ФЕРМЕНТНЫЙ ЭЛЕКТРОД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АМИНОПИРИНА В ВОДНОМ РАСТВОРЕ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОПИРИНА В ВОДНОМ РАСТВОРЕ Российский патент 2003 года по МПК G01N27/327 C12Q1/25 

Изобретение относится к области медицины и биохимии и касается ферментного электрода для определения содержания аминопирина в водном растворе, способа его получения и способа определения содержания аминопирина в водном растворе.

Изобретение может быть использовано в медицинской практике для изучения метаболизма лекарственных препаратов, относящихся к группе третичных аминов, таких как аминопирин, бензфетамин, фенобарбитал, в организме. Цитохромы Р450 или гемопротеины являются монооксигеназами, уникальное свойство которых - способность гидроксилировать неактивированные атомы углерода. Цитохромы Р450 метаболизируют около 200000 различных соединений, катализируя примерно 60 типов химических реакций (гидроксилирование, N-, О- или S-деметилирование, деалкилирование, эпоксидирование и т.д.). Эта особенность цитохромов делает их перспективными в использовании для анализа содержания в различных средах лекарственных препаратов и(или) их метаболитов, ксенобиотиков, а также для стереонаправленного синтеза стероидов или других классов биологически активных соединений. Ферментные электроды, содержащие иммобилизованный цитохром Р450, могут найти применение для измерения содержания в растворе типичных субстратов цитохромов Р450: лекарств, ксенобиотиков, биологически активных соединений, например аминопирина.

Описан метод иммобилизации цитохрома Р450кам, метаболизирующего камфору, на электроде из оксида индия [1]. При электрополимеризации цитохрома Р450кам из раствора, содержащего цитохром Р450кам, происходит фиксация фермента на электроде. Недостатком этого метода является невозможность прямого определения концентрации фермента на электроде, что затрудняет оценку каталитической активности ферментного электрода. При иммобилизации цитохрома Р450 71В1 и его редокс партнера цитохром Р450 редуктазы за счет включения в эмульсию масло-вода получены стабильные образцы, содержащие гемопротеин и флавопротеин [2] , однако этот метод иммобилизации не применим для получения ферментных электродов. Описан метод иммобилизации цитохрома Р450кам на пирографитовых электродах в присутствии фосфолипидов [3], однако в литературе не описано применение полученных электродов в качестве амперометрических биосенсоров для определения концентрации субстрата этой изоформы цитохрома Р450-камфоры - в растворе. Кроме того, иммобилизация белка проводилась без сшивающего бифункционального реагента, позволяющего фиксировать белки на поверхности электродов.

Цитохром Р450 2В4 является специфическим ферментом, обладающим N-деметилазной активностью по отношению к третичным аминам, таким, например, как широко используемые лекарственные препараты аминопирин, бензфетамин, фенобарбитал. Исследование содержания таких лекарственных препаратов проводится обычно традиционными аналитическими методами, например с помощью газовой или жидкостной хроматографии.

Задачей настоящего изобретения является создание ферментного электрода на основе цитохрома Р450 2В4, позволяющего проводить измерение содержания в водных средах типичных субстратов цитохрома Р450 2В4, в том числе лекарственных препаратов, содержащих третичные аминогруппы, например аминопирина, а также разработка способа получения указанного ферментного электрода и способа определения содержания аминопирина в водном растворе с помощью указанного ферментного электрода.

Указанная задача решается описываемым ферментным электродом для определения содержания аминопирина в водном растворе, представляющим собой родий-графитовый электрод с иммобилизованным на нем химически модифицированным рибофлавином цитохромом RfP450 2B4.

Известно, что цитохромы Р450 способны электрохимически восстанавливаться. Для повышения эффективности электрохимического восстановления цитохрома Р450 получен полусинтетический модифицированный рибофлавином цитохром Р450 2В4, или флавоцитохром Р450 2В4 (RfP450 2B4), содержащий ковалентно связанные с молекулой цитохрома флавиновые группы. Полученные образцы содержат 8-12 остатков рибофлавина на 1 молекулу цитохрома Р450 [4].

В соответствии с изобретением данный флавоцитохром RfP450 2B4 используют для получения указанного выше ферментного электрода.

