ЭЛЕКТРОД С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ БЕЛКОМ И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ЭЛЕМЕНТ И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК C12M1/40 C25B11/00 H01M4/00 

Область техники, к которой относится изобретение

[Настоящее изобретение относится к электроду с иммобилизованным белком и к способу его изготовления и относится к функциональному элементу, в котором применен электрод с иммобилизованным белком, и к способу его изготовления.

Предшествующий уровень техники

В последние годы растет спрос на электроды с иммобилизованным белком. Например, в организме реакция переноса электронов происходит во множестве белковых пар. При изучении ориентации и механизма электронного переноса при образовании комплекса между белковыми парами применяют электрод с иммобилизованным белком. В данном случае электрод с иммобилизованным белком применяют таким образом, чтобы белок иммобилизовался на электроде и только после этого осуществляется специфическое взаимодействие между белком и другим белком, а ток детектируют с помощью электрода с иммобилизованным белком.

В последние годы уделяется большое внимание применению белка в элементе фотоэлектрического преобразования. Например, сообщают о получении фототока на электроде с иммобилизованным белком, в котором на золотом электроде иммобилизован цинковый цитохром с (который получают замещением железа на цинк в лошадином сердечном цитохроме с), и создают элемент фотоэлектрического преобразования, в котором применен электрод с иммобилизованным белком (см. JP 2007-220445). Однако белок нестабилен вне живого организма. Таким образом, является очень важным достижение долгосрочной стабилизации элемента фотоэлектрического преобразования. Однако, насколько известно авторам настоящего изобретения, до сих пор об этом ничего не сообщалось.

Полученный из Thermus thermophilus цитохром с552 в живом организме функционирует в качестве участника переноса электронов подобно лошадиному сердечному цитохрому с. Известно, что цитохром с552 обладает термостабильностью, которая выше, чем у лошадиного сердечного цитохрома с (см. Fee, J.А, и др. Protein Sci. 9, 2074 (2000)). Например, средняя точка денатурации общего белка находится в диапазоне от 50 до 60°С, а для лошадиного сердечного цитохрома с она составляет 85°С. С другой стороны, температуру денатурации цитохрома с552 невозможно измерить в обычном растворе (с верхним пределом температуры 100°С), т.к. она составляет 100°С или выше. Более того, сообщалось, что средняя точка денатурации цитохрома с552 в присутствии 4,2М гидрохлорида гуанидина (денатурирующий агент) составляет от 60 до 70°С.

Поскольку цитохром с552 обладает, как описано выше, высокой термостабильностью, то он подходит в качестве материала для устройств. Хотя цитохром с552 и лошадиный сердечный цитохром с имеют похожие составляющие аминокислоты и похожие трехмерные структуры, они различаются окружением активного центра кармана гема, в котором осуществляется перенос электронов. В частности, в лошадином сердечном цитохроме с остатки лизина, имеющие положительные заряды, распределены по всей молекуле. Хотя количество остатков лизина в цитохроме с552 схоже с их количеством в лошадином сердечном цитохроме с, эти остатки лизина не распределены вокруг кармана гема. Сообщалось, что комплекс цитохрома с552 и его in vivo окислительно-восстановительного партнера образован, главным образом, за счет гидрофобного взаимодействия, в соответствии со структурой комплекса (см. Muresanu, L. и др., J. Biol. Chem. 281, 14503 (2006)). Следовательно, для иммобилизации на электроде цитохрома с552 с сохранением способности переноса электронов требуется найти специфическое условие.

Одним из известных способов для иммобилизации на электроде лошадиного сердечного цитохрома с является применение мономолекулярной пленки (HS(CH₂)₁₀COO-, 1-карбокси-10-декантиол). Следовательно, считают возможным применение способа иммобилизации для иммобилизации цитохрома с552. Однако до настоящего времени не был получен ток окислительно-восстановительной реакции в способе иммобилизации цитохрома с552 на электроде путем применения мономолекулярной пленки, которая была использована в способе иммобилизации лошадиного сердечного цитохрома с.

