ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ИНФЕКЦИОННОГО ЭПИДИДИМИТА БАРАНОВ B.ovis Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии именно к разработке питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов Brucella ovis.

Известна питательная среда мясопептонный агар для выращивания бруцеллезного микроба, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный - 10,0 г; натрия хлорид - 5,0 г; кровь - 10,0 г; агар микробиологический - 15,0-20,0 г; рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°С (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6. - 2008. - С. 64-65.; С. - 269).

Недостатком данной среды является недостаточная питательная ценность для бруцелл.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда для культивирования бруцелл В. ovis содержащая г/л: мясопептонный агар, к которому добавляют 1% декстрозы (глюкозы) и 2% глицерина. Среду разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 116°С в течение 15 минут. Перед посевом к расплавленной и остуженной до 50°С среде добавляют 20% нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота или 10% аминопептида. (Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. Методические указания МУ 3.1.7.1189-03. Издание официальное. Минздрав России Москва 2003 г. с. 56).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность, ввиду позднего роста возбудителя.

Целью изобретения является разработка рецептуры питательной среды плотной для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов В. ovis, которая обеспечивает активный рост через 24 ч.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется мясная вода, печеночный отвар, пептон ферментативный, сыворотка крови крупного рогатого скота, для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала натрий хлористый, для насыщения среды углекислотой - натрий углекислый кислый, в качестве стимулирующих добавок - глюкоза, глицерин, натрия метабисульфит, а также агар микробиологический, питьевая вода, в следующих количествах на 1 л среды:

Мясная вода 150,0-350,0 мл Печеночный отвар 400,0-600,0 мл Пептон сухой ферментативный 8,0-12,0 г Натрий хлористый 4,0-6,0 г Натрий углекислый кислый 10% раствор 15,0-19,0 мл Глюкоза 0.03-0,09 г Глицерин 0,01-0,03 г Натрия метабисульфит 0.2-0,4 г Сыворотка крови крупного рогатого скота 0,1-0,3 мл Агар микробиологический 13,0-17,0 г Питьевая вода до 1 л

Мясная вода - говяжье мясо освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку, 1 кг мясного фарша заливают 2 л водопроводной воды и кипятят в течение часа, накипь снимают. После кипения, мясную воду остужают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр до полной прозрачности, затем доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают в бутыли и стерилизуют 20 минут при 120°С. (Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологичеких исследований. Издательство «Медицина». Москва - 1972. 437 с.).

Печеночный отвар - фарш из свежей говяжьей печени заливают питьевой водой (1 л на 1 кг фарша), затем настаивают 3 ч при 25-30°С или 6-10 ч при 4-10°С, затем варят около 2 ч; после варки отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при 115-120°С 20 мин. (Биргер М.О.. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Москва «Медицина» 1982. 82. с.).

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - ГОСТ 13805-76. Производитель «НПО Порт-Петровск».

Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Натрий углекислый кислый ГОСТ4201-79, хч. Партия 8. «РУСХИМ». Вводится в питательную среду для насыщения среды углекислотой, которая необходима для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита В. ovis.

Глюкоза кристаллическая, чда, партия 20140327 ЩЩЩ «МСД Торговая компания». Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глюкозы - улучшается ее ростовые свойства в концентрации 1%.

Глицерин ГОСТ 6259-75, партия 5, срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глицерина в концентрации 2% - улучшается ее ростовые свойства.

Натрия метабисульфит ГОСТ 11683-76 в средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO₂), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.

Сыворотка крови крупного рогатого скота для культивирования микроорганизмов жидкая, стерильная. Производство «БИОЛОТ», С-Петербург, а/я 25.

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г. Порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0.85% не ниже 80°С, температура застудневания - 30-37°С, прочность студня не менее - 350±40 г. Главная особенность агара его желирующая способность при 90°С.

Питьевая вода-ГОСТ Р 51232-98 отвечает всем гигиеническим требованиям. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важную роль в их физиологических функциях. Она входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например в реакциях гидролиза. Вода является хорошим растворителем, обеспечивая клетку питательными веществами. Вода - важнейший компонент всех питательных сред. В отсутствии воды замедляются или полностью прекращаются процессы жизнедеятельности микроорганизмов.

Приготовление плотной питательной среды

Для приготовления питательной среды плотной отмеряют- 250,0 мл мясной воды в мерном стакане, выливают в эмалированную кастрюлю, затем вливают печеночный отвара - 500,0 мл, взвешивают на механических весах пептон сухой ферментативный - 10,0 г, натрий хлористый - 5,0, натрий углекислый кислый 17,0 мл 10% раствор, агар микробиологический 15,0 г ссыпают в эмалированную кастрюлю вливают питьевой воды 250,0 мл тщательно перемешивают до образования однородной массы. Подогревают до кипения, затем кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Сбор фильтрата помещают в эмалированную кастрюлю, затем добавляют глюкозу 10,0 г, натрия метабисульфит 0,3 г и глицерин 20,0 мл. Готовый фильтрат имеет светло-желтый цвет, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до 7,3±0,1.