Для фиксирования полусинтетического флавоцитохрома RfP450 2B4 на поверхности родий-графитового электрода, полученного методом печати [5, 6], используют метод иммобилизации в присутствии сшивающего бифункционального реагента - глутарового альдегида и стабилизирующего белка - бычьего сывороточного альбумина (BSA) [7]. Были получены электроды с содержанием флавоцитохрома RfP450 2B4 0,5-0,8 нмоль на электрод. Электрохимическое восстановление флавоцитохрома в растворе регистрировалось с помощью метода цикловольтамперометрии (фиг.1).

В соответствии с изобретением описывается также способ получения ферментного электрода для определения содержания аминопирина в водном растворе, заключающийся в том, что на поверхность родий-графитового электрода, полученного методом печати, наносят смесь, состоящую из раствора глутарового альдегида, бычьего сывороточного альбумина и дилауроилфосфатидилэтаноамина в 9-15% холате натрия и раствора указанного выше флавоцитохрома RfP450 2B4 в калий-фосфатном буфере, с последующей инкубацией при +2 - +8^oС. Процесс ведут при рН 7,2-7,6.

Полученный ферментный электрод калибруют в водном буферном растворе, например в калий-фосфатном буфере, и используют для определения содержания аминопирина в водном растворе.

Известно, что цитохром Р450 2В4 расщепляет аминопирин с образованием среди прочих продуктов расщепления формальдегида, регистрируемого с помощью реактива Наше [8].

Способ основан на измерении тока, возникающего при электролитическом расщеплении аминопирина с помощью флавоцитохрома Р450 2В4, иммобилизованного на поверхности электрода. Возникающий ток пропорционален количеству аминопирина в растворе.

Способ заключается в том, что осуществляют электролиз при контролируемом напряжении смеси, содержащей анализируемый водный раствор аминопирина и водный буферный раствор, например калий-фосфатный буфер, при этом в качестве рабочего электрода используют ферментный электрод, представляющий собой печатный родий-графитовый электрод с иммобилизованным на нем химически модифицированным рибофлавином цитохромом Р450 2В4, регистрируют изменения тока на рабочем электроде до выхода на плато и определяют содержание аминопирина по предварительно построенному калибровочному графику зависимости тока от содержания аминопирина в стандартных водных растворах аминопирина известной концентрации.

Возникающий при электролизе ток, так называемый каталитический ток, пропорционален содержанию аминопирина в растворе.

Перед определением содержания аминопирина в анализируемом растворе предварительно строят калибровочный график зависимости каталитического тока от содержания аминопирина в стандартных, заранее приготовленных водных растворах аминопирина известной концентрации.

При построении калибровочного графика в электролитическую ячейку, содержащую 0,1 М водный калий-фосфатный буферный раствор и указанный выше ферментный электрод с иммобилизованным на нем флавоцитохромом RfP450 2B4 в качестве рабочего электрода, добавляют аликвоты определенной концентрации водного раствора аминопирина, проводят электролиз, регистрируют зависимость каталитического тока от концентрации аминопирина в растворе и строят калибровочный график зависимости тока от концентрации аминопирина в электролите.

ПРИМЕР 1. Синтез флавоцитохрома RfP450 2B4.

Ковалентное связывание рибофлавина с цитохромом Р450 2B4 проводят по методикам, описанным в [4].

0,6 мг рибофлавина (Sigma) и 6 мг карбонилдимидазола (Sigma) в 50 мкл абсолютного диоксана перемешивают 1 час. Затем диоксан упаривают. К полученному активированному производному рибофлавина прибавляют 10 нмоль цитохрома Р450 2B4 в 200 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера, содержащего 40% глицерина. Реакционную смесь инкубируют 12 часов при +4^oС. Очистку полученного флавоцитохрома RfP450 2B4 от избытка рибофлавина проводят методом равновесного диализа с 3-кратной сменой буферного раствора, содержащего 0,1 М калий-фосфатный буфер и 20% глицерин, с последующим концентрированием раствора с помощью фильтров Microcon YM-100 (фирма Amicon, USA). Концентрацию рибофлавина во флавоцитохроме RfP450 2B4 определяют спектрально, используя коэффициент экстинкции рибофлавина ε₄₅₀ = 11300 М^-1см^-1. Концентрацию цитохрома Р450 2B4 определяют по разностным спектрам восстановленной формы цитохрома Р450 2B4 и карбоксикомплекса восстановленной формы цитохрома Р450 2B4, используя коэффициент молярной экстинкции ε₄₅₀ = 91000 М^-1см^-1. Для иммобилизации используют образцы с соотношением рибофлавин : цитохром 8-12:1.

ПРИМЕР 2. Способ получения ферментного электрода, содержащего флавоцитохром RfP450 2B4.