Французская исследовательская группа сообщила, что они успешно получили ток в ходе белковой окислительно-восстановительной реакции путем применения электрода с иммобилизованным белком, в котором цитохром с552 иммобилизовали на серебряном электроде (см. Bemad, S. и др., Eur. Biophys. J. 36, 1039 (2007)). Однако в диаграмме циклической вольтамперометрии, полученной при использовании электрода с иммобилизованным белком, интервал между пиками волны окисления и волны восстановления является значительным, что говорит о существовании проблемы контроля ориентации белка. Кроме того, серебро в качестве материала для электрода подвержено коррозии и окислению даже при использовании в нормальных условиях. В связи с тем, что серебряный электрод не подходит для длительного постоянного применения, предпочтительным является применение вместо серебряного электрода химически стабильного электрода.

Сущность изобретения

Таким образом, задача, которая должна быть решена настоящим изобретением, заключается в создании электрода с иммобилизованным белком для длительного постоянного применения и способа его изготовления, в котором цитохром с552, его производное или вариант, обладающий высокой стабильностью, иммобилизован на химически стабильном золотом электроде, с сохранением способности переноса электронов цитохрома с552, его производного или варианта.

Другая задача, которая должна быть решена настоящим изобретением, заключается в создании функционального элемента, в котором применен электрод с иммобилизованным белком, для длительного постоянного применения, и способа его изготовления, в котором цитохром с552, его производное или вариант, обладающий высокой стабильностью, иммобилизован на химически стабильном золотом электроде с сохранением способности переноса электронов цитохрома с552, его производного или варианта.

Авторы настоящего изобретения провели множество исследований для решения этих задач и неожиданно обнаружили, что цитохром с552 может быть иммобилизован на золотом электроде без ухудшения способности цитохрома с552 переносить электроны, что привело к разработке настоящего изобретения.

В частности, для решения этих задач создан электрод с иммобилизованным белком, который включает золотой электрод и цитохром с552, его производное или вариант, иммобилизованный на золотом электроде.

Настоящее изобретение также представляет собой способ изготовления электрода с иммобилизованным белком, который включает иммобилизацию цитохрома с552, его производного или варианта на золотом электроде.

Настоящее изобретение также представляет собой функциональный элемент, который содержит электрод с иммобилизованным белком, включающий золотой электрод и цитохром с552, его производное или вариант, иммобилизованный на золотом электроде.

Настоящее изобретение также представляет собой способ изготовления функционального элемента, который включает стадию создания электрода с иммобилизованным белком посредством иммобилизации цитохрома с552, его производного или варианта на золотом электроде.

Изобретение не ограничивает особым образом функциональный элемент при условии, что в нем использован цитохром с552, его вариант или производное. Примеры функционального элемента включают элементы фотоэлектрического преобразования и различные электронные элементы, обладающие функцией фотоэлектрического преобразования.

В настоящем изобретении цитохром с552, его производное или вариант, как правило, иммобилизованы таким образом, чтобы гидрофобная часть была направлена к стороне золотого электрода. Как правило, цитохром с552, его производное или вариант и золотой электрод соединены друг с другом с помощью самоорганизующегося монослоя между ними. Производное цитохрома с552 является цитохромом с552, который имеет химически модифицированный аминокислотный остаток или гем в каркасе цитохрома с552. Вариант цитохрома с552 получают заменой части аминокислотных остатков в каркасе цитохрома с552 на другой аминокислотный остаток.

В настоящем изобретении, созданном так, как описано выше, при использовании электрода с иммобилизованным белком предотвращается появление коррозии, окисления или т.п., поскольку золотой электрод является химически стабильным. Кроме того, способность цитохрома с522, его производного или варианта переносить электроны не ухудшились при иммобилизации на золотом электроде цитохрома с552, его производного или варианта.

В соответствии с настоящим изобретением может быть создан электрод с иммобилизованным белком для длительного постоянного применения, в котором цитохром с522, его производное или вариант, обладающий высокой стабильностью, иммобилизован на химически стабильном золотом электроде, с сохранением способности цитохрома с552, его производного или варианта переносить электроны. Кроме того, с помощью электрода с иммобилизованным белком созданы различные функциональные элементы с высокой производительностью.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 является схематическим чертежом, иллюстрирующим электрод с иммобилизованным белком в соответствии с первым воплощением настоящего изобретения.

Фиг.2 является схематическим чертежом, иллюстрирующим структуру цитохрома с552, использованного в электроде с иммобилизованным белком в соответствии с первым воплощением изобретения.

Фиг.3 является схематическим чертежом, иллюстрирующим структуру цитохрома с552, использованного в электроде с иммобилизованным белком в соответствии с первым воплощением изобретения.

