Питательная среда для культивирования бруцеллезного микроба Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Среда для культивирования бруцеллезного микроба

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности, выделению бруцеллезного микроба при бактериологической диагностике бруцеллеза.

К настоящему времени для культивирования бруцеллезного микроба предложены многочисленные варианты сред, обязательными компонентами для них являются углерод, минеральные соли, источники азота - аминокислоты, стимуляторы роста - витамины [3,6].

Для выделения и поддержания культур используют мясопептонный печеночный бульон, печеночно-глюкозо-глицериновый бульон, мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар, печеночно-глюкозо-глицериновый агар, сывороточно-декстрозный агар, эритрит-агар, и др. [4.5].

Анализ данных испытания указанных сред не позволяет определить оптимальную среду, обеспечивающую количественный выход и качественный рост бактерий. Поэтому в лабораторной практике приходится дублировать посев на различных средах, что представляет определенные трудности. Недостатком их, является медленный рост и низкая продуктивность, что в конечном итоге удлиняет диагностические сроки. При этом результаты бактериологического исследования при бруцеллезе не всегда совпадают с серологическими (РА и РСК). Все это создают не только определенные трудности при культивировании бруцелл, но и заметно сказывается на качестве диагностики бруцеллеза.

Наиболее близким к заявляемой среде по результативности является сывороточно - декстрозный агар.

Состав:

Агар-агар - 20 г Пептон - 10 г Натрия хлорид - 5 г Мясная вода -165 мл Стерильная сыворотка КРС - 10% Декстроза - 1% Дистиллированная вода - 835 мл

рH 7,4

Для приготовления среды к 835 мл дистиллированной воды добавляют 20 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 165 мл мясной воды. Кипятят до расплавления агара. Фильтруют, устанавливают pH 7,4. Разливают в колбы и стерилизуют 15 минут при 115°С. Перед использованием в расплавленный и охлажденный до 45°С агар, вносят 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота и 1% декстрозы.

Основой данной среды является мясная вода, где под действием пептона белки разлагаются до усвояемых полипептидов и аминокислот - факторы роста культуры. Однако белки при экстракции водой растворяются не одинаково, и при этом азот переходит в мясную воду в недостаточном количестве для обеспечения вегетирующей культуры белком, в связи, с чем обнаружить рост бруцелл из патологического материала не удается раньше чем через 3-4 недели. Кроме того, быстрому росту препятствует и недостаточное количество в среде углеводородов. Указанные причины придают среде существенные недостатки.

Целью изобретения является повышение эффективности культивирования бруцелл в лабораторных условиях на среде с измененным химическим составом.

Поставленная цель достигается тем, что сывороточно-декстрозный агар для выделения и культивирования бруцелл состоящий из агар - агара, пептона, натрия хлорид, мясной воды и декстрозы, готовится на основе 100% замены дистиллированной воды геотермальной.

Для достижения поставленной цели к 835 мл геотермальной воды добавили поочередно, перемешивая 20 г агара, 10 г пептона, 5 г химически чистого хлорида натрия и 165 мл мясной воды. После, содержимое колбы объемом (с учетом разной плотности компонентов) примерно 1035 мл обработали текущим паром в течение 1 ч, установили рН 7,8. Затем среду автоклавировали в течение 30 мин при 127°С (0,2 М/Па) для осаждения фосфора, фильтровали через бумажный фильтр, регулировали рН до 7,4, разлили смесь в мерную посуду, стерилизовали при 116°С в течение 15 мин. После соответствующей обработки (текущим паром, автоклавированием и стерилизацией) объем среды умещается до 1000 мл. Перед употреблением среду расплавили, остудили до 50°С, добавили 100 мл (10%) нормальной лошадиной сыворотки (можно бычью) и раствор декстрозы в количестве - 10 мл (1%), после чего фильтровали через фильтр Зейтца. При этом объем готовой среды составляет 1110 мл.

Предлагаемая среда отличается тем, что геотермальная вода, заменяющая дистиллированную воду как растворитель, является еще и дополнительным источником минеральных солей.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав среды отличается от известной заменой дистиллированной воды геотермальной, и расширением солевого состава за счет большего содержания микро и макроэлементов, а также углеводородов, способствующими ускоренному росту бруцелл и, соответственно, быстрому накоплению бактериальной массы, повышению информативности выделения при хороших ингибирующих постороннюю микрофлору свойствах. Таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна»

Сделанный расширенный лабораторный анализ геотермальной воды (фотометрия, потенциометрия, атомно-абсорбционная спектрометрия, комплексометрия и т.д.) показал качественное и количественное отличие данной воды от дистиллированной по микро- и макроэлементам [2].

