующих полипептидов в форме слитых белков в соответствии с изобретением состоит в обеспечении или повышении секреции интересующего полипептида.

В конкретных формах осуществления слитый белок по настоящему изобретению обладает конкретными улучшенными свойствами, такими как, например, повышенная активность по сравнению с изолированным интересующим полипептидом. Например, в конкретных формах осуществления, например, где интересующий полипептид представляет собой фермент, присутствие одного или более чем одного углевод-связывающего модуля и/или одного или более чем одного гидрофильного модуля в слитом белке может повысить активность фермента по сравнению с изолированным ферментом. Соответственно, в конкретных формах осуществления изобретение относится к слитым белкам, содержащим домен-носитель в соответствии с изобретением, обладающий улучшенными свойствами по сравнению с интересующим полипептидом.

В альтернативных конкретных формах осуществления активность слитого белка является подобной или сниженной по сравнению с нативным полипептидом.

Отдельные модули, содержащиеся в настоящем слитом белке и его частях, такие как домен-носитель и функциональный домен, как определено в данной заявке, более подробно обсуждены здесь ниже.

А. Углевод-связывающий модуль

Первый модуль в домене-носителе или в слитом белке в соответствии с изобретением включает углевод-связывающий модуль.

Термины "углевод-связывающий модуль", "углевод-связывающая молекула", "углевод-связывающий белок" и "углевод-связывающий домен" используют в данной заявке как синонимы и относят к белку или его существенной части или гомологу, который способен к связыванию полисахаридного субстрата, такого как, например, целлюлоза. Углевод-связывающие модули (СВМ) являются функционально независимыми модулями, часто находящимися в природе в ассоциации с белками, вовлеченными в разрушение биомассы. Эти модули определяют как последовательности аминокислот, присутствующие в ферментах, которые действуют на углеводы, проявляющие трехмерную структуру и углевод-связывающую способность. Углевод-связывающие модули предпочтительно включают углевод-связывающие модули целлюлосомных поддерживающих белков.

Термин "его существенные части" в данном контексте относится к частям углевод-связывающих модулей, которые способны к связыванию углеводов.

Термин "гомолог" углевод-связывающего белка, как используют в данной заявке, относится к белку, который имеет аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 30% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% идентичности, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности с функциональным участком аминокислотной последовательности углевод-связывающего белка. Должно быть понятно, что вместо % "идентичности", можно также использовать соответствующий % "подобия" для определения гомологов в соответствии с изобретением.

В конкретной форме осуществления домен-носитель или слитый белок в соответствии с изобретением содержит углевод-связывающий модуль из целлюлосомного поддерживающего белка, как определено выше. В следующих конкретных формах осуществления домен-носитель содержит углевод-связывающий модуль из фермента, но который подобен углевод-связывающему модулю из целлюлосомного поддерживающего белка (например, СВМ3b)

В следующих конкретных формах осуществления домен-носитель или слитый белок в соответствии с изобретением содержит углевод-связывающий модуль, который представляет собой модуль СВМ3, то есть углевод-связывающий модуль типа 3. Углевод-связывающие модули классифицированы более чем на 40 семейств в соответствии с гомологией последовательности. Несколько целлюлолитических ферментов имеют общую консервативную область примерно из 150 аминокислотных остатков, домен СВМЗ. Домен СВМ3 классифицирован на три различных подтипа, названных семейством IIIa, IIIb и IIIc. В предпочтительной форме осуществления домен-носитель или слитый белок в соответствии с изобретением содержит углевод-связывающий модуль, который представляет собой модуль СВМ3 типа IIIa или IIIb. В следующих конкретных формах осуществления домен-носитель или слитый белок в соответствии с изобретением содержит углевод-связывающий модуль, который представляет собой модуль СВМЗ типа IIIa. Углевод-связывающие модули семейства IIIa связываются с кристаллической целлюлозой.

Конкретные примеры углевод-связывающих модулей, содержащихся в домене-носителе или слитом белке в соответствии с изобретением, включают, но не ограничены ими, углевод-связывающие модули целлюлосомных поддерживающих белков, выбранных из группы, включающей целлюлосомный интегративный белок A (CipA) Clostridium thermocellum (банк генов Х67406 или Х67506), целлюлосомный интегративный белок С (CipC) Clostridum cellulolyticum (банк генов U40345), целлюлозосвязывающий белок A (CbpA) Clostridum cellulovorans (банк генов М73817) и целлюлосомный интегративный белок А (CipA) Clostridium acetobutylicum (банк генов АЕ007606 или АЕ001437).

Конкретным примером углевод-связывающего модуля, содержащегося в домене-носителе или в слитом белке в соответствии с изобретением, является углевод-связывающий модуль поддерживающего белка CipC Clostridium cellulolyticum (банк генов U40345). Целлюлосома С.cellulolyticum организована вокруг поддерживающего белка CipC, который дает возможность связывания различных целлюлосомных ферментов посредством взаимодействий доменов докерина-когезина.

В конкретной форме осуществления углевод-связывающий модуль включает гомологи углевод-связывающего модуля поддерживающего белка CipC Clostridium cellulolyticum. Таким образом, в соответствии со следующей формой осуществления изобретение также относится к домену-носителю или к слитому белку, как обсуждено выше, где по меньшей мере один углевод-связывающий модуль содержит полипептид, обладающий по меньшей мере 30% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% идентичности, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности с углевод-связывающим модулем поддерживающего белка CipC Clostridium cellulolyticum. Должно быть понятно, что вместо % "идентичности" также можно использовать соответствующий % "подобия" для определения гомологов в соответствии с изобретением.

В. Модуль Х

Другой модуль слитого белка в соответствии с изобретением включает по меньшей мере один модуль X, более конкретно гидрофильный модуль и предпочтительно гидрофильный модуль целлюлосомного поддерживающего белка.

Термины "гидрофильный домен", "гидрофильный модуль" и "модуль X" используют в данной заявке как синонимы и относят к гидрофильному домену целлюлосомного поддерживающего белка. В конкретных формах осуществления Х-модуль представляет собой Х-модуль целлюлосомного поддерживающего белка мезофильных Clostridium.

Таким образом, в конкретных формах осуществления модуль X, содержащийся в слитом белке в соответствии с изобретением, имеет бактериальное происхождение, предпочтительно из бактерий рода Clostridia, более конкретно мезофильных Clostridia, например из Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium josui или Clostridium cellulovorans. Следует отметить, что на модули X, обнаруженные в С.acetobutylicum, С.cellulolyticum, С.cellulovorans, С.josui, могут ссылаться как на модули "Х2", тогда как модули X, обнаруженные в С.thermocellum, могут называть модулями "Х1".

Конкретные примеры модулей X, содержащихся в домене-носителе или в слитом белке в соответствии с изобретением, включают, но не ограничены ими, гидрофильные домены целлюлосомных поддерживающих белков, выбранных из группы, включающей целлюлосомный интегративный белок A (CipA) Clostridium thermocellum (банк генов Х67406 или Х67506), целлюлосомный интегративный белок С (CipC) Clostridum cellulolyticum (банк генов U40345), целлюлозосвязывающий белок A (CbpA) Clostridum cellulovorans (банк генов М73817), целлюлосомный интегративный белок A (CipA) Clostridium josui (банк генов АВ004845) и целлюлосомный интегративный белок A (CipA) Clostridium acetobutylicum (банк генов АЕ007606 или АЕ001437).

Конкретным примером модуля X, содержащегося в домене-носителе или в слитом белке в соответствии с изобретением, является модуль Х2 поддерживающего белка CipC Clostridium cellulolyticum (банк генов U40345).

Другим особенно предпочтительным примером модуля X, содержащегося в домене-носителе или в слитом белке в соответствии с изобретением, является модуль Х2 поддерживающего белка CipA Clostridium acetobutylicum (банк генов АЕ007606 или АЕ001437).

В следующих формах осуществления Х-модуль представляет собой модуль, гомологичный модулям X, описанным в данной заявке.