Фиг.4 является схематическим чертежом, иллюстрирующим структуру лошадиного сердечного цитохрома с.

Фиг.5 является схематическим чертежом, иллюстрирующим структуру лошадиного сердечного цитохрома с.

Фиг.6 является схематическим чертежом, иллюстрирующим детали структуры цитохрома с552 из электрода с иммобилизованным белком в соответствии с первым воплощением изобретения.

Фиг.7 является схематическим чертежом, иллюстрирующим детали структуры цитохрома с552 из электрода с иммобилизованным белком в соответствии с первым воплощением изобретения.

Фиг.8 является схематическим чертежом, иллюстрирующим структуру самоорганизующегося монослоя в электроде с иммобилизованным белком в соответствии с первым воплощением изобретения.

Фиг.9 является схематическим чертежом, иллюстрирующим результаты циклической вольтамперометрии, осуществленной в примере с помощью электрода с иммобилизованным цитохромом с552.

Фиг.10 является схематическим чертежом, иллюстрирующим результаты циклической вольтамперометрии, осуществленной в примере с помощью электрода с иммобилизованным цитохромом с552.

Фиг.11 является схематическим чертежом, демонстрирующим ежедневное изменение в значениях тока в примере с электродом с иммобилизованным цитохромом с552 при хранении его в белковом растворе при комнатной температуре.

Фиг.12 является схематическим чертежом, иллюстрирующим результаты циклической вольтамперометрии, осуществленной в примере с помощью электрода с иммобилизованным цитохромом с552.

Фиг.13 является схематическим чертежом, иллюстрирующим результаты циклической вольтамперометрии, осуществленной в примере с помощью электрода с иммобилизованным цитохромом с552.

Фиг.14 является схематическим чертежом, иллюстрирующим результаты циклической вольтамперометрии, осуществленной на электродах с иммобилизованным цитохромом с552, которые получены изменением концентрации KCl в растворе цитохрома с552.

Фиг.15 является схематическим чертежом, иллюстрирующим результаты циклической вольтамперометрии, осуществленной на электродах с иммобилизованным цитохромом с552, которые получены изменением содержания HS(CH₂)₁₀CH₂OH, использованного при образовании самообразующегося монослоя.

Фиг.16 является схематическим чертежом, иллюстрирующим результаты циклической вольтамперометрии, осуществленной на электродах с иммобилизованным цитохромом с552, которые получены изменением содержания HS(СН₃)₁₀CH₂OH, использованного при получении самообразующегося монослоя.

Фиг.17 является схематическим чертежом, полученным нанесением значений тока в пиках диаграмм циклической вольтамперометрии осуществленных с помощью электродов с иммобилизованным цитохромом с552, полученных изменением содержания HS(СН₃)₁₀CH₂OH в материале, использованном при образовании самоорганизующегося монослоя относительно содержания HS(СН₃)₁₀CH₂OH.

Фиг.18 является схематическим чертежом, иллюстрирующим результаты циклической вольтамперометрии, осуществленной на электродах с иммобилизованным цитохромом с552, полученных изменением длины гидрофобного и гидрофильного тиолов, использованных при образовании самоорганизующегося монослоя.

Фиг.19 является схематическим чертежом, иллюстрирующим структуру элемента фотоэлектрического преобразования в соответствии со вторым воплощением изобретения.

Осуществление изобретения

Наилучшие режимы осуществления изобретения будут описаны ниже.

Вначале будет приведено первое воплощение (электрод с иммобилизованным белком и способ его изготовления), а затем

второе воплощение (элемент фотоэлектрического преобразования)

Первое воплощение

Электрод с иммобилизованным белком

Фиг.1 иллюстрирует электрод с иммобилизованным белком в соответствии с первым воплощением.

Как показано на фиг.1, в электроде с иммобилизованным белком, цитохром с552 13 иммобилизован на золотом электроде 11 с расположенным между ними самоорганизующимся монослоем (СОМ) 12. В данном случае цитохром с552 13 иммобилизован таким образом, чтобы гидрофобная часть 13а находилась на стороне золотого электрода 11. В геме 13b цитохрома с552 13 в качестве центрального металла координируется железо (Fe).