Иммобилизацию флавоцитохрома RfP450scc на родий-графитовых электродах проводят следующим методом: на электроды наносят аликвоты по 7 мкл смеси, состоящей из 1 мкл 2,5% глутарового альдегида, 1 мкл 10% бычьего сывороточного альбумина, 1 мкл 10 мM дилауроилфосфатидилэтаноламина в 10% холате натрия и 4 мкл (0,5 нмоль) флавоцитохрома RfP450 2B4 в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4 (соотношение реагентов : глутаровый альдегид : альбумин : флавоцитохром Р450 : фосфолипид 2,5:10:1:100). Электроды инкубируют 12 часов при +4^oС. Получают ферментный электрод, содержащий 0,5 нмоль флавоцитохрома RfP450 2B4.

ПРИМЕР 3. Испытание электрода.

Обратимость электрохимического восстановления флавоцитохрома, иммобилизованного на электроде, была показана с помощью метода вольтамперометрии (фиг.1). В этих экспериментах в качестве рабочего электрода используют родий-графитовый печатный электрод с иммобилизованным флавоцитохромом RfP450 2B4, в качестве электрода сравнения используют хлорсеребрянный электрод. Цикловольтамперограммы демонстрировали зависимость тока от скорости сканирования от 10 до 100 мВ/сек.

ПРИМЕР 4. Построение калибровочного графика для определения концентрации аминопирина в водном буферном растворе. Измерение зависимости каталитического тока от концентрации аминопирина.

В электрохимическую ячейку объемом 1 мл, содержащую 0,1 М калий-фосфатный водный буфер и в качестве рабочего электрода - ферментный электрод с иммобилизованным флавоцитохромом RfP450 2B4, полученный в примере 2, прибавляли аликвоты аминопирина (в качестве исходного был использован 80 мM аминопирин). Зависимость каталитического тока от концентрации аминопирина представлена на фиг.2.

Наблюдается линейная зависимость тока от концентрации аминопирина в диапазоне 1-10 мM аминопирина, что позволяет определить по калибровочному графику концентрацию аминопирина в анализируемых водных растворах.

ПРИМЕР 5. Определение концентрации аминопирина.

Готовят раствор аминопирина в калий-фосфатном буфере известной концентрации (80 мM). Рабочий электрод, полученный в примере 2, был откалиброван в рабочем электролите, представляющем собой 0,1 М калий-фосфатный буфер, при рабочем напряжении 500 мВ.

В электрохимическую ячейку объемом 1 мл, содержащую стандартный электролит - 0,1 М калий-фосфатный буфер и исследуемый объем водного раствора аминопирина, (например, 950 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера и 50 мкл 80 мM аминопирина) погружают откалиброванный в рабочем электролите ферментный электрод и измеряют изменение тока на рабочем электроде. По полученному в примере 4 калибровочному графику определяют содержание аминопирина на анализируемой пробе путем сравнения регистрируемой величины тока с таковой на калибровочном графике.

В данном примере регистрируемый ток составил 24,2 мкA, соответственно содержание аминопирина в анализируемой пробе составило 4,1 мM.

Результаты определения содержания аминопирина в других анализируемых пробах приведены в таблице 1.

Как следует из таблицы 1, получены стабильные ферментные электроды, содержащие ковалентно связанный с поверхностью электрода химически модифицированный рибофлавином цитохром Р450 2В4.

Чувствительность электрода к аминопирину в буферных водных растворах лежит в пределах 1-10 мM.

Точность определения составляет 1-3%.

Источники информации
1. Sugihara N., Ogoma Y., Abe K., Akaike Т. Immobilization of cytochrome P450 and electrochemical control of its activity. Polymers and Advanced Technologies. 1998, 9, 307-313.

2. Lamb S.B., Lamb D.C., Kelly S.L., Stuckley D.C. Cytochrome P450 immobilisation as a route to bioremediation/biocatalysis. FEBS Letter, 1998, 431, 343-346.

3. Zang Z. , Nassar A.-E., Lu Z., Schenkma J.B., Rusling J.F. Direct electron injection from electrodes to cytochrome P450cam in biomembrane-like films. J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1997, 93, 1769-1774.

4. Shumyantseva V.V., Uvarov V.Yu., Byakova O.E., Archakov A.I. Semisynthetic Flavocytochromes Based on Cytochrome P450 2B4: Reductase and Oxygenase Activities. Arch. Biochem. Biophys., 1999, 354(1), 133-138.