В конкретных формах осуществления модуль Х представляет собой гомолог гидрофильного модуля поддерживающего белка CipC Clostridium cellulolyticum или поддерживающего белка CipA Clostridium acetobutylicum. Таким образом, в соответствии со следующей формой осуществления изобретения также относится к слитым белкам, нуклеиново-кислотным последовательностям, кодирующим их, и клеткам-хозяевам, более конкретно рекомбинантным микроорганизмам, как обсуждено выше, где по меньшей мере один модуль Х содержит полипептид, обладающий по меньшей мере 30% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% идентичности, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% идентичности с гидрофильным модулем поддерживающего белка CipC Clostridium cellulolyticum или поддерживающего белка CipA Clostridium acetobutylicum. Должно быть понятно, что вместо % "идентичности" также можно использовать соответствующий % "подобия" для определения гомологов в соответствии с изобретением.

Кроме того, следует отметить, что в соответствии с настоящим изобретением модуль СВМ и модуль X, применяемые в домене-носителе или в слитом белке в соответствии с изобретением, могут иметь происхождение от одного и того же или от различных целлюлосомных поддерживающих белков.

В одной конкретной форме осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеиновой кислоте, кодирующей слитый белок, имеющий домен-носитель, содержащий углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый с одним модулем Х того же или другого целлюлосомного поддерживающего белка. В другой конкретной форме осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеиновой кислоте, кодирующей слитый белок, имеющий домен-носитель, содержащий углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый с двумя одинаковыми или с двумя различными модулями Х одного и того же или различных целлюлосомных поддерживающих белков.

В конкретных формах осуществления слитый белок содержит два модуля X, три модуля Х или четыре или более четырех модулей X. Они могут быть локализованы в слитом белке по соседству друг с другом или разделены одним или более чем одним другим модулем слитого белка.

С. Сигнальный пептид

В конкретных формах осуществления слитый белок, содержащий домен-носитель, обеспечивающий секрецию интересующего полипептида в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно содержит последовательность, кодирующую секреторную сигнальную последовательность. В конструкциях в соответствии с этими формами осуществления изобретения эти секреторные сигнальные последовательности сцеплены с одной из других последовательностей конструкции, то есть либо с последовательностью, кодирующей домен СВМ или модуль X, либо с последовательностью, кодирующей интересующий полипептид, так что сигнальная последовательность и интересующий полипептид оперативно сцеплены, более конкретно ковалентно связаны. В этом контексте "оперативно сцепленный" означает, что последовательность, кодирующая сигнальную последовательность, и последовательность, кодирующая полипептид, который должен секретироваться, связаны в рамке или в фазе считывания, так что после экспрессии сигнальный пептид способствует секреции полипептида, связанного с ним таким образом.

Должно быть понятно, что подходящие сигнальные последовательности зависят от типа микроорганизма, в котором желательна секреция. Например, различные сигнальные последовательности могут требоваться в различных грамположительных бактериях. В качестве примера, но не ограничения, секреция в грамположительных бактериях и, в частности, в Clostridium, таких как С.acetobutylicum, может быть достигнута с использованием сигнальной последовательности полипептида-предшественника Се15А С.cellulolyticum (примерная последовательность: Genbank №доступа ААА51444. seq версия 1, проверенная 31 октября 1994), или предшественника поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum (примерная последовательность: Genbank № доступа ААС28899. seq. версия 2, проверенная 5 декабря 2005), или предшественника поддерживающего белка CipA С.acetobutylicum (примерная последовательность: Genbank №доступа ААК78886. seq. версия 1, проверенная 19 января 2006).

Также должно быть понятно, что можно использовать нативные (или гомологичные, эндогенные) сигнальные пептиды полипептидов, которые должны экспрессироваться микроорганизмами, как заявлено в данной заявке, насколько они могут быть функциональными в данных микроорганизмах. Следовательно, в качестве примера, секреция Cel48F или Cel9G Clostridium cellulolyticum может быть достигнута, используя поддерживающий белок CipC С.cellulolyticum. Подобным образом секреция Се15Н или родственных полипептидов в гетерологичном организме может быть достигнута, используя эндогенную или гомологичную секреторную сигнальную последовательность полипептида-предшественника Сеl5Н.

D. Интересующий полипептид

Настоящий слитый белок или его функциональный домен в соответствии с изобретением далее содержит интересующий белок, который должен продуцироваться и секретироваться конструкциями и способами, которые предложены в данной заявке. Белок, который продуцируется и секретируется хозяином, предпочтительно бактериальным, как определено в данной заявке, может представлять собой любой интересующий белок. В предпочтительной форме осуществления он представляет собой гетерологичный белок, то есть гетерологичный по отношению к хозяину. Альтернативно белок является гомологичным.

Термины "интересующий полипептид" и "интересующий белок" используют в данной заявке как синонимы и относят к белку, который продуцируется и секретируется клеткой-хозяином, как определено в данной заявке.

Настоящее изобретение не ограничено типом или функцией интересующего полипептида, который можно продуцировать и секретировать в соответствии с настоящим изобретением. Природа интересующего белка определена применением нуклеиновых кислот и клеток-хозяев, содержащих их.

В одной форме осуществления интересующий полипептид представляет собой фермент, предпочтительно выбранный из группы, включающей, но не ограниченной ими, протеазы, редуктазы, липазы, киназы, фосфатазы, оксидазы и карбогидразы.

Например, интересующий полипептид представляет собой фермент, выбранный из группы, включающей, но не ограниченной ими, трансферазы (ЕС.2), изомеразы (ЕС.5), оксидоредуктазы (ЕС.1), включающие, но не ограниченные ими, ферменты группы ЕС 1.10.3, включая лакказу, или пероксидазы (ЕС 1.11.1), включая лигниназу и лигнинпероксидазу, и гидролазы (ЕС.3), включающие, но не ограниченные ими, гидролазы эфиров карбоновых кислот (ЕС 3.1.1), включая гемицеллюлазу, и гликозидазы (ЕС 3.2.1), включая эндоглюканазы, экзоглюканазы, альфа-амилазу, глюкоамилазу, пектиназу, эндоглюкозидазу Н, целлюлазу, целлюбиогидролазу и эндопроцессивную целлюлазу.

В конкретных формах осуществления интересующий полипептид представляет собой фермент, расщепляющий клеточную стенку растений. Секреция таких ферментов микроорганизмами представляет интерес в контексте расщепления растительного материала, например в контексте получения биотоплива. Термин "ферменты, расщепляющие клеточную стенку растений" используют в данной заявке как относящийся к ферментам, которые катализируют расщепление целлюлозных или лигноцеллюлозных материалов и включают, но не ограничены ими, целлюлазы, гемицеллюлазы, лакказы, целлобиогидролазы и другие ферменты, вовлеченные в распад целлюлозы и гемицеллюлозы до простых сахаров, таких как глюкоза, ксилоза, арабиноза, манноза и галактоза.

В конкретной форме осуществления полипептид представляет собой целлюлазу. Этот термин включает процессивные и непроцессивные целлюлазы. Процессивная целлюлаза продолжает взаимодействовать с одной полисахаридной нитью, непроцессивная целлюлаза взаимодействует один раз, затем отделяется и присоединяется к другой полисахаридной нити. Однозначно, но не исключительно, в термин целлюлазы включают те ферменты, которые входят в классификацию ферментов под заголовком ферменты ЕС 3.2.1.4, также называемые β-1,4-эндоглюканазами, которые расщепляют β-1,4-гликозидные связи статистически вдоль цепи целлюлозы, ферменты ЕС 3.2.1.91, также называемые целлобиогидролазами или экзоглюканазами, которые последовательно высвобождают целлобиозу или глюкозу с одного конца цепи целлюлозы, и ферменты ЕС 3.2.1.4/ЕС 3.2.1.91, также называемые эндопроцессивными целлюлазами, которые проявляют смешанный механизм действия (как эндо-, так и экзоглюканазы).

В соответствии с конкретными формами осуществления ферменты, расщепляющие клеточную стенку растений, используемые в настоящем изобретении, имеют происхождение из микроорганизмов, например грибное или бактериальное происхождение, предпочтительно бактериальное происхождение, например из бактерий рода Alteromonadaceae, например Saccharophagus degradans штамм 2-40 рода Thermomonospora, например из Т.fusca рода Cellulomonadaceae, например С.fimi рода Clostridia, например из Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium cellulovorans, Clostridium josui. В другой форме осуществления ферменты, расщепляющие клеточную стенку растений, используемые в настоящем изобретении, имеют грибное происхождение, например из гриба рода Neocallimastigomycota, например из N.patriciarum или Orpinomyces sp. штамм PC-2.