Фиг.2,А схематически иллюстрирует структуру цитохрома с552. На фиг.2,А показана схемная модель гема цитохрома с552 и его осевые лигандные остатки гистидина (His), метионина (Met) и лизина (положительно заряженные аминокислоты). Фиг.2,А является фронтальным видом гема цитохрома с552, который ориентирован так, чтобы осевой лигандный гистидин (His) располагался на правой стороне. Фиг.2,В является диаграммой распределения заряда на поверхности цитохрома с552, представленного на фиг.2,А. Фиг.3,А является чертежом цитохрома с552, наблюдаемого с обратной стороны гема. Фиг.3,В является диаграммой распределения заряда на поверхности цитохрома с552, представленного на фиг.3,А.

Для сравнения на фиг.4,А представлен чертеж лошадиного сердечного цитохрома с, наблюдаемый с фронтальной стороны гема, а фиг.4,В является диаграммой распределения заряда на поверхности лошадиного сердечного цитохрома с, представленного на фиг.4,А. Фиг.5,А является чертежом лошадиного сердечного цитохрома с, наблюдаемого с фронтальной стороны гема, а фиг.5,В является диаграммой распределения заряда на поверхности лошадиного сердечного цитохрома с, представленного на фиг.5,А.

На фиг.4,В и 5,В показано, что лошадиный сердечный цитохром с имеет положительные заряды, которые распределены по всей молекуле. С другой стороны, на фиг.2,В и 3,В показано, что цитохром с552 имеет положительные заряды, сконцентрированные в задней части гема. Кроме того, фронтальная часть гема в цитохроме с552 занята гидрофобными остатками и нейтральными полярными остатками. Гидрофобная часть 13 а цитохрома с552 13 соответствует фронтальной части гема.

На фиг. 6 схематически показан цитохром с552 13, иммобилизованный на золотом электроде 11 с расположенным между ними самоорганизующимся монослоем 12. На фиг.6 осевой лигандный гистидин присутствует во фронтальной части цитохрома с552 13, а остатки лизина показаны в реберной модели.

Фиг.7 является чертежом цитохрома с552 13, иммобилизованного на золотом электроде 11 с расположенным между ними самоорганизующимся монослоем 12, который наблюдается со стороны золотого электрода 11, где осевой лигандный гистидин присутствует на правой стороне (фронтальная часть гема). На фиг.7 аминокислотные боковые цепи представлены реберной моделью.

Самоорганизующийся монослой 12 состоит из трех частей. Первая часть является связывающей функциональной группой (такой как тиольная группа (-SH)), которая реагирует с атомом на поверхности золотого электрода 11, на котором должен быть иммобилизован самоорганизующийся монослой. Вторая часть, как правило, является алкильной цепью. Двухмерная регулярная структура самоорганизующегося монослоя 12 создана главным образом ван-дер-ваальсовыми силами между алкильными цепями. Соответственно, как правило, в случае, когда число углеродов в алкильных цепях достаточно большое, образуется стабильная, высокоплотная и в высокой степени ориентированная пленка. Третьей частью является концевая группа. При применении концевой группы в качестве функциональной группы твердая поверхность функционализируется.

Самоорганизующийся монослой 12 образован с помощью, например, гидрофобного и гидрофильного тиолов. В соответствии с соотношением гидрофобного и гидрофильного тиолов меняется легкость соединения между цитохромом с552 13 и золотым электродом 11 . Примеры гидрофобной группы гидрофильного тиола включают -ОН, -NH₂, SO₃ ^-, OSO₃ ^-, СОО^- и NH₄ ⁺. Гидрофобный и гидрофильный тиолы могут быть выбраны в соответствии с необходимостью.

Предпочтительным примером комбинации гидрофобного и гидрофильного тиолов является комбинация HS(СН₂)_nCH₃ (n=5, 8, 10) в качестве гидрофобного тиола и HS(CH₂)_nCH₂OH (n=5, 8, 10) в качестве гидрофильного тиола. Конкретно, например, гидрофобным тиолом является 1-ундекантиол(HS(СН₂)₁₀СН₃), а гидрофильным тиолом является 1-гидрокси-11-ундекантиол (HS(CH₂)₁₀CH₂OH). Другим примером комбинации гидрофобного и гидрофильного тиолов является комбинация HS(СН₂)_mCH₃ в качестве гидрофобного тиола и HS(CH₂)_nCH₂OH в качестве гидрофильного тиола (где m<n, m равно, например, пяти или больше, а n равно, например, 10 или меньше). Конкретно, например, гидрофобным тиолом является HS(CH₂)₉СН₃), а гидрофильным тиолом является HS(CH₂)₁₀CH₂OH.