Суммарное значение анионов в исследуемой воде составляло - 1,6771 г/л (NH₄, Na, K, Mg, Са, Sr, Fe, Mn, Zn, Cu, Ni), катионов - 3,4732 г/л (Cl, Br, I, SO₄, HCO₃, HPO₄, NO₃). Кроме того, в геотермальной воде содержится нейтральные и кислые битумы (2,5 мг/л), гумусовые вещества (7,1 мг/л) состоящие из углеводородов, для улучшения ростовых свойств, предлагаемой среды [1].

Экспериментально были испытаны наиболее часто используемые среды для культивирования бруцелл: картофельный агар; мясопептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар; печеночно-глюкозо-глицериновый агар и сывороточно-декстрозный агар.

Оценку сред проводили посевом свежевыделенных культур из объектов внешней среды (почва, корма, навоз) и биоматериала (кровь крупного рогатого скота, лимфоузлы, паренхиматозные органы) Brucella abortus - 3 штамма, Brucella melitensis - 2 штамма. В качестве музейного штамма использовали Brucella abortus 19 ВА. 104М, Brucella melitensis 16М, 753. Исследуемую культуру высевали в 6 чашках Петри каждой среды.

Для соблюдения равнозначности опыта материал высевали равными дозами (300 клеток в 0,1 мл). Скорость роста, интенсивность и величину колоний учитывали через 7 суток, 21 день и 35 дней после посева. Опыты повторялись трехкратно (Табл. 1).

Результаты исследования показали низкие ростовые свойства картофельного агара, колонии в количестве до 2-х обнаружили как в пробах с тест-штаммами, так и с нативным материалом через 21 сутки. На 35-е сутки колонии в количестве 8 единиц обнаружили в пробах с тест - штаммами, с нативным материалом картина не изменилась.

Мясопептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар показал незначительные ростовые свойства, через 7 суток в пробах с тест-штаммами - 2 колонии. Через 21 сутки, картина аналогичная и в пробах с нативным материалом. На третьем этапе исследования (35 суток) появился умеренный рост в обоих случаях - 6-8 колоний соответственно.

Аналогичные результаты на всех этапах исследования и в пробах с печеночно-глюкозо-глицериновым агаром.

В сывороточно-декстрозном агаре по 8 колоний обнаружили в исследуемых пробах через 21 сутки, к третьему этапу исследования значительных изменений в росте не выявили.

Заметные ростовые свойства показала предлагаемая среда. На 7 сутки культивирования 6 колонии с тест-штаммами, и 16 колонии на 21 сутки. К третьему этапу исследования количество колоний не изменилось. В пробах с нативным материалом картина резко не отличалась, несмотря на скудный рост на первом этапе исследования. Рост отличался не только числом, но и характером и размером колонии. Колонии S-формы, мелкие, выпуклые, гладкие, в основном с перламутровым оттенком.

Выводы. Таким образом, исследования показали, что предлагаемая среда для выделения бруцелл, обладает лучшими ростовыми свойствами и характеризуется ускоренным ростом эпизоотических и тестовых штаммов, что значительно сокращает сроки культивирования.

Литература.

1. Баратов М.О., Ахмедов М.М. Питательная среда для культивирования коринебактерий. Патент №2588670 Государственный реестр изобретений Российской Федерации, 07 июня 2016 г.

2. Баратов М.О., Сакидибиров О.П. Совершенствование питательной среды для культивирования коринебактерий. Ветеринария. - №11. - 2017. Москва - С. 62-65/

3. Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С.Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. Москва: ВО «Агропромиздат» - 1989. - С. 187-189.

4. Асонов Н. Р. Микробиология. Москва: «Колос». «Колос-Пресс» 2002. С. 230/

5. Кисленко В.Н.Ветеринарная микробиология и иммунология. Практикум. Санкт-Петербург: Москва-Краснодар. - 2012. - С. 264-266/

6. Кисленко В.Н. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. Москва: «Колос» - 2005. - С. 157-158.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для культивирования бруцеллезного микроба содержит пептон, натрия хлорид, мясную воду, стерильную сыворотку крупного рогатого скота, декстрозу, агар-агар и геотермальную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки культивирования бруцелл. 1 табл.

Среда для культивирования бруцеллезного микроба, содержащая агар-агар, пептон, натрия хлорид, мясную воду, стерильную сыворотку КРС, декстрозу и геотермальную воду при следующем соотношении компонентов:

Агар-агар 20 г Пептон 10 г Натрия хлорид 5 г Мясная вода 165 мл Стерильная сыворотка КРС 100 мл Декстроза 10 мл Геотермальная вода 835 мл,

pH 7,4.