Конкретные примеры целлюлаз, пригодных для применения в слитом белке или его функциональном домене в соответствии с изобретением, включают, но не ограничены ими:

- целлюлазы С.cellulolyticum, выбранные из группы, включающей Cel48F, Cel9G, Cel9R, Cel9P, Cel9E, Cel9H, Cel9J, Cel9M, Cel8C, Cel5N и Се15А;

- целлюлазы С.thermocellum, выбранные из группы, включающей Cel9D, CelQJ, СВН9А, Сеl9Н, Се19К, Сеl5Е, Cel48S, Cel9F, Cel9N, Cel9Q, Cel50, Cel5B, Cel5G, Cel8A, Cel5C и Се191;

- целлюлазы С.acetobutylicum, выбранные из группы, включающей Се148А, Cel9G, Cel9R, Cel9P, Cel9E, Сеl9Н, Cel9J, Cel9M и Сеl5А;

- целлюлазы S. degradans штамм 2-40, выбранные из группы, включающей Сеl9А, Сеl9В, Cel5J, Cel51, Cel5F, Cel5H, Cel5D, Cel5B, Cel9G, Сеl5Е, Сеl5А, Cel5C и Сеl6А.

- предполагаемые целлюлазы из Pseudomonas вида ND 137, такие как Acla.

В следующих конкретных примерах целлюлаза, пригодная для применения в слитом белке или его функциональном домене в соответствии с изобретением, включает целлюлазы Cel48F или Cel9G С.cellulolyticum.

В следующих конкретных примерах целлюлаза, пригодная для применения в слитом белке или его функциональном домене в соответствии с изобретением, включает целлюлазу S. degradans штамм 2-40.

В следующих конкретных формах осуществления интересующий полипептид, который нужно продуцировать и секретировать в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой терапевтический белок. "Терапевтический белок", как используют в данной заявке, относится к белку, пептиду, гликопротеину или гликопептиду, который можно вводить субъекту для лечения заболевания или дисфункции или для улучшения состояния здоровья субъекта. Он включает как молекулы, которые сами проявляют терапевтический эффект, такие молекулы, которые действуют на другую молекулу или объединены с ней для проявления терапевтического эффекта, такие как часть комбинированного лекарства или фермент, преобразующий пролекарство. В конкретных формах осуществления субъект представляет собой животное или человека. В следующей предпочтительной форме осуществления терапевтический белок представляет собой белок человека или белок животного, например, от грызуна, например крыс, мышей. В другой следующей конкретной форме осуществления заболевание или дисфункция включает рак. Соответственно, в конкретных формах осуществления интересующий полипептид представляет собой противоопухолевый агент.

В конкретных формах осуществления терапевтический белок представляет собой активный белок, например, обладает ферментативной активностью или биологической активностью, такой как связывающая активность с лигандом или рецептором, способность к активации биохимического пути внутриклеточного преобразования сигнала или способность вызывать иммунный ответ у млекопитающего, например у человека, терапевтический белок может быть гликозилирован или иначе модифицирован in vitro одной или более чем одной гликозилтрансферазой.

В конкретных формах осуществления интересующий белок для применения в слитом белке или его функциональном домене в соответствии с изобретением представляет собой терапевтический белок, выбранный из группы, включающей терапевтические ферменты, цитокины и антитела (включая все известные формы антигенсвязывающих молекул). Следует отметить, что в соответствии с настоящим изобретением термин антитела также включает "каталитические антитела".

В следующей конкретной форме осуществления терапевтический белок выбран из группы, включающей цитокины, такие как, но не ограниченные ими, IL-2, IL-12, GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), TNF (фактор некроза опухоли)-α и т.д.

Применение терапевтических белков более конкретно рассмотрено для терапевтических применений изобретения, описанных в данной заявке.

В следующих конкретных формах осуществления интересующий полипептид представляет собой диагностический полипептид, такой как антитело. Они могут представлять интерес при диагностическом применении клеток-хозяев по настоящему изобретению.

Е. Линкерный модуль

Слитый белок в соответствии с изобретением типично содержит другой модуль, который состоит по меньшей мере из одного пептидного линкера для связывания домена-носителя белка с функциональным доменом или интересующим полипептидом.

Предпочтительно пептидная последовательность, связывающая углевод-связывающий модуль с гидрофильным модулем, представляет собой последовательность, которая известна в данной области техники и которая может для удобства находиться в целлюлосомных поддерживающих белках.

Пептидный линкер предпочтительно включает полипептид по меньшей мере из 3, предпочтительно по меньшей мере из 4 или 5, наиболее предпочтительно по меньшей мере из 7 и более предпочтительно по меньшей мере из 12 аминокислот. Предпочтительно линкер представляет собой полипептид, содержащий от 3 до 15 аминокислот. Предпочтительно линкер представляет собой полипептид, содержащий незаряженные аминокислоты, такие как глицин, серин, цистеин, аспарагин, тирозин, глутамин, аланин, валин, пролин, треонин, и предпочтительно глицин или серин.

Подходящие примеры линкерных полипептидов включают линкерные полипептиды, находящиеся в бактериальных целлюлосомных поддерживающих белках, таких как, но не ограниченных ими, CipA С.acetobutylicum (AE007606), CipC С.cellulolyticum (U40345), CipA С.thermocellum (X67406 или Х67506), CbpA Clostridum cellulovorans (M73817), CipA Clostridium josui (AB004845).

Как упомянуто выше, пептидный линкер, как определено в данной заявке, может содержать сайт расщепления протеазы. Расщепление в этом сайте приводит в результате к высвобождению интересующего полипептида.

4. Векторы

Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложены экспрессионные конструкции для облегчения введения в клетку-хозяина, предпочтительно в бактериальную клетку, и/или облегчения экспрессии, и/или облегчения сохранения полинуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок в соответствии с изобретением. Экспрессионные конструкции могут быть встроены в плазмиду или вектор, которые могут иметься в продаже.

Под "вектором" подразумевают полинуклеотидную молекулу, предпочтительно молекулу ДНК, имеющую происхождение, например, из плазмиды, бактериофага или вируса растений, в которой может быть встроен или клонирован полинуклеотид. Вектор предпочтительно содержит один или более чем один уникальный сайт рестрикции и может быть способен к автономной репликации в определенной клетке-хозяине либо может интегрировать с геномом определенного хозяина, так что клонированная последовательность является воспроизводимой. Выбор вектора типично зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую нужно вводить вектор.

В соответствии с формой осуществления настоящего изобретения экспрессионная конструкция представляет собой экспрессионный вектор, пригодный для трансформации организмов-хозяев, предпочтительно бактерий, и пригодный для сохранения и экспрессии слитого белка в соответствии с настоящим изобретением в трансформированной клетке-хозяине.

"Экспрессионный вектор" представляет собой конструкцию, которую можно использовать для трансформации выбранной клетки-хозяина и которая обеспечивает экспрессию кодирующей последовательности в выбранном хозяине. Экспрессионные векторы могут представлять собой, например, клонирующие векторы, бинарные векторы или интегративные векторы. Изобретение, таким образом, также относится к вектору, содержащему любую из нуклеиновых кислот, описанных выше. Вектор может дополнительно содержать регуляторные последовательности для контроля экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Особенно полезными в практике данного изобретения являются экспрессионные векторы, которые обеспечивают экспрессию в бактериальных клетках нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, как определено в данной заявке. Как правило, в экспрессию вовлечено использование экспрессионного вектора, который способен эффективно реплицироваться в клетке-хозяине, так что клетка-хозяин накапливает много копий экспрессионного вектора и, в свою очередь, синтезирует высокие уровни желаемого продукта (слитого белка), кодируемого экспрессионным вектором.

Термины "регуляторные последовательности" и "контролирующая последовательность", используемые здесь, следует понимать в широком контексте и относить к регуляторным нуклеиново-кислотным последовательностям, способным к управлению экспрессией и/или к регуляции экспрессии последовательностей, с которыми они лигированы (ковалентно связаны) и/или оперативно сцеплены. Контрольные последовательности различаются в зависимости от предназначенного организма-хозяина и от природы последовательности, которую нужно экспрессировать. Для экспрессии белка в прокариотах контрольные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосомы и терминатор. У эукариот контрольные последовательности обычно включают промоторы, терминаторы и в некоторых случаях энхансеры и/или 5' и 3' нетранслируемые последовательности. Термин 'контрольная последовательность' предназначен для включения как минимум всех компонентов, необходимых для экспрессии, и может также включать дополнительные предпочтительные компоненты. В соответствии с предпочтительной формой осуществления настоящего изобретения контрольная последовательность является оперативной в бактерии, предпочтительно в грамположительной бактерии; предпочтительно контрольная последовательность представляет собой последовательность, имеющую происхождение из грамположительной бактерии. Термин "контрольная последовательность" охватывает промотор или последовательность, способную к активации или усилению экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.