На фиг.8 схематически показана структура самоорганизующегося монослоя 12, образованного с помощью гидрофобного и гидрофильного тиолов. Как показано на фиг.8, сторона тиольной группы (-SH) гидрофобного тиола 12а и гидрофильный тиол 12b связаны с поверхностью золотого электрода 11. Кроме того, сторона гидрофобных групп гидрофобного тиола 12а и сторона гидрофильных групп гидрофобного тиола 12b (показанной кружками на фиг.8) связаны с гидрофобной частью 13а цитохрома с552 13.

Способ получения электрода с иммобилизованным белком

Далее описан пример способа получения электрода с иммобилизованным белком.

Во-первых, золотой электрод 11 погружают в раствор, полученный смешиванием гидрофобного и гидрофильного тиолов, в заранее определенном соотношении (с использованием, например, этанола в качестве растворителя) для образования самоорганизующегося монослоя 12 на поверхности золотого электрода 11, как показано на фиг. 1.

Затем золотой электрод, на котором образован самоорганизующийся монослой 12, погружают в раствор, содержащий цитохром с552 13, буферный раствор и, при необходимости, соль, такую как хлорид калия (KCl). В результате цитохром с552 абсорбируется и иммобилизуется на самоорганизующемся монослое 12, так что гидрофобная часть 13 а располагается к стороне золотого электрода 11.

Таким образом изготовляют целевой электрод с иммобилизованным белком.

Пример

Будет описан пример электрода с иммобилизованным белком (который в дальнейшем в этом документе называется электродом с иммобилизованным цитохромом с552).

1. Получение образца

Готовили 0,1 мМ раствор, полученный смешиванием 1-ундекантиола (HS(СН₂)₁₀СН₃) в качестве гидрофобного тиола и 1-гидрокси-11-ундекантиола (HS(CH₂)₁₀CH₂OH) в качестве гидрофильного тиола в соотношении 25:75 в этаноле. Чистый золотой капельный электрод или золотой плоский электрод затем погружают в раствор и оставляют в нем при комнатной температуре на один день. Таким образом на поверхности золотого капельного электрода или золотого плоского электрода образуется самоорганизующийся монослой.

Электрод промывают ультрачистой водой, погружают в 50 мкМ раствор цитохрома с552 (10 мМ буферный раствор трис-соляной кислоты (рН 7,6) и 50 мМ KCl) и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут или дольше. Таким образом, получают электрод с иммобилизованным цитохромом с552, в котором цитохром с552 иммобилизован на поверхности золотого капельного электрода или золотого плоского электрода с самоорганизующимся монослоем, расположенным между ними.

При использовании электрода с иммобилизованным цитохромом с552, полученным как описано выше, проводили циклическую вольтамперометрию. Результаты представлены на фиг.9 и 10. На фиг.9 и 10 I служит для обозначения тока (А), а Е указывает потенциал (V) для контрольного электрода (Ag/AgCl) (такой же применяется далее). Из фиг.9 и 10 понятно, что изображены типичные диаграммы адсорбционной циклической вольтамперометрии без разделения пиков. Диаграмма циклической вольтамперометрии, представленная на фиг.9, демонстрирует результаты измерения, проведенного при скоростях развертки потенциала, варьирующих в диапазоне от 10 до 100 мВ/с с шагом 10 мВ/с. Более того, диаграмма циклической вольтамперометрии, представленная на фиг.10, демонстрирует результаты измерения, проведенного при скоростях развертки потенциала, варьирующих в диапазоне от 100 до 1000 мВ/с с шагом 100 мВ/с.

Из фиг.9 и 10 понятно, что в электроде с иммобилизованным цитохромом с552, не происходит разделения пиков в диапазоне скорости развертки потенциала от 10 до 1000 мВ/с. Это означает, что карман гема цитохрома с552 оптимально координирован по отношению к золотому электроду в электроде с иммобилизованным цитохромом с552.

На фиг.11 показано ежедневное изменение значений тока (анодный ток Ipa и катодный ток Ica), происходящее при хранении электрода с иммобилизованным цитохромом с552 в белковом растворе при комнатной температуре. Как продемонстрировано на фиг.11, электрод с иммобилизованным цитохромом с552 дает схожее значение тока окислительно-восстановительной реакции даже после хранения в белковом растворе при комнатной температуре в течение одного месяца. В подобном эксперименте при использовании лошадиного сердечного цитохрома с значение тока уменьшалось понемногу с течением времени, и в диаграмме циклической вольтамперометрии произошло разделение пиков.