Приготовленную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,1 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт. Стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 30 мин. После стерилизации и остуживания до 46°С в каждый флакон добавляют стерильно 20% сыворотки крови крупного рогатого скота, затем разливают на чашки Петри по 35-40 мл питательной среды. Сочетанное применение выше описанных ингредиентов, обеспечивает существенное усиление ростовых качеств при культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита Brucella ovis в значительно ранние сроки через 24±1 ч на пластинках питательного агара. Готовую питательную среду плотную используют для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов В. ovis.

Эффективность полученной среды оценивают в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.3.2.2124-06) «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., с использованием вирулентных культур барана: В. ovis 703; В. ovis 704; В. ovis 706;. В. ovis 709; В. ovis 711; В. ovis 713; В. ovis 717; ovis 718. Испытуемые культуры выращивают на поверхности скошенного агара рН 7,2±0,1 при температуре 37°С в течение 48 ч. Из двухсуточных культур тест-штаммов бруцелл смывают с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ГИСК им. Л.А. Тарасевича, эквивалентную 1,7×10⁹ бруцелл 1 мл. Полученную микробную взвесь культуры разводят сначала до концентрации 1×10⁹ м.к./мл затем серийными десятикратными разведениями до 1×10⁶ и 1×10⁷ м.к./мл. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производят стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения. По 0,1 мл каждой культуры В. ovis из разведений 10⁶ (100 м.к.) и 10⁷ (10 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с испытуемыми средами и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Посевы инкубируют при температуре 37±1°С.

Учет результатов. Оценку ростовых свойств питательной среды плотной для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов В. ovis проводят путем подсчета количества выросших колоний бруцелл посуточно на пластинках агара с плотной питательной средой через каждые 24-48-72-120 ч. В качестве контролей использовали агар мясопептонный и агар Альбими.

Пример 1. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов В. ovis, содержащая следующие ингредиенты в следующих количествах на 1 л среды: мясная вода - 150,0 мл; печеночный отвар - 400,0 мл; пептон сухой ферментативный - 8,0 г; натрий хлористый - 4,0 г; натрий углекислый кислый 10% раствор - 15,0 мл; глюкоза - 0.03 г; глицерин - 0.01 г; метабисульфит натрия - 0,2 г; сыворотка крови крупного рогатого скота - 0,1 мл; агар микробиологический - 13,0 г; питьевая вода остальное.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии В. ovis начинали формироваться через 30 часа, на мясопептонном агаре через 60 ч, а на агаре Альбими рост отсутствовал при посеве 10 м.к., а при посеве 100 м.к. вырастало менее 2% колоний через 80 ч.

Пример 2. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов В. ovis, содержащая следующие ингредиенты в следующих количествах на 1 л среды: мясная вода - 250,0 мл; печеночный отвар - 500,0 мл; пептон сухой ферментативный - 10,0 г; натрий хлористый - 5,0 г; натрий углекислый кислый 10% раствор - 17,0 мл; глюкоза - 0,06 г; глицерин - 0,02 г; агар микробиологический - 15,0 г; метабисульфит натрия - 0,3 г; сыворотка крови крупного рогатого скота - 0,2 мл; агар микробиологический - 15,0 г; питьевая вода остальное.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии В. ovis начинали формироваться через 24 часа, на мясопептонном агаре через 48 ч, а на агаре Альбими рост отсутствовал при посеве 10 м.к., а при посеве 100 м.к. вырастало менее 20% колоний через 72 ч.

Пример 3. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов В. ovis, содержащая следующие ингредиенты в следующих количествах на 1 л среды: мясная вода - 350,0 мл; печеночный отвар - 600,0 мл; пептон сухой ферментативный - 12,0 г; натрий хлористый - 6,0 г; натрий углекислый кислый 10% раствор - 19,0 мл; глюкоза - 0.09 г; глицерин - 0.03 г; метабисульфит натрия - 0,4 г; сыворотка крупного рогатого скота - 0,3 мл; агар микробиологический - 17,0 г; питьевая вода остальное.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии В. ovis начинали формироваться через 29 часа, на мясопептонном агаре через 55 ч, а на агаре Альбими рост отсутствовал при посеве 10 м.к., а при посеве 100 м.к. вырастало менее 2% колоний через 85 ч.

Таким образом заявленная питательная среда плотная для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов В. ovis (пример №2) является оптимальной по количеству подобранных ингредиентов, что позволяет получить достаточное количество колоний максимально в ранние сроки через 24±1.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Плотная питательная среда для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов содержит мясную воду, печеночный отвар, пептон сухой ферментативный, натрий хлористый, 10%-ный раствор натрия углекислого кислого, глюкозу, глицерин, метабисульфит натрия, сыворотку крови крупного рогатого скота, агар микробиологический и питьевую воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет обеспечить активный рост возбудителя через 24 часа. 3 пр.

Питательная среда плотная для культивирования возбудителя инфекционного эпидидимита баранов В. ovis, содержащая ингредиенты в следующих количествах на 1 л среды:

мясная вода 150,0-350,0 мл печеночный отвар 400,0-600,0 мл пептон сухой ферментативный 8,0-12,0 г натрий хлористый 4,0-6,0 г натрий углекислый кислый 10% раствор 15,0-19,0 мл глюкоза 0,03-0,09 г глицерин 0,01-0,03 г метабисульфит натрия 0,2-0,4 г сыворотка крови крупного рогатого скота 0,1-0,3 мл агар микробиологический 13,0-17,0 г питьевая вода до 1 л