В соответствии с одной формой осуществления настоящего изобретения экспрессионная конструкция представляет собой бактериальный экспрессионный вектор, пригодный для трансформации бактерий и пригодный для сохранения и экспрессии слитого белка в соответствии с настоящим изобретением в трансформированной бактериальной клетке. Изобретение, таким образом, также относится к вектору, содержащему любую из нуклеиновых кислот, описанных выше. Вектор может дополнительно содержать регуляторные последовательности для контроля экспрессии нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке.

Экспрессионные и клонирующие векторы обычно содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и (ковалентно и) оперативно сцеплен с нуклеиновой кислотой, кодирующей интересующий полипептид. Промоторы представляют собой нетранслируемые последовательности, локализованные выше (5') стартового кодона структурного гена (обычно в пределах от примерно 100 до 1000 п.о.), которые контролируют транскрипцию и трансляцию конкретной нуклеиново-кислотной последовательности, такой как последовательность, кодирующая слитый белок, как определено в данной заявке, с которой они оперативно сцеплены. Такие промоторы обычно входят в два класса, индуцибельные и конститутивные. Индуцибельные промоторы представляют собой промоторы, которые инициируют повышенные уровни транскрипции с нуклеиновой кислоты под их контролем в ответ на некоторое изменение в условиях культивирования, например присутствие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. К настоящему времени хорошо известно большое число промоторов, распознаваемых рядом потенциальных клеток-хозяев. Эти промоторы оперативно сцеплены с нуклеиновой кислотой, кодирующей интересующий полипептид, посредством удаления промотора из источника нуклеиновой кислоты в результате расщепления ферментами рестрикции и вставки изолированной промоторной последовательности в вектор. Как встречающуюся в природе промоторную последовательность, так и многие гетерологичные промоторы можно использовать, чтобы управлять амплификацией и/или экспрессией интересующего полипептида. Как правило, плазмидные векторы, содержащие промоторные и контролирующие последовательности, которые имеют происхождение из вида, совместимого с клеткой-хозяином, используют с этими хозяевами. Вектор обычно несет один или более чем один сайт репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечивать фенотипическую селекцию в трансформированных клетках.

Промоторы, подходящие для использования с прокариотическими хозяевами, иллюстративно включают промоторные системы β-лактамазы и лактозы, щелочной фосфатазы, промоторную систему триптофана (trp) и гибридные промоторы, такие как промотор tac. Однако пригодны и другие функциональные бактериальные промоторы. Их нуклеотидные последовательности в целом известны, таким образом давая возможность специалисту в данной области техники оперативно лигировать их с нуклеиновой кислотой, кодирующей секретируемую молекулу белка, как определено в данной заявке, используя линкеры или адаптеры для обеспечения любых необходимых сайтов рестрикции. Для использования промоторов в бактериальных системах последовательность Шайна-Дальгарно должна быть также оперативно сцеплена с нуклеиновой кислотой, кодирующей секретируемую молекулу белка, как определено в данной заявке.

В соответствии с одной формой осуществления изобретения векторы содержат конститутивный промотор. Примеры конститутивных промоторов, подходящих для конструкций и способов в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничены ими, промотор CaMV35S, GOS2, промотор актина, промотор убихитина, промотор тиолазы.

В соответствии с другой формой осуществления изобретения векторы содержат индуцибельный промотор. Примеры индуцибельных промоторов, подходящих для конструкций и способов в соответствии с настоящим изобретением, включают, но не ограничены ими, промотор lac или промотор, индуцируемый ксилозой.

Необязательно настоящие экспрессионные векторы также будут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК, и могут, следовательно, содержать одну или более чем одну последовательность терминации транскрипции. Термин "последовательность терминации транскрипции" охватывает контролирующую последовательность на конце транскрипционной единицы, которая передает сигнал 3' процессинга и терминации транскрипции. Дополнительные регуляторные элементы, такие как транскрипционные или трансляционные энхансеры, могут быть включены в экспрессионную конструкцию.

Экспрессионные конструкции по изобретению могут дополнительно включать точку начала репликации, которая необходима для сохранения и/или репликации в специфичном типе клеток. Одним из примеров является такой, когда экспрессионная конструкция должна сохраняться в бактериальной клетке в виде эписомного генетического элемента (например, плазмидной или космидной молекулы). Предпочтительные точки начала репликации включают, но не ограничены ими, f1-ori, соlЕ1 ori и точки начала репликации бактерий Gram+.

Экспрессионная конструкция может необязательно содержать селективный маркерный ген. Как используют в данной заявке, термин "селективный маркерный ген" включает любой ген, который придает клетке, в которой он экспрессируется, фенотип для облегчения идентификации и/или селекции клеток, которые трансфицированы или трансформированы экспрессионной конструкцией по изобретению. Подходящие маркеры могут быть выбраны из маркеров, которые придают устойчивость к антибиотикам или гербицидам, или визуальных маркеров. Примеры селективных маркерных генов включают гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу (nptll), гигромицинфосфотрансферазу (hpt) или Basta. Дополнительные примеры подходящих селективных маркерных генов включают гены устойчивости к ампициллину (AmpR), тетрациклину (TcR), канамицину (KanR), фосфинотрицину и хлорамфениколу или триамфениколу (CAT). Другие подходящие маркерные гены обеспечивают метаболический признак, например manA. Визуальные маркерные гены могут быть также использованы и включают, например, бета-глюкуронидазу (GUS), люциферазу и зеленый флуоресцентный белок (GFP).

При конструировании подходящих векторов, содержащих один или более чем один из вышеперечисленных компонентов и включающих желаемые кодирующие и контролирующие последовательности, используют стандартные методы лигирования. Изолированные плазмиды или фрагменты нуклеиновой кислоты расщепляют, подгоняют и повторно лигируют в форме, желаемой для создания необходимых плазмид.

5. Клетки-хозяева

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полинуклеиновую кислоту или вектор, как определено в данной заявке.

Термин "клетка-хозяин" относится к клеткам, способным к росту в культуре и способным к экспрессии полинуклеиновой кислоты, как определено в данной заявке, и, следовательно, способной к продуцированию и секреции слитого белка, как определено в данной заявке. Клетки-хозяева по настоящему изобретению охватывают клеточные культуры in vitro и включают прокариотические клетки. Конкретные формы осуществления относятся к микроорганизмам. Конкретные примеры клеток-хозяев, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают бактериальные клетки.

Следует отметить, что термин "клетка-хозяин" подразумевает включение всех форм жизненного цикла клетки-хозяина, таких как споры.

В конкретных формах осуществления клетки-хозяева, рассматриваемые в контексте изобретения, представляют собой бактериальные клетки, в частности грамположительные бактериальные клетки. Термин "грамположительные бактерии" подразумевает включение этого термина, признанного в данной области техники. Грамположительные бактерии включают, но не ограничены ими, Bacillus, Geobacillus, Clostridium, Streptococcus, Cellulomonas, Corynebacterium, Lactobacillis, Lactococcus, Oenococcus и Eubacterium.

В соответствии с конкретной формой осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой грамположительную бактериальную клетку, являющуюся членом класса Clostridia, более предпочтительно членом рода Clostridium.

Наиболее конкретно рассмотрены штаммы Clostridia, которые поддаются генетическим манипуляциям, такие как, но не ограниченные ими, С.acetobutylicum, С.sporogenes, С.beijerinckii и т.д.

Выбор клетки-хозяина может быть определен рассматриваемым применением. Наиболее конкретно изобретение применимо к штаммам, для которых секреция интересующего полипептида проблематична.