Далее приведено описание данных, полученных при сравнении случаев, когда направление гема в цитохроме с552 в электроде с иммобилизованным цитохромом с552 противоположно направлению гема цитохрома с552 в электроде с иммобилизованным цитохромом с552 в приведенном примере, т.е. для золотого электрода. Более конкретно, будет дано описание данных для случая, когда цитохром с522 иммобилизован на золотом электроде с помощью самоорганизующегося монослоя, имеющего отличную концевую часть, т.е. в случае, когда цитохром с522 иммобилизован в неправильной ориентации.

Конкретно, проводили циклическую вольтамперометрию на электроде с иммобилизованным цитохромом с552, в котором цитохром с552 иммобилизован на золотых электродах с помощью тиолов (HS(CH₂)₁₀R), имеющих 10 атомов углерода и различные концевые части (-R). Итоговые диаграммы циклической вольтамперометрии представлены на фиг. 12, где 10 мМ раствор фосфата натрия (рН 7,0) использовали в качестве буферного раствора, а скорость развертки потенциала составляла 50 мВ/с.

Хотя на фиг.12 видны пики окисления-восстановления белка или чего-либо в этом роде в случае, когда (-R) был -СОО^-, после повторения цикла окисления-восстановления, пики исчезали. Следовательно, понятно, что в случае, когда цитохром с552 иммобилизован на золотом электроде в неправильной ориентации, функция цитохрома с552 не поддерживается.

Далее описаны результаты циклической вольтамперометрии, проведенной при изменении концентрации KCl в растворе цитохрома с552, использованном при получении вышеописанного электрода с иммобилизованным с552.

Во время измерения в качестве буферного раствора применяли 10 мМ раствор фосфата натрия (рН 7,0) и устанавливали скорость развертки потенциала 50 мВ/с. Применяли электроды с иммобилизованным цитохромом с552, в каждом из которых цитохром с552 иммобилизовали на золотом капельном электроде с расположенным в промежутке самоорганизующимся монослоем, образованным с помощью HS(СН₂)₁₀СН₃ и HS(СН₃)₁₀CH₂OH таким же образом, как описано выше. При этом диаметр золотого капельного электрода составил 2,5 мм.

Итоговые диаграммы циклической вольтамперометрии представлены на фиг.13. При этом в качестве буферного раствора в растворе цитохрома с552 применяли 10 мМ буферный раствор трис-соляная кислота (рН 7,6). Поскольку концентрация KCl в растворах цитохрома с552, способных иммобилизовать цитохром с552, находится в диапазоне от 0 до 200 мМ, циклическую вольтамперометрию проводили при изменении концентрации KCl в этом диапазоне.

Фиг.14 является графиком, который получен интеграцией катодного тока (нисходящий пик) диаграммы циклической вольтамперометрии, представленной на фиг.13, для получения общего количества заряда с последующим нанесением на график количества относительно концентрации KCl, Из фиг.14 понятно, что оптимум концентрации KCl находится в диапазоне от 10 до 30 мМ. Когда концентрация попадает в пределы оптимального диапазона, количество иммобилизации цитохрома с552 в около 1,5 раза больше, чем в случае, когда раствор цитохрома с552, не содержащий KCl, т.е. когда концентрация KCl равна 0 мМ, или в случае, когда концентрация KCl равна 50 мМ или выше. В случае, когда концентрация KCl выше 100 мМ, возникает десорбция цитохрома с552 и самоорганизующегося монослоя.

Далее получали самоорганизующиеся монослои при изменении соотношения между HS(СН₂)₁₀СН₃ и HS(CH₂)₁₀CH₂OH в этанольном растворе, который использовали для образования самоорганизующегося монослоя. Затем осуществляли циклическую вольтамперометрию на электродах с иммобилизованным цитохромом, образованных иммобилизацией цитохрома с552 с самоорганизующимся монослоем в промежутке. При этом во время измерения в качестве буферного раствора применяли 10 мМ раствор фосфата натрия (рН 7,0) и устанавливали скорость развертки потенциала 50 мВ/с.

Итоговые диаграммы циклической вольтамперометрии представлены на фиг.15. Цифрами в сноске представлены соотношения ([HS(СН₂)₁₀СН₃]/[HS(СН₂)₁₀CH₂OH]). Например, (20/80) означает, что HS(СН₂)₁₀СН₃ составляет 20%, a HS(CH₂)₁₀CH₂OH составляет 80%.