5. Bachmann T.T., Schmid R.D. A disposabla mulyielectrode biosensor for rapid simultaneous detection of the insecticides paraoxon and carbofuran at high recolution. Analytica Chimica Acta, 1999, 401, 95-103.

6. Bachmann T.T., Laca В., Vilatte F., Marty J.-L., Fournier D., Schmid R.D. Improved multianalyte detection of organophosphates and carbamates with dusposable multielectrode biosensors using recombinant mutants of Drosophola acettylcholinesterase and artificial neutral networks. Biosensors and Bioelectronics, 2000, 15, 193-201.

7. Mulchandani P., Mulchandani A., Kaneva I., Chen W. Biosensor for direct determination of organophosphate nerve agents. 1. Potentiometric enzyme electrode. Biosen. and Bioelectron., 1999, 14, 77-85.

8. Kanaeva, I.P., Dedinskii, I.R., Scotselyas, E.D., Krainev, A.G., Guleva, I.V., Sevryukova, I.F., Koen, Ya.M., Kuznetsova, G.P., Bachmanova, G. I., Archakov, A.I., Comparative study of monomeric reconstituted and membrane microsomal monooxygenase systems of rabbit liver. Arch. Biochem. Biophys. 1992, 289, 395-412.

Использование: в области медицины и биохимии. Сущность изобретения: ферментный электрод для определения содержания аминопирина в водном растворе представляет собой родий-графитовый печатный электрод с иммобилизованным на нем химически модифицированным рибофлавином цитохромом Р450 2В4. Также предложен способ получения электрода и способ определения содержания аминопирина в водном растворе с помощью указанного электрода. Техническим результатом изобретения является создание ферментного электрода на основе цитохрома Р450 2В4, позволяющего проводить измерение содержания в водных средах типичных субстратов цитохрома Р450 2В4, в том числе лекарственных препаратов, содержащих третичные аминогруппы, например аминопирина, а также способ получения указанного ферментного электрода и способ определения содержания аминопирина в водном растворе с помощью указанного ферментного электрода. 3 с. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Ферментный электрод для определения содержания аминопирина в водном растворе, представляющий собой родий-графитовый электрод с иммобилизованным на нем химически модифицированным рибофлавином, цитохромом Р450 2В4. 2. Ферментный электрод по п. 1, содержащий 0,5-0,8 нмоль модифицированного рибофлавином цитохрома Р450 2В4. 3. Ферментный электрод по пп. 1 и 2, характеризующийся тем, что модифицированный рибофлавином цитохром Р450 2В4 содержит 10-12 остатков рибофлавина на 1 молекулу цитохрома Р450 2В4 и родий-графитовый электрод является печатным электродом. 4. Способ получения ферментного электрода для определения содержания аминопирина в водном растворе путем нанесения на поверхность родий-графитового электрода смеси активных компонентов, состоящей из растворов глутарового альдегида, бычьего сывороточного альбумина, дилауроилфосфатидилэтаноламина в 9-15% холате натрия и раствора модифицированного рибофлавином цитохрома Р450 2В4 в калий-фосфатном буфере с последующей инкубацией при 2÷8^oС. 5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что смесь активных компонентов содержит 0,5-0,8 нмоль модифицированного рибофлавином цитохрома Р450 2В4. 6. Способ по пп. 4 и 5, характеризующийся тем, что рН смеси активных компонентов составляет 7,2-7,6. 7. Способ по пп. 4-6, характеризующийся тем, что модифицированный рибофлавином цитохром Р450 2В4 содержит 10-12 остатков рибофлавина на 1 молекулу цитохрома Р450 2В4. 8. Способ определения содержания аминопирина в водном растворе, характеризующийся тем, что проводят электролиз при контролируемом напряжении смеси, содержащей анализируемый водный раствор аминопирина и водный буферный раствор, при этом в качестве рабочего электрода используют ферментный электрод по пп. 1-3, регистрируют изменения тока на рабочем ферментном электроде до выхода на плато и определяют содержание аминопирина по предварительно построенному калибровочному графику зависимости тока от содержания аминопирина в стандартном водном растворе аминопирина известной концентрации. 9. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что рабочий ферментный электрод предварительно калибруют в водном буферном растворе. 10. Способ по пп. 8 и 9, характеризующийся тем, что в качестве водного буферного раствора используют водный калий-фосфатный буфер и в качестве электрода сравнения используют хлорсеребряный электрод.