В одной форме осуществления клетка-хозяин является членом группы, включающей сольвентогенные, то есть продуцирующие растворитель, штаммы Clostridia. Особенно предпочтительными клетками-хозяевами в соответствии с данной формой осуществления изобретения являются продуцирующие растворитель штаммы Clostridia, выбранные из группы, включающей С.acetobutylicum, например, С.acetobutylicum штамм АТСС824, и С.beijerinckii, например С.beijerinckii штамм АТСС17778.

В другой форме осуществления клетка-хозяин является членом группы, включающей спорообразующие бактерии, такие как, но не ограниченные ими, бактерии рода Bacillus, Clostridium (более конкретно для терапевтических применений, где введение спор представляет интерес). Особенно предпочтительными клетками-хозяевами в соответствии с данной формой осуществления изобретения являются штаммы Clostridia, выбранные из группы, включающей С.sporogenes, например С.sporogenes штамм DSM767, и С.acetobutylicum, например С.acetobutylicum штамм АТСС824.

Молекулы полинуклеиновой кислоты или векторы в соответствии с изобретением могут быть либо интегрированы в геноме клетки-хозяина, либо могут поддерживаться в некоторой форме экстрахромосомно.

Более конкретно клетки-хозяева могут быть трансформированы экспрессионными векторами по данному изобретению и культивированы в общепринятой питательной среде, модифицированной, как соответствует индукции промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов. "Трансформация" означает введение нуклеиновой кислоты в организм таким образом, что эта нуклеиновая кислота является реплицируемой, либо в виде экстрахромосомного элемента, либо посредством интеграции в хромосому. Способы, используемые в данной заявке для трансформации клеток-хозяев, хорошо известны специалистам в данной области техники. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобное, являются такими, как использованы ранее с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и очевидны обычному специалисту в данной области техники.

6. Способы продуцирования и секреции полипептидов

В другом аспекте настоящая заявка направлена на способ продуцирования и секреции клеткой-хозяином, предпочтительно бактериальной клеткой-хозяином, по меньшей мере одного интересующего гетерологичного или гомологичного полипептида в биологически активной форме, включающий введение в клетку-хозяина полинуклеиновой кислоты или вектора в соответствии с изобретением в условиях, эффективных, чтобы вызвать экспрессию кодируемого слитого белка, где кодируемый слитый белок секретируется клеткой-хозяином в окружающую среду этой клетки-хозяина.

В процессе секреции сигнальный пептид предпочтительно отщепляется от слитого белка, так что слитый белок высвобождается в окружающую среду клетки-хозяина (например, в культуральную среду). В другом аспекте последовательность-мишень протеазы введена в линкер, соединяющий домен-носитель с функциональным доменом, как определено в данной заявке, и интересующий белок отщепляется протеазой (протеазами) с высвобождением в окружающую среду клетки-хозяина интересующего белка, отщепленного от остальной части слитого белка.

Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку-хозяина, как определено выше.

Окружающую среду клетки-хозяина подразумевают как относящуюся к месту, где растет бактерия. В одной форме осуществления окружающая среда бактерии может представлять собой культуральную среду, где растет эта бактерия. В другой форме осуществления окружающая среда бактерии может представлять собой ткань живого организма, например ткань человека или животного, в частности, в случае терапевтических применений, рассмотренных в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение также относится к применению полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для продуцирования и секреции интересующего полипептида в биологически активной форме.

Далее изобретение относится к применению домена-носителя, как определено в данной заявке, для контроля секреции интересующего полипептида, предпочтительно полипептида, как определено в данной заявке. В данном контексте следует отметить, что термин "контроль секреции" подразумевают как охватывающий получение, индукцию и/или улучшение секреции. Более конкретно изобретение направлено на применение домена-носителя, как определено в данной заявке, слитого с сигнальным пептидом, как определено в данной заявке, для контроля секреции интересующего полипептида, предпочтительно полипептида, как определено в данной заявке, клеткой-хозяином.

Под "улучшением секреции" понимают, что для контроля секреции используют количество секретируемого интересующего полипептида выше, предпочтительно по меньшей мере на 2,5, либо на 5, либо на 10% выше, чем количество, полученное в случае отсутствия домена-носителя, слитого с сигнальным пептидом, как определено в данной заявке.

7. Нетерапевтические применения

В одной форме осуществления интересующий полипептид представляет собой фермент, как определено в данной заявке. В такой форме осуществления настоящая заявка направлена на различные нетерапевтические применения слитого белка в соответствии с изобретением.

В одной форме осуществления интересующий полипептид предпочтительно представляет собой фермент, как определено в данной заявке.

В другой форме осуществления интересующий полипептид предпочтительно представляет собой фермент, расщепляющий клеточную стенку растений, как определено в данной заявке, и даже более предпочтительно целлюлазу, как определено в данной заявке.

В более конкретных формах осуществления в изобретении предложено применение полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для продуцирования и секреции фермента, расщепляющего клеточную стенку растений, как определено в данной заявке, и даже более предпочтительно целлюлазы, имеющей происхождение из микроорганизмов, как определено выше, предпочтительно бактериального происхождения, и, например, из бактерий рода Alteromonadaceae, например Saccharophagus degradans штамм 2-40 рода Thermomonospora, например из Т.fusca рода Cellulomonadaceae, например С.fimi рода Clostridia, например из Clostridium thermocellum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium acetobutylicum. В другой форме осуществления целлюлаза имеет грибное происхождение, и, например, из гриба рода Neocallimastigomycota, например из N. patriciarum или Orpinomyces sp штамм PC-2.

Даже более предпочтительно настоящее изобретение относится к применению полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для продуцирования и секреции целлюлазы С.cellulolyticum, С.thermocellum, С.acetobutylicum или Saccharophagus degradans, как определено выше, в биологически активной форме.

В особенно предпочтительной форме осуществления изобретение относится к применению полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для продуцирования и секреции целлюлазы Cel48F С.cellulolyticum.

В особенно предпочтительной форме осуществления изобретение относится к применению полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для продуцирования и секреции целлюлазы Cel9G С.cellulolyticum.

Еще в одной другой особенно предпочтительной форме осуществления изобретение относится к применению полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для продуцирования и секреции целлюлазы Сеl5Н Saccharophagus degradans.

8. Терапевтические применения

Следующий аспект изобретения относится к терапевтическому применению конструкций-носителей и клеток-хозяев, содержащих конструкции-носители в соответствии с настоящим изобретением.

В конкретных формах осуществления интересующий полипептид представляет собой терапевтический белок, как определено в данной заявке. В таких формах осуществления настоящая заявка предпочтительно направлена на различные терапевтические применения слитого белка в соответствии с изобретением.

Показано, что бессосудистые гипоксические/некротические участки в солидных опухолях, которые являются труднодостижимыми при классических терапиях, обеспечивают подходящую окружающую среду для роста и пролиферации облигатных анаэробных бактерий. Более конкретно продемонстрировано, что после внутривенной инъекции споры клостридий распространяются по всему организму, но только те, которые встречаются с гипоксической окружающей средой солидной опухоли, продолжают созревать и размножаться (Mose and Mose, 1964; Carey et al, 1967). Таким образом, споры клостридий являются идеальными носителями для доставки лекарства при раке. Однако основной проблемой, с которой сталкиваются при доставке лекарств посредством клостридий, является уровень секретируемых белков. В настоящем изобретении предложен путь, направленный на эту проблему, обеспечения системы, которая дает возможность секреции слитых белков, содержащих интересующий полипептид, микроорганизмами, такими как Clostridia.

Соответственно, в изобретении предложено применение полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для продуцирования и секреции терапевтического белка, как определено в данной заявке. В конкретных формах осуществления терапевтический белок выбран из группы, включающей терапевтические ферменты, цитокины и антитела.

В соответствии с конкретными формами осуществления настоящее изобретение относится к применению полинуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, включающий терапевтический белок в соответствии с изобретением, и клетки-хозяина, содержащей эту полинуклеиновую кислоту, для продуцирования и секреции цитокинов, более конкретно цитокинов в биологически активной форме, рекомбинантными микроорганизмами.

Более конкретно изобретение относится к применению полинуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, включающий терапевтический белок в соответствии с изобретением, и клетки-хозяина, содержащей эту полинуклеиновую кислоту, для продуцирования и секреции цитокина, выбранного из группы, включающей IL-2, IL-12, GM-CSF и TNF-α, рекомбинантными микроорганизмами.