На основе результатов, представленных на фиг.15, была проведена проверка посредством тонкого изменения содержания HS(CH₂)₁₀CH₂OH в общей смеси HS(СН₂)₁₀СН₃ и HS(CH₂)₁₀CH₂OH с шагом 5% в диапазоне от 60% до 95% включительно. Результаты представлены на фиг.16.

Фиг.17 является графиком, полученным путем нанесения значений тока при пиках окисления-восстановления в результатах, представленных на фиг.15 и 16 относительно содержания HS(CH₂)₁₀CH₂OH. Из фиг.17 понятно, что цитохром с552 прекрасно иммобилизуется, если содержание HS(CH₂)₁₀CH₂OH попадает в диапазон от 60% до 90% включительно. Хотя детали не описаны, другими проведенными экспериментами подтверждается, что цитохром с552 прекрасно иммобилизуется, если содержание HS(CH₂)₁₀CH₂OH попадает в диапазон от 60% до 90% включительно во всех случаях, когда гидрофобным тиолом является HS(СН₂)_nCH₃ (n=5, 8, 10), а гидрофильным тиолом является HS(CH₂)_nCH₂OH (n=5, 8, 10).

Далее будут описаны результаты циклической вольтамперометрии, проведенной при изменении длины гидрофобных и гидрофильных тиолов, использованных при образовании самоорганизующихся монослоев. Конкретно, самоорганизующиеся монослои образованы при использовании комбинаций HS(СН₂)₅СН₃ или HS(СН₂)₁₀СН₃ в качестве гидрофобного тиола, имеющих концевую часть в виде метильной группы и число атомов углерода, равное пяти или 10, и HS(CH₂)₁₀CH₂OH или HS(CH₂)₅CH₂OH, имеющих концевую часть в виде гидроксиметильной группы и число атомов углерода, равное пяти или 10. Затем иммобилизовали цитохром с552 на золотом электроде с самоорганизующимся монослоем в промежутке. Циклическую вольтамперометрию проводили с помощью электродов с иммобилизованным цитохромом с552, полученным, как описано выше. На фиг. 18 представлены полученные диаграммы циклической вольтамперометрии.

В кривых (1), (2), (3), и (7), представленных на фиг.18, пики, полученные из белка, появляются вокруг 0 В. Это говорит о том, что даже когда число атомов углерода гидрофобного и гидрофильного тиолов изменяется, цитохром с552 иммобилизован в схожей ориентации, если поддерживается баланс между метильной группой гидрофобного тиола и гидроксильной группой гидрофильного тиола в гидрофобном и гидрофильном тиолах, использованных при образовании самоорганизующегося монослоя, т.е. поддерживается баланс между распределениями гидрофобной и гидрофильной групп на поверхности самоорганизующегося монослоя. Что касается гидрофильного тиола, прекрасный результат был получен в случае, когда число атомов углерода гидрофильной группы равно 10 или более, по сравнению со случаем, когда число атомов углерода равно пяти.

Как описано выше, в соответствии с первым воплощением цитохром с552 13, обладающий высокой стабильностью, иммобилизован на химически стабильном золотом электроде 11 с расположенным в промежутке самоорганизующимся монослоем 12 так, чтобы гидрофобная часть 13 а располагалась к стороне золотого электрода 11. Таким образом создан электрод с иммобилизованным белком для длительного постоянного применения, в котором цитохром с552 иммобилизован на золотом электроде 11, при сохранении его способности переносить электроны.

Второе воплощение

Элемент фотоэлектрического преобразования

Как показано на фиг.19, элемент фотоэлектрического преобразования имеет электрод с иммобилизованным белком, в котором цитохром с552 иммобилизован на золотом электроде 11 с расположенным в промежутке самоорганизующимся монослоем 12 по аналогии с первым воплощением. Кроме того, зеленый флюоресцентный белок (GFP) электростатически связан с цитохромом с552 13.

В элементе фотоэлектрического преобразования, когда свет (hν) проникает извне, то он поступает на зеленый флюоресцентный белок 14, и электроны в зеленом флюоресцентном белке 14 приходят в возбужденное состояние. Возбужденные электроны переходят на цитохром с552 и извлекаются в виде фототока, текущего извне к золотому субстрату 11. Таким образом, осуществляется фотоэлектрическое преобразование.