В следующих формах осуществления терапевтический белок представляет собой фермент, преобразующий пролекарство.

В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина, более конкретно рекомбинантного микроорганизма в соответствии с изобретением и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, то есть, например, один или более чем один фармацевтически приемлемый носитель, представляющий собой вещество и/или добавку, например буферы, носители, эксципиенты, стабилизаторы и т.д. Более конкретно рекомбинантный микроорганизм находится в форме бактериальной споры, наиболее конкретно споры Clostridium.

Термин "терапевтически эффективное количество", как используют в данной заявке, означает то количество полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина (то есть рекомбинантного микроорганизма или его споры), которое вызывает биологический или лечебный ответ в ткани, системе, животном или человеке, который подразумевается исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом.

Термин "фармацевтически приемлемый", как используют в данной заявке, согласован с данной областью техники и означает совместимый с другими ингредиентами фармацевтической композиции и безвредный для его реципиента. Подходящие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны специалистам в данной области техники и, например, могут быть выбраны из белков, таких как коллаген или желатин, углеводов, таких как крахмал, полисахариды, сахара (декстроза, глюкоза и сахароза), производных целлюлозы, таких как натриевая или кальциевая соль карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлоза или гидроксипропилметилцеллюлоза, прежелатинизированных крахмалов, пектинового агара, каррагенана, глин, гидрофильных камедей (аравийской камеди, гуаровой камеди, гуммиарабика и ксантановой камеди), альгиновой кислоты, альгинатов, гиалуроновой кислоты, полимера гликолевой и молочной кислоты, декстрана, пектинов, синтетических полимеров, таких как водорастворимый акриловый полимер или поливинилпирролидон, протеогликанов, фосфата кальция и тому подобного.

Фармацевтические препараты могут также содержать добавки, например наполнители, разрыхлители, связующие вещества, смазывающие агенты, увлажняющие агенты, стабилизаторы, эмульгаторы, диспергирующие агенты, консерванты, подсластители, красители, корригенты, ароматизаторы, загустители, разбавители, буферные вещества, растворители, солюбилизаторы, агенты для достижения депо-эффекта, соли для изменения осмотического давления, агенты покрытия или антиоксиданты.

Применяемая дозировка или количество полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина, как определено в данной заявке, зависит от индивидуального случая, и ее, как обычно, адаптируют к индивидуальным обстоятельствам для достижения оптимального эффекта. Таким образом она зависит от природы и тяжести расстройства, подлежащего лечению, а также от пола, возраста, массы и индивидуальной реактивности человека или животного, подлежащего лечению, от эффективности и продолжительности действия применяемых соединений, от того, является ли терапия острой, хронической или профилактической, или от того, вводят ли другие активные соединения в дополнение к полинуклеиновой кислоте, вектору или клетке-хозяину, как определено в данной заявке.

Получение фармацевтических композиций можно осуществлять способом, который как таковой известен. С этой целью полинуклеиновую кислоту, вектор или клетку-хозяина, как определено в данной заявке, вместе с одним или более чем одним твердым или жидким фармацевтически приемлемым веществом и/или добавкой (или вспомогательным веществом) и, если желательно, в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями, обладающими терапевтическим или профилактическим действием, приводят в соответствующую форму введения или лекарственную форму, которую затем применяют в качестве фармацевтического препарата в медицине.

Фармацевтическую композицию в соответствии с изобретением предпочтительно вводят парентерально, например подкожно, внутримышечно или внутривенно в форме растворов для инъекции или инфузии. Другими подходящими формами введения являются, например, микрокапсулы, имплантаты или штифты.

Подходящими носителями для приготовления растворов, например растворов для инъекции, являются, например, вода, физиологический раствор хлорида натрия, спирты, такие как этанол, глицерин, полиолы, сахароза, инвертный сахар, глюкоза, маннит, растительные масла и т.д. Возможно также лиофилизировать клетку-хозяина, как определено в данной заявке, и применять полученные в результате лиофилизаты, например, для приготовления препаратов для инъекции.

Подходящими носителями для микрокапсул, имплантатов или штифтов являются, например, сополимеры гликолевой кислоты и молочной кислоты.

В особенно предпочтительной форме осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением является инъекционной. Композицию можно, например, вводить (инъецировать) в сайте опухоли. Такое применение обеспечивает доставку продукта, содержащегося в фармацевтической композиции, то есть полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина, как определено в данной заявке, в опухолевые клетки. Доставляемые соединения, например полинуклеиновую кислоту, вектор или клетку-хозяина, как определено в данной заявке, в опухолевые клетки предпочтительно инъецируют один или более чем один раз в неделю в течение месяцев или даже лет.

В другой особенно предпочтительной форме осуществления фармацевтическую композицию в соответствии с изобретением можно доставлять, используя резервуары, такие как, например, микронасосы, с целью доставки продукта, то есть полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина, как определено в данной заявке, в опухоль в клетки ракового типа.

Кроме того, изобретение направлено на полинуклеиновую кислоту, вектор или клетку-хозяина в соответствии с изобретением для применения в качестве лекарства. Иными словами, изобретение также относится к применению полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением в качестве лекарства.

В следующей форме осуществления изобретение относится к полинуклеиновой кислоте, вектору или клетке-хозяину в соответствии с изобретением для лечения рака. Более конкретно изобретение относится к применению полинуклеиновой кислоты, вектора или клетки-хозяина в соответствии с изобретением для получения лекарственного средства для лечения рака.

В примере рекомбинантные бактерии Clostridia, сконструированные, как раскрыто в данной заявке, можно применять для лечения рака, поскольку споры Clostridia способны созревать и развиваться вблизи опухолей.

Различные типы рака можно лечить в соответствии с настоящим изобретением. Изобретение, следовательно, также относится к способу лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающему введение субъекту клетки-хозяина в соответствии с изобретением и предпочтительно в сайте опухоли субъекта. Практически настоящее изобретение, следовательно, включает введение рекомбинантной клетки-хозяина, способной к экспрессии полинуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением, в сайте опухоли субъекта, нуждающегося в этом, и таким образом способной к продуцированию интересующего полипептида в соответствии с изобретением в сайте опухоли у хозяина. В настоящем изобретении таким образом предложена доставка продукта, то есть терапевтического белка, такого как, например, цитокин, содержащегося в полинуклеиновой кислоте, векторе, клетке-хозяине или фармацевтической композиции, как определено в данной заявке, избирательно в опухолевые клетки. На основании того факта, что солидные опухоли на определенной стадии их развития характеризуются тяжелой гипоксией и некрозом, такую систему переноса считают ценной противораковой стратегией. Считают, что такая терапия преодолевает токсичность для нормальных тканей и улучшает уничтожение опухолевых клеток в результате направленной доставки продукта в опухоль.

Изобретение будет более понятно со ссылкой на приведенные ниже неограничивающие примеры.

ПРИМЕРЫ

В практике настоящего изобретения будут использовать, если не указано иное, общепринятые методы, используемые в технологии рекомбинантных ДНК, молекулярной биологии, биологическом тестировании и тому подобном, которые находятся в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Такие методы полно объяснены в литературе.

Пример 1: Секреция гетерологичных и токсичных целлюлаз

Данный пример иллюстрирует секрецию интересующих полипептидов, в частности целлюлаз, С.acetobutylicum в соответствии с настоящим изобретением. Были получены различные конструкции и наиболее релевантные из них схематически представлены на ФИГ. 1.

В первой конструкции полинуклеиновая кислота, кодирующая целлюлазу Cel48F, полученная из С.cellulolyticum, была слита с полинуклеиновой кислотой, кодирующей домен-носитель и содержащей модуль СВМ3а, модуль Х (Хс) и модуль когезина 1 CipC С.cellulolyticum. Эта конструкция дополнительно содержит сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum. Подходящие линкерные последовательности используют для связывания различных модулей друг с другом.

Во второй конструкции полинуклеиновая кислота, кодирующая целлюлазу Cel48F, полученная из С.cellulolyticum, была слита с полинуклеиновой кислотой, кодирующей домен-носитель и содержащей модуль СВМ3а и один модуль Х (Хс) CipC С.cellulolyticum. Эта конструкция дополнительно содержит сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum. Подходящие линкерные последовательности используют для связывания различных модулей друг с другом.

В третьей конструкции полинуклеиновая кислота, кодирующая целлюлазу Cel9G, полученная из С.cellulolyticum, была слита с полинуклеиновой кислотой, кодирующей домен-носитель и содержащей модуль СВМ3а и один модуль Х (Хс) CipC С.cellulolyticum. Эта конструкция дополнительно содержит сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum. Подходящие линкерные последовательности используют для связывания различных модулей друг с другом.

В качестве контролей была получена конструкция, содержащая полинуклеиновую кислоту, кодирующую целлюлазу Cel48F, полученную из С.cellulolyticum, и сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum, но без домена-носителя или модуля X, и другая конструкция, содержащая полинуклеиновую кислоту, кодирующую целлюлазу Cel9G, полученную из С.cellulolyticum, и сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum, слитый с полинуклеиновой кислотой, кодирующей модуль СВМЗа, но без модуля X. Кроме того, были получены подобные конструкции с С-концевым доменом докерина или без него.

Различные конструкции были сконструированы, используя метод ПЦР с перекрывающимися одноцепочечными участками липких концов, и клонированы в челночном экспрессионном векторе pSOS952, который придает устойчивость к антибиотику эритромицину, посредством чего были получены плазмиды pSOS952-CBM-Xc-Cohesin-48F; pSOS952-CBM-Xc-48F и pSOS952-CBM-Xc-9G соответственно. Эти конструкции проверяли секвенированием и метилировали in vivo. Эти метилированные векторы затем использовали для электротрансформации штамма АТТС 824 С.acetobutylicum.

Было показано, что штаммы С.acetobutylicum, несущие первые две конструкции, секретировали слитый белок, содержащий целлюлазу Cel48F, в их ростовую среду в количествах примерно 0,5 мг/л. Кроме того, штаммы С.acetobutylicum, несущие третью конструкцию, также секретировали слитый белок, содержащий целлюлазу Cel9G, в их ростовую среду в количествах примерно 0,5 мг/л. Однако в отсутствие домена-носителя (СВМ + модуль X) конструкции, содержащие только целлюлазу с сигнальной последовательностью, были токсичными для клеток (то есть отсутствовала секреция). Присутствие С-концевого домена докерина не меняло этого.

Эти результаты показывают, что, когда целлюлазы Cel9G или Cel48F сливают с помощью генной инженерии с сигнальной последовательностью и с двумя модулями (СВМ и X) или тремя модулями (СВМ, Х и когезином) скаффолдина CipC из С.cellulolyticum, химерные ферменты продуцируются и секретируются в среду С.acetobutylicum. Выходы секреции сконструированных целлюлаз оценили как примерно 0,3-0,5 мг/л. Эти значения основаны на активности надосадочной жидкости культуры на целлюлозе. Альтернативно концентрацию гетерологичных целлюлаз в надосадочной жидкости культуры также оценивали электрофоретическим анализом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующими денситометрическими анализами.

Присутствие СВМ обладает тем преимуществом, что дает возможность быстрой очистки интересующего белка из надосадочной жидкости культуры на колонке с кристаллической целлюлозой.

Пример 2: Секреция гетерологичной и токсичной целлюлазы в соответствии с изобретением с использованием множественных модулей Х

Данный пример является другим примером, иллюстрирующим секрецию интересующих полипептидов, в частности целлюлаз, С.acetobutylicum в соответствии с настоящим изобретением. Различные конструкции были получены и схематически представлены на ФИГ. 1 (нижняя панель), где использовали модули, полученные из различных поддерживающих белков.

В одной конструкции полинуклеиновая кислота, кодирующая целлюлазу Cel9G, полученная из С.cellulolyticum, была слита с полинуклеиновой кислотой, кодирующей домен-носитель, и содержащая СВМ3а, полученный из белка CipC С.cellulolyticum, и один модуль Х (Ха), полученный из белка CipA С.acetobutylicum. Эта конструкция дополнительно содержит сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum. Подходящие линкерные последовательности используют для связывания различных модулей друг с другом.

В пятой конструкции полинуклеиновая кислота, кодирующая целлюлазу Cel9G, полученная из С.cellulolyticum, была слита с полинуклеиновой кислотой, кодирующей домен-носитель и содержащая СВМ3а, полученный из белка CipC С.cellulolyticum, и первый (Ха) и второй (Ха') модули Х CipA С.acetobutylicum. Эта конструкция дополнительно содержит сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum. Подходящие линкерные последовательности используют для связывания различных модулей друг с другом.

Эти конструкции были сконструированы, используя метод ПЦР с перекрывающимися одноцепочечными участками липких концов, и клонированы в челночном экспрессионном векторе pSOS952, который придает устойчивость к антибиотику эритромицину, посредством чего были получены плазмиды pSOS952-CBM-Xa-9G и pSOS952-CBM-Xa-Xa'-9G соответственно. Эти конструкции проверяли секвенированием и метилировали in vivo и in vitro. Эти метилированные векторы затем использовали для электротрансформации штамма АТТС 824 С.acetobutylicum.

Было показано, что штаммы С.acetobutylicum, несущие эти две конструкции, секретировали слитый белок, содержащий целлюлазу Cel9G, в их ростовую среду в релевантных количествах. Эти результаты также показали, что, когда целлюлаза Cel9G слита генно-инженерным путем с сигнальной последовательностью и с СВМ скаффолдина CipC из С.cellulolyticum и с одним или с двумя модулями Х из CipA С.acetobutylicum, химерные ферменты продуцируются и секретируются в среду С.acetobutylicum. Это показывает, что модули Х из CipA Clostridium acetobutylicum также обладают свойствами носителя в отношении секреции С.acetobutylicum. Авторы изобретения также дополнительно показали, что использование более чем одного модуля Х обладало благоприятными эффектами на секрецию. Выход секреции слитых целлюлаз оценивали как 1,9 и 3,5 мг/л для штаммов, несущих векторы pSOS952-CBM-Xa-9G и pSOS952-CBM-Xa-Xa'-9G соответственно. Концентрацию гетерологичных целлюлаз в надосадочной жидкости культуры также оценивали электрофоретическим анализом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с последующими денситометрическими анализами.

Пример 3. Улучшение секреции гетерологичной целлюлазы в соответствии с изобретением

Данный пример является другим примером, иллюстрирующим секрецию интересующих полипептидов, в частности целлюлазы из Saccharophagus degradans, С.acetobutylicum в соответствии с настоящим изобретением. Различные конструкции были получены и схематически представлены на ФИГ. 2, где использовали модули, полученные из различных поддерживающих белков.

В первой конструкции синтетическая полинуклеиновая кислота, адаптированная к смещению кодонов С.acetobutylicum и кодирующая целлюлазу Се15Н из Saccharophagus degradans, была слита с полинуклеиновой кислотой, кодирующей домен-носитель и содержащей модуль СВМ3а, первый (Ха) и второй (Ха') модули X, полученные из белка CipA С.acetobutylicum, и сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum. Подходящие линкерные последовательности используют для связывания различных модулей друг с другом.

Доменная структура нативного полипептида Се15Н может быть обозначена как GH5-PSL-CBM6-EPR-DZ, где GH5 обозначает домен семейства 5 гликозидгидролаз, PSL полисериновый линкер, СВМ6 домен углевод-связывающего модуля семейства 6, EPR участок, обогащенный глутаминовой кислотой - пролином, и, без ограничения этой интерпретацией, DZ представляет собой С-концевой домен, идентифицированный авторами настоящего изобретения как предполагаемый углевод-связывающий модуль.

Эта конструкция была сконструирована, используя метод ПЦР с перекрывающимися одноцепочечными участками липких концов, и клонирована в челночном экспрессионном векторе pSOS952, который придает устойчивость к антибиотику эритромицину, посредством чего была получена плазмида pSOS952-СВМ-Ха-Ха'-5Н. Эту конструкцию проверяли секвенированием и метилировали in vivo и in vitro. Этот метилированный вектор затем использовали для электротрансформации штамма АТТС 824 С.acetobutylicum.