Остальные детали аналогичны первому воплощению.

В соответствии со вторым воплощением реализован новый элемент фотоэлектрического преобразования при использовании электрода с иммобилизованным белком с длительным постоянным применением.

Хотя воплощения настоящего изобретения были описаны выше на конкретных примерах, изобретение не ограничено упомянутыми выше воплощениями и возможны различные модификации, основанные на технической идее изобретения.

Например, значения, структуры, конфигурации, формы, материалы и т.п., описанные в воплощениях выше, являются просто примерами, и по мере необходимости могут быть применены различные значения, структуры, конфигурации, формы, материалы и т.п.

Группа изобретений относится к биохимии. Предложен способ изготовления электрода с иммобилизованным белком путем иммобилизации цитохрома с552, его производного или варианта на золотом электроде таким образом, что гидрофобная часть цитохрома, его производного или варианта расположена напротив золотого электрода. Цитохром с552, его производное или вариант и золотой электрод соединены друг с другом с помощью самоорганизующегося монослоя, расположенного между ними. После образования на золотом электроде самоорганизующегося монослоя золотой электрод погружают в раствор, содержащий цитохром с552, его производное или вариант, буферный раствор и от 10 мМ до 30 мМ включительно хлорида калия для связывания цитохрома с552, его производного или варианта с золотым электродом с помощью самоорганизующегося монослоя, расположенного между ними. Также предложен электрод, полученный вышеуказанным способом. Предложен способ изготовления функционального элемента фотоэлектрического преобразователя. Способ включает стадии образования электрода с иммобилизованным белком путем иммобилизации на золотом электроде цитохрома с552, его производного или варианта. Предложен также функциональный элемент фотоэлектрического преобразователя, полученный вышеуказанным способом. Предложенная группа изобретений обеспечивает повышение стабильности электрода с иммобилизованным белком с сохранением способности переноса электронов цитохрома с552, его производного или варианта для длительного постоянного применения. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 19 ил.

1. Электрод с иммобилизованным белком, содержащий золотой электрод и цитохром с552, его производное или вариант, иммобилизованный на золотом электроде таким образом, что гидрофобная часть цитохрома, его производного или варианта расположена напротив золотого электрода, и цитохром с552, его производное или вариант и золотой электрод соединены друг с другом с помощью самоорганизующегося монослоя, расположенного между ними, причем самоорганизующийся монослой образован из гидрофобного и гидрофильного тиолов, гидрофобным тиолом является HS(СН₂)_nCH₃ (n=5, 8, 10), а гидрофильным тиолом является HS(CH₂)_nCH₂OH (n=5, 8, 10) и содержание HS(CH₂)_nCH₂OH в самоорганизующемся монослое составляет от 60% до 90% включительно.

2. Электрод с иммобилизованным белком по п.1, в котором гидрофобным тиолом является HS(СН₂)₁₀СН₃, а гидрофильным тиолом является HS(CH₂)₁₀CH₂OH.

3. Электрод с иммобилизованным белком по п.1, в котором гидрофобным тиолом является HS(СН₂)_mCH₃, а гидрофильным тиолом является HS(CH₂)_nCH₂OH (m<n).

4. Способ изготовления электрода с иммобилизованным белком путем иммобилизации цитохрома с552, его производного или варианта на золотом электроде таким образом, что гидрофобная часть цитохрома, его производного или варианта расположена напротив золотого электрода, и цитохром с552, его производное или вариант и золотой электрод соединены друг с другом с помощью самоорганизующегося монослоя, расположенного между ними, и после образования на золотом электроде самоорганизующегося монослоя золотой электрод погружают в раствор, содержащий цитохром с552, его производное или вариант, буферный раствор и от 10 мМ до 30 мМ включительно хлорида калия для связывания цитохрома с552, его производного или варианта с золотым электродом с помощью самоорганизующегося монослоя, расположенного между ними.

5. Функциональный элемент фотоэлектрического преобразователя, содержащий электрод с иммобилизованным белком, который включает золотой электрод, и иммобилизованный на золотом электроде цитохром с552, его производное или вариант по пп.1-3.

6. Способ изготовления функционального элемента фотоэлектрического преобразователя по п.5, включающий стадии образования электрода с иммобилизованным белком путем иммобилизации на золотом электроде цитохрома с552, его производного или варианта.