Секреция С.acetobutylicum белка Се15Н дикого типа с добавлением в конце сигнального пептида скаффолдина CipC из С.cellulolyticum составляла 0,5-0,9 мг/л (значения основаны на активности надосадочной жидкости культуры на пара-нитрофенилцеллобиозиде). Однако штаммы С.acetobutylicum, несущие две конструкции, кодирующие слитый белок, содержащий белок Сеl5Н, сцепленный с доменом-носителем, секретировали слитый белок, содержащий целлюлазу 5Н, в их ростовую среду в значительно более высоких количествах, более конкретно вплоть до 6,1 мг/л (значение основано на активности надосадочной жидкости культуры на пара-нитрофенилцеллобиозиде, см. фиг.3). Эти результаты снова демонстрируют, что, когда гетерологичная (то есть неклостридиальная) целлюлаза Сеl5Н слита генно-инженерным путем с сигнальной последовательностью и с СВМ скаффолдина CipC из С.cellulolyticum и с одним или с двумя модулями Х из CipA С.acetobutylicum, химерные ферменты продуцируются и секретируются в среду С.acetobutylicum.

Пример 4. Демонстрация активности слитых белков в соответствии с изобретением на целлюлозе

Используя методы молекулярной биологии, ДНК, кодирующую различные белковые конструкции, описанные в Примерах 2 и 3, амплифицировали и клонировали в экспрессионном векторе Е. соli (рЕТ22b(+), Novagen). Полученный в результате вектор использовали для трансформации штамма Е. соli BL21 (DE3) (Novagen). Во всех случаях шесть кодонов His прививали на конце С-конца рекомбинантных белков для облегчения их очистки на никельсодержащей смоле (Ni-NTA, Qiagen).

Рекомбинантные штаммы выращивали в среде Лурия-Бертани и экспрессию клонированных генов запускали, используя ИПТГ в качестве индуктора. Синтез рекомбинантных белков подтверждали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ). Культуры центрифугировали и собранные клетки разрушали в Френч-прессе.

Рекомбинантные белки очищали путем нанесения грубого экстракта на Ni-NTA (Qiagen) и элюирования интересующего белка, используя возрастающие концентрации имидазолия. Очистка была достигнута с использованием ЖХБР (жидкостной хроматографии быстрого разрешения) Q-сефарозы (смола Hitrap Q HP, GE Healthcare).

Активность очищенных ферментов тестировали на Avicel (микрокристаллической целлюлозе), используя стандартные условия (37°С). Результаты проиллюстрированы на фиг.4 и 5b. Альтернативно активность измеряли на пара-нитрофенилцеллобиозиде и результаты представлены на фиг.5а.

Пример 5: Секреция терапевтического белка

Данный пример является другим примером, иллюстрирующим секрецию интересующих полипептидов, в частности терапевтического белка интерлейкина-2 крысы, С.acetobutylicum в соответствии с настоящим изобретением. Получают конструкцию, где использованы модули, полученные из различных поддерживающих белков.

В конструкции полинуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-2 крысы (IL2), слита с полинуклеиновой кислотой, кодирующей домен-носитель, содержащий СВМ3а, полученный из белка CipC С.cellulolyticum, и первый (Ха) и второй (Ха') модули Х CipA С.acetobutylicum. Эта конструкция дополнительно содержит сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum. Подходящие линкерные последовательности используют для связывания различных модулей друг с другом.

Эта конструкция сконструирована, используя метод ПЦР с перекрывающимися одноцепочечными участками липких концов, и клонирована в челночном экспрессионном векторе pSOS952, который придает устойчивость к антибиотику эритромицину, посредством чего была получена плазмида p80S952-CBM-Xa-Xa'-IL2. Конструкцию проверяют секвенированием и метилируют in vivo. Этот метилированный вектор затем используют для электротрансформации штамма АТТС 824 С.acetobutylicum.

Показано, что штаммы С.acetobutylicum, несущие данную конструкцию, секретируют слитый белок, содержащий интерлейкин 2 крысы, в их ростовую среду в релевантных количествах. Эти результаты также показывают, что, когда интерлейкин-2 крысы слит генно-инженерным путем с сигнальной последовательностью и с СВМ скаффолдина CipC из С.cellulolyticum и с двумя модулями Х из CipA С.acetobutylicum, химерный белок продуцируется и секретируется в среду С.acetobutylicum. Это показывает, что СВМ из CipC С.cellulolyticum и модули Х из CipA С.acetobutylicum также обладают свойствами носителя в отношении секреции С.acetobutylicum терапевтического белка от млекопитающего. Слитый белок, содержащий IL2 крысы, очищают из надосадочной жидкости культуры путем нанесения внешней среды на колонку с кристаллической целлюлозой Avicel. Слитый белок элюируют с Avicel, используя дистиллированную воду (воду MilliQ), и анализы масс-спектрометрии, а также N-концевое микросеквенирование подтверждают целостность очищенного рекомбинантного белка.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии. Предложена полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок для обеспечения секреции фермента, расщепляющего клеточную стенку, в микроорганизме класса Clostridia, а также соответствующий рекомбинантный микроорганизм и способ продуцирования и секреции указанного белка. Изобретение может быть использовано для целлюлолитических процедур в промышленности. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 пр.

1. Полинуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок для обеспечения секреции фермента, расщепляющего клеточную стенку, в микроорганизме класса Clostridia, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает:
- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним гидрофильным модулем целлюлосомного поддерживающего белка;
- по меньшей мере один интересующий полипептид, который представляет собой фермент, расщепляющий клеточную стенку;
- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом, и
- по меньшей мере один сигнальный пептид.

2. Рекомбинантный микроорганизм класса Clostridia для обеспечения секреции фермента, расщепляющего клеточную стенку, содержащий полинуклеиновую кислоту по п.1, кодирующую слитый белок, состоящий из полипептидной последовательности, которая включает в данном порядке:
- по меньшей мере один сигнальный пептид;
- домен-носитель, содержащий по меньшей мере один углевод-связывающий модуль (СВМ) целлюлосомного поддерживающего белка, слитый по меньшей мере с одним гидрофильным модулем целлюлосомного поддерживающего белка;
- по меньшей мере один интересующий полипептид, который представляет собой фермент, расщепляющий клеточную стенку;
- по меньшей мере один пептидный линкер для связывания домена-носителя с интересующим полипептидом,
где микроорганизм секретирует указанный интересующий полипептид.

3. Рекомбинантный микроорганизм по п.2, где указанная полипептидная последовательность включает два или более чем два гидрофильных модуля целлюлосомного поддерживающего белка.

4. Рекомбинантный микроорганизм по п.2, где указанный сигнальный пептид указанного целлюлосомного поддерживающего белка представляет собой сигнальный пептид поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum или сигнальный пептид поддерживающего белка CipA С.acetobutylicum.

5. Рекомбинантный микроорганизм по п.2, где по меньшей мере один углевод-связывающий модуль представляет собой углевод-связывающий модуль типа 3а (СВМ3а).

6. Рекомбинантный микроорганизм по п.2, где по меньшей мере один гидрофильный модуль целлюлосомного поддерживающего белка представляет собой модуль Х2 поддерживающего белка CipC С.cellulolyticum или модуль Х2 поддерживающего белка CipA С.acetobutylicum.

7. Рекомбинантный микроорганизм по п.2, где указанный по меньшей мере один интересующий полипептид представляет собой целлюлазу.

8. Рекомбинантный микроорганизм по п.2, где указанный фермент представляет собой целлюлазу С.cellulolyticum.

9. Рекомбинантный микроорганизм по п.2, где указанный фермент представляет собой Cel48F или Cel9G.

10. Рекомбинантный микроорганизм по п.2, где указанный фермент представляет собой целлюлазу Cel5H штамма S.degradans 2-40.

11. Рекомбинантный микроорганизм по п.3, который принадлежит к штамму Clostridium, выбранному из группы, включающей С.acetobutylicum и С.beijerinckii.

12. Способ продуцирования и секреции слитого белка, кодируемого полинуклеиновой кислотой по п.1, включающий:
- получение рекомбинантного микроорганизма класса Clostridia по п.2, трансформированного полинуклеиновой кислотой по п.1,
- экспрессию указанной полинуклеиновой кислоты посредством культивирования указанного микроорганизма в условиях, эффективных, чтобы вызвать экспрессию кодируемого слитого белка,
- секрецию указанного слитого белка рекомбинантным микроорганизмом в окружающую среду этого рекомбинантного микроорганизма.

13. Полинуклеиновая кислота по п.1, где указанная полипептидная последовательность включает два или более чем два гидрофильных модуля целлюлосомного поддерживающего белка.